专利名称：疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体探针以及这样一些探针在检测及纯化若干防护和诊断抗原方法中的应用、它们的制备及在形成疫苗组合物中的用途。
现有技术中，在发展控制动物(包括家畜)的寄生物，细菌及其它感染的疫苗方面已投入了很大的努力。但是在过去的五年中，没有取得多少进步，尽管在真核与原核生物体中产生大量外来产物的关联技术发展很快。例如在动物的主要病原感染中鉴别出防护性抗原仍然是产生疫苗的主要障碍。
其主要原因之一是例如寄生物的巨大复杂性，它们可能具有哺乳动物的高达10%的遗传信息，因而能够在它们生命周期的不同阶段产生一大批的产物，其中只有少数几个可能对于产生有效的疫苗是重要的，在大多数情况下，研究人员面临的是数以百计的可能的抗原。使人困惑的中心问题是哪些是可诱发宿主防护性免疫应答的寄生物抗原。对于以相当大的困难、昂贵的代价及长的时间、依靠期望与灵感选择出的寄生物抗原进行克隆，从理论上讲有可能发展出一种有效的疫苗。然而在大多数情况下，这种做法是失败的。
在现有技术的寄生物感染中，重点一直放在用全血清抗体作为“探针”对粗寄生物抗原混合物，寄生物CDNA、或基因组库进行的筛选上。血清中含有大量抗其它病原体和抗原的抗体。此外，大多数抗寄生物的抗体是对准非防护性抗原的。
改进用于筛选粗的寄生物抗原混合物或寄生物CDNA库的抗体探针一直没有取得什么成绩，尽管这对于检测抗原和在它们随后的分子克隆过程中监测这些抗原的防护性抗原决定部位是极端重要的。
例如，捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)是一种寄生于绵羊皱胃(第四胃)中的寄生虫。晚期幼虫和成熟寄生虫以全血为食。由于这是一种潜在的致命疾病，这种寄生虫对澳大利亚绵羊产业造成巨大的经济损失，并在海外造成巨大损失。尽管造成了这些损失，但是在现有技术中一直没有研制出一种抗这种寄生虫的成功疫苗。
干酪性淋巴结炎(缩写CLA，也称为干酪腺)是一种由假结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)(syn.绵羊棒状杆菌C.ovis)引起的绵羊和山羊的慢性感染。现有技术中已知一种复杂的无细胞CLA疫苗(GLANVAC，CommonwealthSerumlaboratories)，它广泛地被单独或作为一种6组分的抗菌疫苗的一部分(6合1)被服用。由这种疫苗取得的保护作用归功于失活的毒素(即类毒素)成分。当这种毒素在还原条件下12.5%SDS-PDGE时，其相对分子量约为31千道尔顿。虽然这种现有的疫苗确实可以产生一些防护作用，但这种疫苗是复杂而昂贵的，所以大量感染仍会发生。
肝片吸虫(Fasciolahepatica)(肝吸虫)是一种在绵羊和牛的肝及胆管中出现的寄生虫感染。肝吸虫会对绵羊及牛产业引起慢性和急性损失。在现有技术中已知有许多种预防及治疗方法，但是已证明它们的效果是有限的，所以肝吸虫仍是一种慢性兽医疾病。
绦虫(Taeniahydatigena)也是一种在绵羊肝中出现的寄生虫感染。它通过被感染的狗从一只动物转到另一只动物，并且会对绵羊产业造成一些损失。现有技术中一直没有研制出一种抗此寄生虫的成功疫苗。
因此，本发明的一个目的是克服或至少减轻现有技术中的一个或多个难点。
因此，本发明的第一个方面是提供一种产生至少一种抗病原体抗体的方法，该方法包括由病原体或病原体提取物感染或激发的动物提供一个生物的样品;
从该生物样品中分离细胞;
在合适的培养基中对细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体。
可以取生物样品的动物可以是任何合适的类型。取生物样品的动物可以是免疫动物。可以在用病原体感染激发该免疫动物后短时间内取得生物样品。这种动物可以是包括人在内的哺乳动物。这种哺乳动物可以是驯养的动物，例如绵羊或牛。
在下面的描述中，将涉及寄生虫及细菌免疫原的鉴定方法，该方法对于绵羊和牛的疫病特别是对绦虫(绦虫cestode)，捻转血矛虫(namatode)，肝片吸虫(trematode)和细菌病原体假结棒状杆菌的寄生感染是重要的。应该理解，这些免疫原和病原体仅仅是用于说明的，而这种方法通常可逆用于包括人在内的动物。具体地说这里描述的这种方法可用于检测自身免疫疾病中的免疫原。
动物生物样品可以是任何合适的类型。生物样品可采源于动物组织、器官、血液、淋巴液或淋巴结。生物样品可以取自被感染动物的任何部分，但最好取自被感染的部位或在某些疾病中可能形成的病灶区域或例如在淋巴结中接近于被感染部位或病灶的区域。
但是根据本发明的这一方面，血清/血浆样品最好不用作生物样品。已发现在血清/血浆样品中的大多数抗体与病原体的防护或特异性诊断是无关的或是与该病原体无关。此外，血清/血浆的其它成分也会干扰病原体成分与它们的抗体之间的特异反应。
