本发明属于药物制剂,具体涉及一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物及其制备方法与应用。
背景技术:
1、糖尿病肾病是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症,也是我国住院患者慢性肾脏病的重要病因。临床研究和动物实验均表明,足细胞损伤和功能障碍是导致糖尿病肾病出现蛋白尿和肾小球硬化的主要原因。临床常用的降糖药物、raas抑制剂,均未能使糖尿病肾病蛋白尿缓解率超过40%。因糖尿病肾病进入终末期肾病的人数仍持续增加。因此,需要探索新的治疗方法以改善糖尿病肾病患者的蛋白尿和足细胞损伤。
2、他克莫司(tacrolimus, tac)是被kdigo指南推荐用于治疗膜性肾病、iga肾病、狼疮性肾炎等免疫相关肾脏病的药物,显著改善了患者足细胞损伤和肾脏预后。临床上,tac治疗激素抵抗性肾病综合征疗效也很显著。这些结果提示,可以利用tac来治疗糖尿病肾病。然而,tac因为有恶化血糖、增加感染的风险,临床尚未用于治疗糖尿病肾病。
3、丝胶蛋白是从蚕茧中提取的天然蛋白质。近年来研究发现,除了具有良好的生物相容性、低免疫原性和水溶性之外,丝胶蛋白还具有显著的降血糖作用,这表明丝胶蛋白是用于糖尿病肾病的潜在递送载体。然而,目前报道的丝胶蛋白偶联物都没有特异性靶向细胞的能力。
4、足细胞膜基底面表达的整合素αvβ3,使足细胞锚定在肾小球基底膜上。多肽精氨酸-亮氨酸-天冬氨酸(rld)是能与整合素αvβ3特异性结合的最短多肽,且研究表明rld结合不会激活rac1信号通路诱导足细胞损伤。human protein altas的数据显示,αvβ3在胰腺、胸腺和淋巴结的蛋白表达水平显著低于肾脏。因此,可以采用rld修饰他克莫司-丝胶蛋白偶联物,实现足细胞靶向给药。
技术实现思路
1、为解决上述问题,本发明公开了一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,以解决他克莫司恶化血糖、增加感染风险的问题,从而实现在临床中使用他克莫司治疗糖尿病肾病。
2、为达到上述目的,本发明的技术方案如下:
3、本发明提供了一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,包括以下步骤:
4、s01他克莫司、琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶溶于第一种溶剂,控温搅拌反应得到他克莫司琥珀酸酐半酯;
5、s02他克莫司琥珀酸酐半酯、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于第二种溶剂,控温搅拌反应得到他克莫司活化酯;
6、s03他克莫司活化酯与丝胶蛋白溶于第三种溶剂,控温反应,得到他克莫司-丝胶蛋白偶联物;
7、s04他克莫司-丝胶蛋白偶联物、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于第四种溶剂,控温搅拌反应,得到活化的他克莫司-丝胶蛋白偶联物;
8、s05活化的他克莫司-丝胶蛋白偶联物与rld反应溶于第五种溶剂,控温反应,透析除杂后冻干,得到淡黄色rld-他克莫司-丝胶蛋白偶联物。
9、s01中,所述的第一种溶剂可选择丙酮、甲醇、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷;他克莫司与第一种溶剂的质量体积比为2~10:1。
10、s02中,所述的第二种溶剂可选择二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、去离子水;他克莫司琥珀酸酐半酯与第二种溶剂的质量体积比为5~15:1。
11、s03中,所述的第三种溶剂可选择二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、去离子水;丝胶蛋白与第三种溶剂的质量体积比为2~10:1。
12、s04中,所述的第四种溶剂可选择二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、去离子水;他克莫司-丝胶蛋白偶联物与第四种溶剂的质量体积比为5~15:1。
13、s05中,所述的第五种溶剂可选择二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、去离子水;rld反应与第五种溶剂的质量体积比为2~10:1。
14、进一步地,步骤s01中,他克莫司与琥珀酸酐的质量比为1:1~5,更优选为1:1.85。
15、进一步地,步骤s01中,还包括以下步骤:他克莫司和琥珀酸酐在溶剂中搅拌至完全溶解后,加入4-二甲氨基吡啶,之后在4~25℃,更优选为10℃、氮气氛中搅拌反应24~96h,更优选为72h,他克莫司与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:1~5,更优选为1:1.5。
16、进一步地,步骤s02中,他克莫司琥珀酸酐半酯、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为2:0.5~4:0.5~4,更优选为2:1:1。
