一种黑磷壳聚糖DFO温敏水凝胶的制备方法及应用与流程

本发明涉及水凝胶制备，更具体地说是一种黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶的制备方法及应用。

背景技术：

1、感染是严重烧伤患者中最常见的死亡原因之一，有效地预防伤口感染和促进患者创面愈合率对烧伤感染的治疗至关重要，烧伤创面临床常见的治疗方法是皮肤移植联合抗生素治疗；近年来，抗生素的过度使用导致细菌多药耐药性的出现，这些菌株通常会形成特殊的生物膜，用以保护细菌免受抗菌药物和吞噬作用的侵害，因此，开发多功能生物纳米材料对烧伤感染的综合治疗具有重要意义。

2、目前光治疗，特别是光热疗法（ptt）和光动力疗法（pdt）在预防创面感染和促进创面愈合方面具有广阔的应用前景；此外，由于水凝胶具有良好的生化作用，在伤口敷料领域也显示出诱人的优势；因此集光治疗和水凝胶优点于一体的多功能光响应水凝胶（mprhs）越来越多地应用于生物医学，特别在伤口修复领域。

3、其中二维纳米材料由于具有良好的机械柔韧性、导电性优良、光吸收范围广、表面积体积比大等独特特性，在基础研究和实际应用中都受到广泛关注。作为后石墨烯时代典型的二维纳米材料，黑磷（black phosphorus，bp）在各种纳米材料中占有突出的地位，其每个磷原子通过sp3杂化与周围3个磷原子共价结合形成褶皱蜂窝状结构。主要包括黑磷量子点、黑磷纳米颗粒和黑磷纳米片（black phosphorus nanosheets，bpns）。黑磷纳米片是从黑磷剥离出来的有序二维单晶纳米片，是产生单重态氧的有效的光敏剂，其具有较高的量子产率，约为0.91，因此，黑磷纳米薄片在催化和光动力疗法中具有积极应用。

4、在生物医学领域，蜂窝褶皱状结构可以有效加大药剂、生物分子和显影剂的载药量，而且这种在生理环境中bp易于降解生成无毒的pxoy磷酸盐，相对于其他二维材料而言，bp优异的生物降解性和生物相容性，具有应用于生物医学领域的良好前景。同时，bpns被nir光照后，其吸收的光子能量以热能形式散发，迅速发生光致升温，暴露的bpns能够被周围的氧气和水逐渐降解。

5、bpns独特的带隙结构使其具有出色的光热升温性能，其作为现有抗生素的替代方法，有望应用于细菌的抗感染治疗。bpns的杀菌机制主要是物理作用破坏细胞膜和产生活性氧（reactive oxygen species, ros）。bp的光热效应对细菌的破坏被认为是治疗细菌感染的另一类安全、有效的方法，近红外光能够穿透哺乳动物细胞深处，对正常细胞的伤害很小。bpns的尖锐边缘会对细菌膜造成物理损伤，导致rna泄漏，导致细菌死亡；bp所产生的ros 通过破坏细胞膜、细菌的胞内分子如dna、rna和蛋白质相互作用等原理杀灭细菌病原体。两者均会对细菌造成不可逆转的损伤，这种协同作用的多种机制可以防止细菌进化，避免引发耐药性。同时，bp所释放的微量磷酸根会改变细菌的代谢状态（如增加atp通量），将它们从代谢不活跃的状态中恢复对药物的敏感性。当bpns浓度为100 μg/ml时，其对大肠杆菌的杀菌效果最大可达91.65%，对枯草芽孢杆菌可达99.69%。相比其他光敏剂，bpns所需量更少，产生ros需要光照时间更短。

6、天然医学材料与人工合成材料相比，生物相容性更好，适合细胞的生长、发育及新陈代谢，且材料可降解。壳聚糖（chitosan，cs）作为带正电的天然高分子多糖，来源广泛，具有一定的抗菌活性，生物相容性好，常作为创伤敷料的基质，同时壳聚糖易于化学修饰，可用于药物的修、活化和偶联。而且，其与β-gp（beta-glycerophosphate）结合可形成温敏水凝胶，可以为创面愈合提供理想的微环境。