与此相对照，本发明所描述的探针在病原体特异抗体中是高浓度的，并且可以被选择只限于对防护免疫性特别重要的病原体阶段。
生物样品最好在显现疾病的预定时间上从动物上取得。一般，对于寄生虫感染来说，它发现应当在用病原体感染后或用病原体得到的物质注射后的短时间内取得生物样品。据推测，寄生虫只是在进入对象后的一个短时间内易受损坏，在这时间之后它改变了结构，对免疫攻击不再易受损害，并且可能不再诱发防护性抗体。
从生物样品中分离出的细胞可以包括B细胞。可以相似地在包括抗体分泌和/或抗体产生期的已知时间上分离出这种细胞。或者，这种细胞也可以包括在某些疾病晚期可能产生的记忆细胞。
于是，最好是在活体刺激后的一个短时间内取得细胞，最好是此之后约2到13天内，在例如相应的寄生虫阶段里，从而引起在体内诱导产生抗体形成细胞，这种细胞在体外培养后将会在培养基中分泌出特异抗体。如果没有先前的对静止淋巴细胞的体外刺激，在培养基中就不会有或很少有抗体分泌。
通过向培养基中加入辅助因子可以增强由最新的活化的B细胞在培养基中抗体的体外分泌。辅助因子可以是单独或组合使用的胞质分裂素(cytokines)，包括白细胞介素1，2，3，4，5，6，7和8，克隆刺激因子，干扰素和其它任何对特异B细胞分泌有增强作用的因子。
根据本发明的这一方面，该产生抗体的方法还可以包括一个活化所分离的细胞的步骤，从而增殖和分泌和/或释放抗体。
该细胞活化步骤可以包括向培养基中加入细胞活化剂。细胞活化剂可以是从寄生虫衍生的，或者可以选自分裂素及由白细胞产生的辅助因子或它们的人工合成等同物或它们的组合物。
分裂素可以选自从商陆植物(phytolaccaamericana)获得的产品，也被称作为商陆植物分裂素(PWM)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚腺尿苷酸[聚(A-u)]、纯化的蛋白质衍生物(PPD)，聚肌苷酸胞苷酸(聚(I-C))、脂多糖(LPS)、葡萄球菌生物体或其产物，链球菌溶血素O试剂(SLO)，葡萄球菌噬菌体溶解产物(SPL)、非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)、诺卡菌属水溶性分裂素(NWEM)，植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)和葡聚糖-硫酸盐及它们的混合物。细胞增殖剂可以是诸如固相抗免疫球蛋白这样的任何间接或直接导致B细胞增殖和/或抗体分泌的试剂。辅助因子可以是胞质分裂素，包括白细胞介素1，2，3，4，5，6，7和8，克隆刺激因子、干扰素和任何其它单独地或与其它因子和试剂组合加入时能显示增强特异B细胞的增殖和/或抗体分泌作用的辅助因子。这决不是分裂素和细胞活化剂、包括辅助因子的一个穷尽的列表。
可以在有或没有前面的分离细胞亚群步骤下进行该细胞的体外培养。可通过从培养基中收集上清液收集抗体。这种上清液中含有体外培养过程中由这些细胞分泌的或从B细胞中人为释放的抗体，例如通过B细胞溶解。令人意外地发现含抗体的上清液可直接用于检测病原体的抗原。
因此，本发明的另一个方面是提供一种制备与疾病原体相关的抗原的方法，该方法包括提供一个疾病病原体样品;和通过一种方法产生含至少一种疾病病原抗体的抗体探针，该方法包括从一个被病原体或病原体提取物感染或激发的动物中提供一个生物样品;
从该生物样品中分离细胞;
在合适的培养基中体外培养细胞;以及，收集所述细胞产生的抗体，用该抗体探针探测病原体样品以检测至少一种抗原;以及分离所检测的抗原。
疾病病原体样品可以是任何合适的类型。
疾病抗原体可以从任何感染剂，包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体、真菌、原生动物，蠕虫(吸虫，线虫，绦虫)和寄生节肢动物(例如蜱、螨、丽蝇)获得或是一种自身抗原或肿瘤抗原。
疾病病原体最好是一种寄生物，寄生物提取物或寄生物切片。疾病病原体可以选自捻转血矛线虫-一种绵羊肠道寄生虫，肝片吸虫(肝吸虫)-一种在绵羊和牛的肝及胆管中出现的寄生虫感染，或绦虫-一种也是在绵羊肝中出现的寄生感染。其它寄生虫包括铜绿蝇(Luciliacuprina)、毛原线虫属(Trichostrongylusspp)，牛蜱属(Boophilusspp)胃线虫属(Ostertagiaspp)血吸虫(Schistosomespp)、绦虫属(Taeniaspp)和棘球绦虫属(Echinococcusspp)。但是本发明并不仅仅局限于此，下面的描述仅仅是通过参照寄生虫来说明。
在另一个实施例中，病原体样品可取自细菌。例如可以使用假结核棒状杆菌。
在一个优选的实施例中，提供一种制备与疾病病原体有关的抗原的方法，该方法包括提供一种疾病病原体的样品，它取自被认为是处于对攻击最敏感的发展阶段的疾病病原体，以及通过一种方法产生一种包含至少一个疾病病原体的抗体的探针，该方法包括提供一个在免疫动物被病原体或病原体提取物激发后短时间内取得的免疫动物的生物样品;