17、进一步地,步骤s02中,他克莫司琥珀酸酐半酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌10min~2h,更优选为30min。后加入n-羟基琥珀酰亚胺,继续搅拌0.5~6h,更优选为1h,得到他克莫司活化酯。
18、进一步地,步骤s03中,步骤s02中的他克莫司琥珀酸酐半酯与丝胶蛋白的质量比为1:0.5~10,更优选为1:1;反应的温度为10~25℃,更优选为20℃,反应的时间为24~96h,更优选48h。
19、进一步地,步骤s04中,他克莫司-丝胶蛋白偶联物、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为2:0.5~4:0.5~4,优选2:1:1。
20、进一步地,步骤s04中,他克莫司-丝胶蛋白偶联物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌10min~2h,优选30min,后加入n-羟基琥珀酰亚胺,继续搅拌0.5~6h,优选1h,得到活化的他克莫司-丝胶蛋白偶联物。
21、进一步地,步骤s05中,步骤s04中的他克莫司-丝胶蛋白偶联物与rld的质量比为1:0.5~3,更优选1:1,反应的温度为10~25℃,优选20℃,反应的时间为24~96h,优选48h。
22、本发明还提供一种如上所述制备方法制备得到的靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物在治疗糖尿病肾病药物中的应用。
23、本发明的有益效果为:
24、本发明中的rld-他克莫司-丝胶蛋白偶联物显著增加了他克莫司溶解度,达115μg/ml;具有更好的血清稳定性,避免了因血液稀释造成的释放。本发明验证了rld-他克莫司-丝胶蛋白偶联物增加了肾小球足细胞摄取他克莫司,减少了胰腺摄取他克莫司;增强了他克莫司治疗糖尿病肾病小鼠蛋白尿和足细胞损伤的疗效,避免了他克莫司恶化糖尿病肾病小鼠血糖。
1.一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.所述第一种溶剂为丙酮、甲醇、乙腈、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的一种或多种;
3.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s01中,他克莫司与琥珀酸酐的质量比为1:1~5。
4.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s01中,还包括以下步骤:他克莫司和琥珀酸酐在溶剂中搅拌至完全溶解后,加入4-二甲氨基吡啶,之后在4~25℃、氮气氛中搅拌反应24~96h,他克莫司与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:1~5。
5.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s02中,他克莫司琥珀酸酐半酯、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为2:0.5~4:0.5~4。
6.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s02中,他克莫司琥珀酸酐半酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌10min~2h后加入n-羟基琥珀酰亚胺,10~25℃继续搅拌0.5~6h得到他克莫司活化酯。
7.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s03中,步骤s02中的他克莫司琥珀酸酐半酯与丝胶蛋白的质量比为1:0.5~10;反应的温度为10~25℃,反应的时间为24~96h。
8.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s04中,他克莫司-丝胶蛋白偶联物、n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的质量比为2:0.5~4:0.5~4。
9.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s04中,他克莫司-丝胶蛋白偶联物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺搅拌10min~2h后加入n-羟基琥珀酰亚胺,10~25℃继续搅拌0.5~6h,得到活化的他克莫司-丝胶蛋白偶联物。
10.根据权利要求1所述的一种靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物的制备方法,其特征在于,步骤s05中,步骤s04中的他克莫司-丝胶蛋白偶联物与多肽精氨酸-亮氨酸-天冬氨酸的质量比为1:0.5~3,反应的温度为10~25℃,反应的时间为24~96h。
11.一种如权利要求1-9任一项所述制备方法制备得到的靶向足细胞递送他克莫司的多肽药物偶联物在治疗糖尿病肾病药物中的应用。