一种肿瘤细胞外ATP响应型纳米组装体及其制法和应用

本发明涉及一种肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体，还涉及上述纳米组装体的制法和应用。

背景技术：

1、铁死亡是一种新型癌症治疗方式，通过铁催化h2o2的芬顿反应产生高毒性活性羟基自由基(·oh)，导致活性氧(ros)积累，进而使谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)失活，破坏抗氧化代谢平衡，提供了一种非细胞凋亡的方法来逆转肿瘤的多药耐药，可以产生轻微的免疫原性，并有效地抑制肿瘤生长。

2、铁死亡联合其他活性氧依赖性治疗如化疗、光动力治疗和放疗表现出显著提高抗肿瘤的治疗效果。其中，放射性药物治疗(rpt)作为放疗的一种，是一种以β-粒子或α-粒子为主的放射性原子靶向递送到生物靶点的新兴治疗方法。现阶段的铁死亡效率通常不高，受限于细胞经铁代谢途径维持相对较低的铁水平，同时通过铁基纳米材料在细胞内传递铁也受到易代谢、效率低下以及肿瘤微环境的限制。此外，相对于依赖外部辐射束的x射线介导放疗，rpt虽然可以将辐射直接传递到癌细胞或癌微环境中，减少对周围组织的损伤，但对于可以特异性递送的放射性核素的载体有一定的要求。因此，需要开发一种能提高铁死亡效率并有效联合放射性药物治疗和免疫治疗的纳米体系用于肿瘤治疗。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体，还提供上述纳米组装体的制法和应用。

2、技术方案：本发明所述的肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体，由硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒和标记放射性核素的免疫抗体通过非共价作用组装形成。

3、其中，所述含硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒与混合有标记放射性核素免疫抗体的牛血清白蛋白按质量比1：0.5～5的比例组装，牛血清白蛋白与标记放射性核素的免疫抗体的质量比为1：0.1～0.5。

4、其中，所述肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体尺寸为100～200nm，所述超小零价铁纳米颗粒的粒径为3～5nm。

5、上述纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)将溴化铵和油酸钠加入至十八烯和油胺的混合溶液中，调节温度进行反应，再加入羰基铁升温反应，冷却后用无水乙醇沉淀纳米颗粒，离心，取纳米颗粒沉淀溶解于正己烷，用无水乙醇沉淀，离心后得到超小尺寸零价铁纳米颗粒；

7、(2)将4-羧基-3-氟苯硼酸、频哪醇、冰醋酸和四氢呋喃制得混合溶液，反应后旋蒸除去溶剂得到化合物1；将化合物1、盐酸多巴胺与2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉溶于无水甲醇中，氮气保护条件下搅拌反应过夜，旋蒸除去溶剂，用有机溶剂复溶，取有机混合溶剂在薄层硅胶板上样并展开，将产物条带刮下并用有机溶剂冲洗，旋蒸除去溶剂，即得到含硼酸基团的胞外atp响应性小分子；

8、(3)取盐酸多巴胺和含硼酸基团的胞外atp响应性小分子溶于n,n-二甲基甲酰胺，加入溶于氯仿溶液的超小尺寸零价铁纳米颗粒，超声水浴升温反应，冷却后离心，取沉淀物洗涤后溶于水，取溶液加甲基硼酸，调节ph，震荡反应后，离心得到硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒水溶液usinps；

9、(4)取氯甘脲加入na131i溶液和anti-pd-l1，涡旋震荡，离心，得到标记放射性核素的免疫抗体131i-apd-l1；

10、(5)取硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒、牛血清白蛋白和标记放射性核素的免疫抗体混合，室温涡旋震荡过夜，离心洗涤，沉淀即为肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体。

11、其中，步骤(1)中，所述溴化铵、油酸钠、油胺和十八烯的质量比为(1：5～10：150～250：400～500)；羰基铁与混合溶液的质量比为(1：15～20)。

12、其中，步骤(1)具体为：将溴化铵和油酸钠加入至十八烯和油胺的混合溶液中，惰性气体保护下升温至100～140℃，除去体系中的水蒸气和氧气，并保温40～80min在惰性气体保护下继续升温至200～240℃并保温20～40min，随后降温至100～140℃，注入羰基铁。然后以3～5℃/min的速度将体系升温至230～250℃，并保持20～40min；随后，体系自然冷却到室温后；用无水乙醇沉淀纳米颗粒，7000～9000rpm离心8～10分钟，弃去上清，得到纳米颗粒沉淀，将所得沉淀溶解于正己烷，再用无水乙醇沉淀，7000～9000rpm离心8～10分钟，得到超小尺寸零价铁纳米颗粒(usinps)。

13、其中，步骤(2)中，4-羧基-3-氟苯硼酸、频哪醇、冰醋酸和四氢呋喃的质量比为1：0.1～1：20～30：40～50；化合物1、盐酸多巴胺、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、无水甲醇的质量比为1：0.1～1：0.1～1：20～40。