从生物样品中分离出细胞;
在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集由所述细胞产生的抗体。
可以在被认为是处于对攻击最敏感的发展阶段取得疾病病原体样品，例如对于寄生性绦虫感染，最好从六钩虫幼阶段取样。已发现在寄生感染的大钩蚴阶段存在的抗体在例如后期绦虫阶段是不存在的。对于寄生蠕虫感染，适合于幼虫期，最好是晚幼虫期取样。对于寄生吸虫感染适合于在幼吸虫期取样。
疾病病原体样品可与标准缓冲溶液混合，并放置于标准支承物如SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，以分离其中所含的蛋白质。分离出的蛋白质可被转移到硝化纤维素、尼龙或纸上。
用适当的抗体进行探测可进一步包括对所产生的产物进行检测分析。检测分析可包括Western印迹技术。检测分析可以是免疫沉淀测定法、放射免疫分析法、酶交联免疫分析法或免疫荧光分析法。
按上述方法产生的至少一种抗体可以简单地以从培养基中吸集的上清液的形式被使用。也可以分离和纯化出抗体。
可以使用任何适合的分析技术来检测按上述方法探测出的抗原。
在本发明另一个优选的实施例中，培养基中所含的抗体可用于抗原的亲合纯化、最好是免疫亲合纯化。
因此在一优选的实施例中，提供一种纯化抗原的方法，该方法包括。
提供一个粗抗原混合物;
一个固定于合适的支持物上的抗疾病病原体的抗体，产生这种抗体的方法包括从被病原体或病原体提取物感染或激发的动物提供一个生物样品;
从生物样品中分离细胞;
在合适的培养基中进行细胞体外培养;
以及收集所述细胞产生的抗体;
利用这种固定化抗体对粗抗原混合物进行亲合色谱;以及分离所形成的纯化抗原。
通过常规方法可以由培养物上清液探针获得抗体。例如可以利用通常用于纯化血清或血浆免疫球蛋白的方法，例如用硫酸铵沉淀，用辛酸分馏、离子交换色谱或由固定化蛋白G或蛋白A结合和洗脱。如此获得的抗体然后可以与合适的支持物偶合，例如CNBr-活化琼脂糖4B(Pharmacia)亲合凝胶(Bio-RAD)或其它能结合蛋白的亲合色谱支持物。
然后将固定化抗体进行分馏，并通过亲合色谱法纯化复杂寄生物中的特异抗原。当抗原与固定化抗体结合后，可以用例如含1.5MNacl的缓冲液将非结合的大分子物质从固体支持物上洗去。然后用例如低或高的PH的缓冲液或含离液序列高的离子的缓冲液如0.5-3.0M硫氰酸钠可以将抗原从亲合色谱柱上洗脱。
应用抗体探针进行亲合色谱能够从复杂的粗提取混合物中迅速分离足够量的特异性抗原，进行生化特性，氨基酸顺序和动物接种疫苗以进行有限的防护作用研究。应用亲合色谱获得抗原避免了使用常规生化技术来纯化对其资料不知道或知道很少的抗原时经常遇到的困难，它也避免了由于“分析”亲合色谱而出现的多克隆或单克隆抗体的需要。但是大规模制备可能需要制备多克隆或单克隆抗体。
分离或探测出的抗原可用于制备单克隆抗体。单克隆抗体构成对上面讨论的疾病被动治疗的基础。鉴定出了抗原，分子生物或化学技术，例如克隆技术可用于生产无限量的这种抗原，或者另一种方法是利用与所识别抗原的不同片段相对应的合成肽作为产生疫苗的手段。
因此本发明的一个优选实施例提供了一个制备抗疾病病原体的合成抗原多肽的方法，该方法包括提供一个从疾病病原体样品获得的CDNA库或是基因组库;以及一个从由如上所述抗体探针组成的组中选出的抗体探针;
一个由它得到的单克隆抗体或其衍生物;
由CDNA库或基因组库产生的合成多肽;
用该抗体探针探测该合成多肽;以及分离由此所检测的合成抗原多肽。
可以使用CDNA库或基因组库。可以将CDNA或基因组库装配于合适的表达载体上，该载体能够在原核宿主(例如细菌)或真核宿主(例如哺乳动物细胞)中的转录及随后表达DNA克隆。探针最好选自于(ⅰ)以上述方法识别和纯化的抗原的氨基酸序列为基础的合成寡核苷探针，(ⅱ)从上述方法产生的培养基中获得的抗体，(ⅲ)按上述方法产生的抗所识别和纯化抗原的单克隆或多克隆抗体。
(ⅳ)对抗原具有特异性的重组体或合成单克隆抗体或多肽，例如由Ward等人在1989年《自然》杂志241期第544-546页所描述的。
因此本发明的另一个实施例提供一种制备抗疾病病原体的防护性抗原的方法，该方法包括提供一个疾病病原体样品;以及一种含至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其制备方法包括提供一个被病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;
从生物样品中分离细胞;
在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体。
下面讨论该防护性抗原可以起诊断抗原的作用。