7、去铁胺(deferoxamine，dfo)可以激活hif-1α促进vegf和sdf-1α的分泌，从而加快血管化。本研究旨在研制一种具有抗菌活性和促进创面愈合功能的复合材料，以壳聚糖/β-gp温敏水凝胶为基底材料，结合bp这一多模态纳米药物二维材料，制备均匀嵌合dfo的复合促愈合抗菌敷料。

技术实现思路

1、本发明提供一种黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶的制备方法及应用，通过以壳聚糖/β-gp温敏水凝胶为基底材料，结合bp材料制备均匀嵌合dfo的复合促愈合抗菌敷料，以解决目前创口修复大量采用抗生素，易增加细菌耐药性等问题。

2、本发明具体的技术方案如下：

3、一种黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶的制备方法，黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶的制备方法过程包括：

4、s1：制备黑磷纳米片（bpns），采用液相剥离制备黑磷纳米片（bpns），通过在有机溶剂剥离出黑磷纳米片（bpns）；

5、s2：壳聚糖（cs）水凝胶制备，将200mg壳聚糖溶解于0.1m冰乙酸溶液，制备出壳聚糖溶液，在均匀搅拌下，将β-gp溶液逐滴加入到制备好的壳聚糖溶液中，得到清澈均匀的液体溶液；

6、s3：dfo（去铁胺）制备，称取规定重量的dfo溶于无菌双蒸水中，完成dfo溶液配置并留作备用；

7、s4：黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶混合，将s1、s2和s3中制备好的黑磷纳米片（bpns）、壳聚糖水凝胶、dfo按规定的质量比进行混合，完成黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶制备。

8、作为本方案的进一步改进，步骤s1中，有机溶剂为n-甲基-2-吡咯烷酮（nmp）。

9、作为本方案的进一步改进，步骤s1中，有机溶剂n-甲基-2-吡咯烷酮剥离黑磷纳米片的步骤如下：

10、s1.1首先将20mg块状黑磷添加到20ml的n-甲基-2-吡咯烷酮饱和naoh溶液中；

11、s1.2在冰浴环境下使用超声机，对黑磷晶体粉末溶液超声10h，得到棕色悬浮液；

12、s1.3采用差速离心法通过高速冷冻离心机两步法离心，先将超声后的分散液在1000rpm下离心20min，去除未完全剥离的层数多的黑磷纳米片；

13、s1.4接着取上清液再继续在15000rpm下离心30min，得到单层黑磷纳米片；

14、s1.5上述两步的离心沉淀物分别用超纯水洗涤3次去除多余溶剂后，最终配置成1mg/ml黑磷纳米片水溶液避光冷藏保存，用于后续实验。

15、作为本方案的进一步改进，步骤s2中，将560mg β-gp溶解于1 ml去离子水中，两者4℃预冷10分钟后，然后逐滴加入壳聚糖溶液中。

16、作为本方案的进一步改进，步骤s2中，壳聚糖与β-gp的体积比为3:1，且β-gp与壳聚糖的混合溶液ph为7.20-7.40。

17、作为本方案的进一步改进，步骤s3中，dfo的重量取656.79ug，并溶于1ml的无菌双蒸水中，配置成1mm的dfo溶液。

18、作为本方案的进一步改进，步骤s4中，黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶由黑磷纳米片、2%(w/v)壳聚糖、56%(w/v) β-gp、dfo组成，黑磷纳米片溶液的浓度为20～75μg/ml，优选为40μg/ml。dfo溶液浓度为1μm～100μm，优选为2μm。

19、一种黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶的应用，所述黑磷壳聚糖dfo温敏水凝胶应用于伤口修复。

20、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

21、1、本发明复合材料在808nm近红外光照射之后具有良好的光热效应，能有效抑制包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多重耐药绿脓杆菌、多重耐药鲍曼不动杆菌在内的细菌生长,与普通抗生素相比，该新型水凝胶不易产生耐药性，而是主要通过物理割伤和光热作用实现抗菌，同时兼顾促愈合，有效降低了对抗生素的使用，降低了抗生素使用对人体带来的危害。