14、其中，步骤(2)具体为，将4-羧基-3-氟苯硼酸和频哪醇溶于四氢呋喃(thf)中，并向混合液中加入冰醋酸，室温反应过夜。旋蒸除去溶剂，得到化合物1；将化合物1、盐酸多巴胺与2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(eedq)溶于无水甲醇(meoh)中，氮气保护条件下搅拌反应过夜。旋蒸除去溶剂，用有机混合溶剂(二氯甲烷：甲醇＝7～10:1)复溶并在薄层硅胶板上样，用展开剂(二氯甲烷：甲醇＝7～10:1)展开，将产物条带刮下，用有机溶剂(二氯甲烷：甲醇＝7～10:1)冲洗，旋蒸将溶剂除去，即得到含硼酸基团的胞外atp响应性小分子。

15、其中，步骤(3)中，盐酸多巴胺、含硼酸基团的胞外atp响应性小分子、超小尺寸零价铁纳米颗粒、氯仿、n,n-二甲基甲酰胺的质量比为1：0.5～5：0.5～5：50～200：200～400；所述调节ph为5～6。

16、其中，步骤(3)具体为：取盐酸多巴胺和含硼酸基团的胞外atp响应性小分子，溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，加入溶于氯仿溶液的超小零价铁纳米颗粒，超声20～60min，水浴升温至40～60℃保温4～6h，然后冷却至室温，离心(4000～6000rpm，4～6min)，弃去上清，沉淀用dmf反复洗3次后溶于去离子水并加入11mg甲基硼酸，加入盐酸调节溶液ph，震荡反应2～4h后得到脱保护的含硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒水溶液，离心(4000～6000rpm，5min)，得到硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒水溶液。

17、其中，步骤(4)中，氯甘脲、anti-pd-l1的质量比为1：0.5～5，na131i溶液的放射性活度为0.1～1.0mci。

18、其中，步骤(4)具体为：取氯甘脲溶于二氯甲烷中，吹风机吹干，使氯甘脲均匀附着于ep管壁上，加入na131i溶液和anti-pd-l1，室温涡旋30～60min，利用10kda超滤离心管反复离心3次，除去未标记的na131i，得到131i标记的anti-pd-l1。

19、其中，步骤(5)中，硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒、牛血清白蛋白和标记放射性核素的免疫抗体的的质量比为1：0.5～5：0.1～0.5。

20、其中，步骤(5)具体为：取硼酸基团分子修饰的超小零价铁纳米颗粒(usinps)与牛血清白蛋白(bsa)(固体纯蛋白，纯度97％)以及131i-apd-l1混合，室温涡旋10～30分钟后震荡过夜，离心(6000～8000rpm，4～6min)，去离子水清洗两次，弃去上清，沉淀即为肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体usinas(131i-apd-l1)。

21、上述肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体在制备治疗肿瘤的药物。

22、发明原理：本发明的肿瘤细胞外atp响应型纳米组装体采用表面修饰有硼酸基团的超小尺寸零价铁和标记了放射性核素的免疫抗体，通过非共价作用形成尺寸合适的纳米组装体；该纳米组装体可以通过epr效应靶向肿瘤部位，同时也可以通过anti-pd-l1主动靶向肿瘤细胞，纳米组装体在正常组织部位稳定存在，在到达肿瘤部位后，在肿瘤细胞外atp的条件下解体，释放出131i-apd-l1和usinps，释放出的usinps可深入肿瘤内部，通过恢复催化活性有效促进铁死亡，同时131i-apd-l1可与肿瘤细胞表面的pd-l1受体结合，用于131i介导的rpt以及免疫检查点阻断治疗。131i介导的rpt可以通过抑制slc7a11的表达来抵抗铁死亡防御系统(slc7a11-gsh-gpx4)，并通过促进ros的产生进一步增强usinps诱导的铁死亡。相应地，usinps通过诱导铁死亡，下调gpx4水平以降低辐射抗性，从而提高rpt效率。131i介导的rpt和usinps诱导的铁死亡均可以促进免疫原性细胞死亡(icd)，并与apd-l1协同刺激强烈的免疫反应。最终，usinas(131i-pd-l1)可以实现增强rpt、铁死亡和免疫治疗协同抗肿瘤作用。

23、因此，本发明的纳米组装体一方面实现了放射性核素和免疫抗体的靶向递送，避免治疗过程中对正常组织的毒副作用，提高了肿瘤靶向治疗效率；另一方面，纳米组装体胞外解体后，超小尺寸零价铁可诱导细胞铁死亡并增敏放射性核素治疗，放射性核素可以进一步提高铁死亡的效率，两者通过诱导免疫原性细胞死亡促进了免疫治疗；同时，胞外递送的免疫抗体也可以起到协同治疗肿瘤的作用，实现了免疫抗体和放射性核素的特异性递送，并且最大程度上降低该治疗过程中对正常组织的毒副作用，最终实现了铁死亡，达到放射性核素治疗和免疫治疗协同治疗肿瘤的效果。

24、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)具备肿瘤细胞外atp响应性，并且可以通过epr效应实现了放射性核素和免疫抗体的靶向递送，避免治疗过程中对正常组织的毒副作用；(2)同时诱导了细胞铁死亡和介导放射性核素治疗以及免疫治疗，显示出良好的肿瘤治疗效果；(2)标记放射性核素实现诊疗一体化，具有临床转化的潜力。