因此本发明一个优选的实施例提供了一种抗绦虫感染的防护性抗原，如下文中所述从分子量约为25和34千道尔顿抗原中造出。由于已证明在不同绦虫间具有交叉防护作用，所以在其它绦虫种例如牛肉绦虫(T，saginata)、羊绦虫(T，ovis)、猪肉绦虫(T，solium)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)中也可能检测出相似的抗原。
在本发明另一个优选的实施例中，如下文所述，提供了一种抗捻转血矛线虫感染的分子量约为67至75千道尔顿的防护性抗原。
在本发明的另一个进一步优选实施例中，如下文所述，提供了一种抗肝片吸虫感染的分子量约为120至125千道尔顿的防护性抗原。
本发明还有一个优选的实施例是如下文所述，提供了一种抗假结核棒状杆菌感染的分子量约为38至40千道尔顿的防护性抗原。该抗原是一种蛋白抗原。
因此，本发明的另一个方面是提供一种产生抗疾病病原体的单克隆抗体的方法，该方法包括提供一种能产生抗所述抗原的B细胞，如上述它是从用一种抗疾病病原体的防护性抗原免疫的动物中获得的;以及一种骨髓瘤细胞;
将B细胞与骨髓细胞融合;
繁殖由此形成的杂交体(hybridoma);以及收集所述杂交体产生抗体。
本发明再一个方面是提供一种预防动物疾病的方法，该方法包括给动物施用有效量的至少一种按上述方法制备的防护性抗原。优选的防护性抗原是一种抗疾病病原体的抗体，疾病病原体是选自本文所讲过的绦虫，捻转血矛线虫，肝片吸虫或假结核棒状杆菌。
本发吸再一个方面是提供一种治疗动物疾病的方法，该方法包括给动物施用治疗有效量的一种抗上述方法产生的防护性抗原的单克隆抗体。
如下文所述，本发明进一步提供一种疫苗组合物，它包括一种预防有效量的至少一种抗疾病病原体的防护性抗原。疾病病原体选自绦虫、捻转血矛线虫，肝片吸虫或假结核棒状杆菌。
本发明进一步提供一种疫苗或兽药组合物，它包括一治疗有效量的至少一种按上述方法产生的单克隆抗体。
本发明的疫苗或兽药组合物可以口服或非肠道用药(例如肌内注射、皮下注射或静脉内注射)。所需量随活性成分的抗原性改变，并且只需要是以引起现有疫苗典型的免疫应答的量。
通过反应活性实验很容易确定所需的量。疫苗或兽药组合物的典型初始剂量约为0.001-1mg活性成分/kg体重。如果需要可以增加剂量率或使用多次给药以提供所需的防护水平。
本发明的疫苗或兽药组合物可以进一步包括一种兽医可接受的载体、稀释剂或赋形剂。最好是将活性成分悬浮于或溶于载体中。载体可以是任何对动物无毒的并与活性成分相容的固体或溶剂。适合的载体包括液体载体，如生理盐水和具它具有或接近生理浓度的无毒盐，以及固体载体，例如滑石粉或蔗糖。如果需要可以加入佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂，或免疫调节剂如胞质分裂素(cytokines)以提高抗原的抗原性。当通过broncial管用药时，疫苗最好以气溶胶的形式存在。
本发明还有一个方面是提供一种诊断药盒，其中包括一种按照上面所述方法识别与纯化的抗疾病病原体的诊断抗原。
该诊断药盒可用于检测动物感染，包括绦虫、捻转血矛线虫、肝片吸虫及假结核棒状杆菌感染。
通过下面的例子将本发明进行更充分的描述。但是应该理解，下面的描述只是对本发明的说明，而不应当以任何方式看成是对上述发明的一般性的限制。
在图中
图1A-捻转血矛线虫12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹显示了由激发免疫绵羊的培养物的上清液识别的L3和L4制剂中的抗原(箭号)。预染色分子量基准(BIORAD)被注明。
图1B-捻转血矛线虫7.5-15%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶Western印迹当显示了由激发免疫绵羊的培养物上清液识别的L4制剂中的抗原(箭号)。预染色分子量基准(Bio-Rad)被注明。
图2-捻转发血矛线虫非还原条件下在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的亲合纯化蛋白的银染色凝胶。通道1中是亲合纯化蛋白，并给出了分子量基准(pharmacia)(mW×103)。抗体活性范围标在括号内。
图3-捻转血矛线虫用经激发免疫动物的培养物上清液探测后的亲合分离抗原的Western印迹(通道A)。预染色分子量标记如图1。
图4-捻转血矛线虫用蛋白酶K(通道A)、胰蛋白酶(通道B)、糖肽酶F(通道C)和对照物(无酶)(通道D)培养后的亲合分离抗原的Western印迹。分子量(phavmacia)(mW×103)被注明。
图5-捻转血矛线虫从琼脂糖IEF凝胶两性电解质(范围3-5)IEF毛细管转移至硝化纤维素，用免疫动物培养物上清液进行探测。采用IEF基准(Bio-Rad)的PH范围被注明。
图6-肝片吸虫7.5-15%SDS-PAGE凝胶的Western印迹。
MW＝如图1的预染色分子量标志(BIORAD)。
通道1和4-NEJ抗原制剂。
通道2和5-成熟吸虫抗原制剂。
通道3和6-12天龄的吸虫抗原制剂。
通道1、2和3用被感染的牛的HLN细胞的培养物上清液进行探测。
通道4，5和6用被abreviated或慢性初级感染激发10天的绵羊的HLN培养物上清液混合物进行探测。
括号＝所要求的抗原。
图7-肝片吸虫(A)用硝酸银染色的7.5-15%SDS-PAGE凝胶。
通道1-还原样品缓冲液中高分子量标记(BIORAD)。
通道2-预染色分子量标记(BIORAD)。
通道3-非还原样品缓冲液中新脱囊蚴期(NEJ)的抗原制剂。
括号-所要求的抗原的位置。
(B)用硝酸银染色的10%SDS-PAGE凝胶。
通道1非还原缓冲液中正常鼠血清。
通道2和3非还原样品缓冲液中正丁醇提取抗原的制剂。在100000g旋转50分钟后的沉淀小片(2)和上清液(3)。
通道4和5NEJ声处理得到的上清液在100000g旋转50分钟后的沉淀小片(4)和上清液(5)。
括号＝所要求的抗原。
图8-肝片吸虫用硝酸银染色的10%SDS凝胶。
声处理NEJ抗原制剂亲合纯化后的结合(通道2)与非结合(通道3)部分。
括号＝所要求抗原的位置。
通道1＝如图1的预染色分子量标记(BIORAD)。
图9-绦虫在非还原样品缓冲液中，用从激发免疫(+)或非激发(-)绵羊分离的肝淋细胞的培养物上清液探测六钩蚴抗原的10%SDS-PAGE凝胶Western印迹。
图10-绦虫用图9中的阳性培养物上清液进行稀释1/2和1/4的六钩蚴抗原(O)的Western印迹探测以及囊壁后期绦虫抗原(B)制剂和头节后期绦虫抗原(S)制剂的Western印迹探测。10%SDS-PAGE凝胶。
箭号＝所要求的抗原。
在还原缓冲液中加入Sigma分子量标记。
图11-绦虫用感染后同时从同样的绵羊上取得的阳性血清(-)或阳性血清(+)作为阳性培养物上清液来进行六钩蚴抗原的Western印迹探测。12%SDS-PAGE凝胶。血清稀释度1/20。
图12-绦虫用阴性(1)或阳性(2)血清或从新近感染动物的肝(3)、肝淋巴结(4)或肩胛骨前淋巴结(5)分离出的白细胞培养物上清液探测六钩蚴抗原的Western印迹。10%SDS-PAGE凝胶。
图13-假结核棒状杆菌硝化纤维素上12.5%SDS-PAGEWestern印迹法-样品溶于还原缓冲液中。
A、用氮黑染色。
通道1、分子量基准。
通道2、WA1030分离细胞提取物。
B、用由假结核棒状杆菌感染的绵羊获得的稀释100倍的血清探测WA1030分离细胞提取物。
通道1、就在感染之前取的血清。
通道2、感染后2天的。
通道3、感染后4天的。
通道4、感染后7天的。
通道5、感染后11天的。
通道6、感染后14天的。
箭号＝所要求的蛋白抗原。
图14-假结核棒状杆菌假结核棒状杆菌抗原的等电聚焦，抗原的PH在6.8-6.9。
例1捻转血矛线虫捻转血矛线虫是一种寄生于绵羊abonasum(第四胃)中的肠道寄生虫。晚期蚴及成熟期寄生虫以全血为食。这种寄生虫对澳大得亚的绵羊产业造成巨大的经济损失，并在海外造成巨大损失。它是一种潜在的致命疾病。尽管造成这些损失，但是在现有技术中尚未发展出一种成功的抗此寄生虫的疫苗。
寄生虫与实验动物从通过实验方法用寄生虫感染的绵羊粪便培养物中收集捻转血矛线虫第三期蚴(L3)。通过用捻转血矛线虫的蚴多次感染绵羊获得免疫动物，然后监测粪便中卵的排出量。在激发剂量在粪便中不产生卵时可称动物被免疫了。一旦免疫，该绵羊将在用50000-200000L3幼虫激发前至少要等四星期，然后在激发后的5天将其杀死。
培养物上清液的制备将泄放到感染区域皱胃的淋巴结取出，按照下面对绦虫的描述方法制备细胞悬浮液。在培养瓶(Miles)中放入10-50ml的大量培养物，其浓度为2-4×106细胞/ml培养基。一些初步的实验确定，在培养物上清液中的大多数抗体是由存在于体内被刺激的淋巴结中的抗体分泌细胞产生的，并且用商陆植物分裂素(PWM)刺激时抗体不再增加。因此从培养物中除去PWM，在5%CO2气氛下，在37℃细胞培育5天后收集培养物上清液并在使用前贮存于-20℃。通过培养物上清液进行抗原的时期特异性识别。
将捻转血矛线虫三期蚴于37℃，在0.05%次氯酸钠中放置10分钟脱鞘以除去二期鞘。然后将此蚴反复洗涤并在PH7.4的磷酸盐缓冲生理水(PBS)中以3000g离心10分钟。洗涤六次后，将其转移到含200μ/ml青霉素和0.2μg/ml链霉素的500ml PH6.8的DME培养基中，在含20%CO2的空气中、在39℃培养5天。然后于20℃，以3000离心15分钟。除去L3、体外转化的L4和成熟的寄生虫，并用特氟隆研棒和磨砂玻璃管在4℃、在有0.1%Empigen两性离子洗涤剂(Calbiochem)的PBS溶液及5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下，将其机械匀化20分钟。立即将匀化的蚴分成等分试样并在-70℃贮存。将冷冻的等分试样熔化并与SDS非还原样品缓冲液按1∶1混合，煮沸5分钟后在5000g下离心2分钟，按照Laemmli(1970)的方法通过12.5%SDS-聚丙烯酰胺微凝胶(Bio-Rad)。通过电泳将此凝硝胶转移至硝化纤维素上(Kerlero de Rosbo等人，1984)并用血清或用激发免疫或非激发免疫绵羊的皱胃淋巴结细胞培养物上清液进行探测。用0.5%Tween 20的PBS溶液将Western印迹阻断，并且在0.05%Tween 20的PBS溶液进行全部洗涤。这种辅助抗体是一种与辣根过氧化物酶(Dako)偶合、然后可用3，3-二氨基联苯胺(Sigma)和过氧化氢显示的兔子抗绵羊免疫球蛋白。
当用激发免疫绵羊的培养物上清液进行探测时，所检测的体外培养的捻转血矛线虫四期蚴(L4)和三期(L3)脱鞘蚴的蚴抗原约在67-75千道尔顿(kd)之间(图1)。对成熟血矛线虫属制剂未鉴别到具有上述分子量的抗原(数据未表明)。当使用非激发免疫绵羊的上清液探测印迹时没有反应(未显示)，这表明激发免疫绵羊的培养物上清液中产生的全部抗体都是在体内激发5天时诱发的。相似地用取自同一时间同样一些动物的血清与全部3个寄生期的几条色带反应进行Western印迹探测没有突出67-75抗原(无显示)。与培养物上清液相反，在激发免疫或非激发免疫绵羊的血清之间没有发现任何区别。
用于亲合纯化的L4抗原的制备通过使用polytron组织匀浆器在有0.05%Empigen的0.1M Tris PH8.0溶液和5mM PMSF存在下，在冰上均浆化体外转化的L4蚴30秒，制备亲合纯化用粗抗原。经polytron处理后，加入SDS到2%的最终浓度，并将样品在水浴中煮沸3分钟，然后在4℃以35000转/分钟的速度离心30分钟。离心后，按照Henderson、Oroszlan和Konigsberg描述的“方法A”(1979)通过沉淀蛋白质将SDS从上清液中除去。除去SDS后，向蛋白质沉淀物中加入7M盐酸胍(IBI)，并在冰上放置5小时。加入等体积的25%甘油的蒸馏水溶液，将全部样品在PBS和0.05%PH7.4的Empigen中透析。然后将此样品加到亲合色谱柱上。抗原的亲合纯化构成一个亲合色谱柱以便通过首先利用蛋白G琼脂糖(pharmacia/LKB)和根据产品说明书与Affi-prep(Bio-Rad)偶合的猴抗绵抗体(Dako)从激发免疫绵羊的培养物上清液中除去抗体、从而分离出特异性抗原。然后根据产品说明使纯化的抗体与Affi-prep(Bio-Rad)偶合，并将色谱柱在PBS和0.05%Empigen洗涤剂中平衡。
将L4抗原装到亲合色谱柱上，用0.5M PH7.4的NaCl和0.05%Empigen除去非结合蛋白。用1M NH4SCN(Ajax)的PBS溶液将结合蛋白洗脱。用OD280监测洗脱液。洗脱后，样品在0.005M PH 8.3的Tris中充分透析，冷冻干燥并在-70℃贮存。将样品重新悬浮于蒸馏水中，用于进一步分析。亲合分离抗原的银染色和考马斯染色。
当根据morrissey图2的方法(1981)用银对凝胶染色时，在常规SDS-Page凝胶上能够看到几条色带。免疫印迹和用激发免疫绵羊的培养物上清液进行探测，在亲合分离制剂的67-75kd区域引起强烈的抗体应答(图3)。但是在银或考马斯染色凝胶上没有任何色带可以确定与这种抗体活性工区域有关连。这表明这种特殊的分子不能用常规使用的蛋白染色剂染色。
酶消化将6ug亲合分离四期蚴的抗原在含有10mMEDTA、0.1%SDS、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)和0.1%β-巯基乙醇的0.1MPH8.0磷酸钠缓冲液中，与糖肽酶F(20μl)(Boehringermannheim)或蛋白酶K(10ug)(Sigma)一起在37℃培育过夜。另外，将抗原在PBS中与胰蛋白酶(10ug)(Difco)一起培育。培育后，将所有样品与SDS非还原缓冲液混合，煮沸5分钟并装入12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，转移至硝化纤维素上并如前所述用培养物上清液进行探测。蛋白酶K和胰蛋白酶处理都使得蛋白质分解，因此通过培养物上清液的抗体不能进行识别(分别为通道A和B)。糖肽酶F对此抗原没有作用，其结果与对照培育相同(通道C和D)。这表明抗原中有一种可被蛋白酶K和胰蛋白酶降解的蛋白成分，但是在这些条件下该蛋白似乎不含有相当于交联天门冬酰胺的聚糖。
抗原的等电点根据Mclachlan和Cornell和方法(1978)用一个塑料模板(Corning免疫电泳板)制备薄层等电点聚集(IEF)凝胶，每一IEF凝胶由0.95%W/V的IEF琼脂糖(Bio-Rad)、11.4%W/V的D-山梨糖醇(Sigma)、4.8%范围在3-5或3-10的载体两性电解质和蒸馏水组成。将水、山梨糖醇和琼脂糖蒸沸，然后放在56℃的水浴上，加入两性电解质，将此溶液倒到模板上，盖上一片Gelbond(FMCpharmacia)。将此板放入塑料袋内，在使用前在4℃至少贮存2小时。
加1ul亲合纯化抗原，以1瓦特恒定功率使凝胶泳动45分钟。泳动完成后，用硝化纤维素(Schleicher和Schuell)贴在此凝胶上，然后贴上几片滤纸并压上一块起重量作用的玻璃板。然后蛋白在1个小时里从凝胶扩散到膜上，在这之后，将此膜阻断并如前所述用培养物上清液进行探测。结果表明存在一种高酸性蛋白质，它具有以图5IEF基准(Bio-Rad)标明的低于4.65的等电点。
例2肝片吸虫肝片吸虫(肝吸虫)是一种出现于许多动物的肝和胆管中的吸虫族寄生虫，它对于绵羊和牛产业具有特别的经济重要性。诸如抗肝吸虫菌疫苗这样的预防方法在市场上没有销售。虽然绵羊不能对肝片吸虫产生免疫，牛却能部分地抵抗再次感染。尽管不能充分地阐述牛具有抵抗力的机理，但是有一种可能性是，与绵羊不同，牛可以识别一种不同的(防护性)抗原。因此上面所述的技术可用于研究绵羊和牛之间不同抗原的识别。
抗原的制备1、新脱囊蚴(NEJ)从Baldwin Aquatics(Monmouth，Oregon，U.S.A)购买肝片吸虫后囊蚴(Mc)。将后囊蚴悬浮于20ml含100mg牛磺胆酸钠、80mgL-半胱氨酸的DME培养基中，使其脱囊。向此悬浮液中通入40%CO2、10%O2和50%N2的混合气体，在37℃培育，用金属筛过滤后收集NEJ。沉积的NEJ再次悬浮于含蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-PI)(5mM碘乙酰胺和1mMPMSF)中并进行声处理。将等分试样在-70℃贮存。
2、幼吸虫通过口服30Mc感染小鼠，12天后将其杀死。用一个茶叶粗滤器洗涤浸渍的肝，并通过差速离心回收幼吸虫。如上所述制备抗原。
3、成熟吸虫从屠宰场得到被感染的绵羊或牛的肝。从胆管中回收成熟吸虫，用组织研磨机打成匀浆，进行等分试样并在-70℃冷冻。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与Western印迹法与血矛线虫属相同，只是使用7.5-15%梯度凝胶或10%SDS-纸凝胶。所有抗原与非还原缓冲液按1∶1混合，分别用结合了过氧化物酶的兔抗牛或绵羊免疫球蛋白(DAKO)检测牛和羊的抗体。
丁醇萃取将悬浮于PBS-PI中的新脱囊蚴进行声处理，并在5000g下旋转10分钟。如下文所述，上清液用于亲合纯化。将沉淀小片重新悬浮于PBS-PI中，并加入等体积的冷的正丁醇。将此混合物在冰中保温10分钟，间或旋摇，然后在5000g下旋转5分钟。收集底层水溶性部分。
亲合纯化利用琼脂糖结合蛋白G(pharmacia)从被感染的牛(见下文)的培养物上清液中纯化抗体。与对捻转血矛线虫的描述基本相同，将此抗体用于亲合色谱柱的制备。
在NEJ声处理上清液中(见上文)加入TritonX-100R-S(sigma)使最终浓度为2%。将该声处理上清液装入亲合色谱柱，并用含0.1% Triton X-100 R-S和1mM PMSF的PBS、然后用1.5M NaCl洗去未结合的组分。用2M NH4SCN的PBS溶液将结合组分洗脱，在蒸馏水中透析并冷冻干燥。将冷冻干燥组分重新悬浮于PBS中，以进一步使用。
培养物上清液的制备通过口服400个后囊蚴使三只绵羊和三只牛感染。18天后给它们服用FASINEX 120(CIBA-GEIGA Australia Ltd)，以消除初级感染。让这些动物在口服400个后囊蚴使其激发前再存活35天。在激发后10天将它们杀死。取下肝淋巴结(HLN)，分离细胞，并像对绦虫的描述那样在具有PWM的培养基中以2-4×106细胞/ml进行培育。体外培养7天后收集上清液。以带有未治疗初级肝片吸虫感染(80个Mc)的，在屠宰前10天用300条Mc激发的绵羊肝淋巴结细胞中收集另外的培养物上清液。
结果用被感染牛的HLN细胞得到的培养物上清液进行Western印迹法探测导致对NEJ抗原制剂中的成对抗原具有强的抗体活性。这种成对抗原位于略微高出最高预染色分子量标记之上(图6)。在NEJ成对物较高分子量水平处只有一条色带是始终存在于12天龄的吸虫制剂中，与此同时，在几次重复实验中，在成熟吸虫标本中不能可靠地检测出相似的色带。与此对照，当用类似方法感染(初级abreviated和激发10天)的绵羊的培养物上清液进行探测时，在Western印迹上观察不到与NEJ抗原的反应(未显示)。当用该绵羊培养物上清液与慢性感染与激发的绵羊的培养物上清液的混合物对该抗原制剂进行探测时，尽管其它色带被强烈识别出来，但是观察不到与这条由牛上清液识别出的色带的反应(图6)。
与该培养物上清液受限制的活性不同，用同一时间取自同样一些动物的血清探测的相似Western印迹在全部3个寄生期中与许多色带更加扩散地反应，而且在牛和绵羊血清之间没有观察到明显的区别(无显示)。
全部NEJ制剂的银染色法不能使牛培养物上清液所识别的抗原清楚地染色，表明这种抗原只是组成寄生物的全部分子中的一个较小的成分(图7a)。通过测定该抗原在复制的Western印迹上相对于最高预染色分子量标记的位置，用高分子量标记作为基准，计算出它在SDS-PAGE凝胶上的大约分子量为120-125kd。当NEJ声处理沉淀小片的正丁醇提取的可溶组分在SDS-PAGE凝胶上泳动时，可以清楚地看到在NEJ制剂中银染色的成对物(图7b)。
在牛抗体色谱柱上的亲合纯化使得抗原从非结合组分中明显排除并在结合组分中高度浓缩(图8)。此外，在结合组分中还有一条强的低分子量色带(±24kd)，它在Western印迹上也可与牛培养物上清液强烈反应(未示出)，表明此低分子量色带是由于亲合过程中120-125kd抗原的分解所形成的。
例3绦虫原料与方法寄生虫与实验动物在用溴化氢槟榔碱使被感染的狗催泻后，从成熟蠕虫切片中收集绦虫卵。使用饲养场饲养的2年龄绵羊。此年龄的绵羊通常通过自然接触可获得对绦虫免疫力，这已由一些初步的实验证实。在皱胃内注射40-50000绦虫卵后13天杀死的绵羊中收集阳性血清和阳性培养物上清液。从未预先激发感染的绵羊中收集阴性培养物上清液。从无蠕虫条件下饲养的5月龄的绵羊中收集阴性血清。
白细胞悬浮液的制备通过下面的方法回收肝白细胞。将绵羊肝取出，在室温下通过门静脉白肝中注入1升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，然后注入0.5升冷的PBS并连续地和轻轻按摩肝。此过程使得整个肝彻底漂白。在食品加工机(Goldair，Australia)中以低速将约100g肝组织打成匀浆8-10秒种。将打成匀浆的肝穿过金属网，使它沉淀8-10分钟并通过棉沙布过滤。将细胞通过在400g下离心8分钟。然后在10g下低速离心5分钟洗涤两次以除去小的凝块和大量肝细胞。收集最后旋转所得到的上清液，并通过在ficoll/Isopaque上梯度离心除去剩余的肝细胞和死细胞。
通过在一个细线网上切割和梳理淋巴结，从淋巴结中回收白细胞。通过在ficoll上的梯度离心除去死细胞和凝块。
培养物上清液的制备白细胞重新悬浮于培养基中，其浓度为2-4×106/ml培养基，培养基由其中加入10mM HEPES 100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2.5×10-5M 2-疏基乙醇，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸盐和10%牛胎血清的DME组成。将2ml培养物放于24井的Linbro板上，用25μg/ml商陆植物分裂素(PWM，Gibco Labs，Grand Island，NY)刺激并在5%CO2气氛下在37℃培养。7天后，汇集这些培养物并通过离心使细胞沉淀。使用前将此上清液在-20℃贮存。
抗原的制备
(a)六钩蚴抗原(O)用次氯酸钠孵育从成熟蠕虫切片回收的绦虫卵，并通过100%Percoll纯化所释放出的六钩蚴。将全部2.3×105六钩蚴悬浮于含蛋白酶抑制剂的1ml PBS(PBS-PI)(5mM碘乙酰胺和1mM苯甲基磺酰氟(phenyl，methyl，sulphanyl-fluoride))中，并在-20℃冷冻。随后将此制剂解冻，用MSE 150w超声粉碎机(Crawley，England)进行声处理，等分试样并在-20℃贮存。
(b)后囊蚴抗原在屠宰时从绵羊腹膜腔中收集后囊蚴。除去囊肿液体，将头节与囊壁分离，在-20℃冷冻于PBS-PI中。随后将此制剂解冻，在一个“运动均化器”(PolytronLuzern，switzerland)中打成匀浆，声处理并以1400转/分钟的速度离心15分钟。等分上清液并在-20℃冷冻。
通过Western印迹技术检测抗原。
将40ul抗原组分与40ulSDS非还原样品缓冲液按1∶1混合，煮沸5分钟，在5000g下离心10分钟，并在10或12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上泳动。将分离出的蛋白质转移至硝化纤维纸上过夜。用3%鸡卵白蛋白(OVA)将这些纸阻断并分割成条。经下述培育步骤后在纸条上的特异性抗原被显现(1)培养物上清液或血清(2)生物素化的驴抗绵羊Ig(Amersham)(3)抗生蛋白链菌素-生物素化的辣根过氧化物酶复合物(Amersham)(4)过氧化物酶底物(含0.05%H2O2的0.6mg/ml二氨基联苯胺的PBS溶液)。
各种试剂都以制造厂推荐的稀释度被使用。
(1)六钩蚴抗原标本的Western印迹法探测表明有2条不同的抗原色带，它们可以被从新感染绵羊(
)的肝白细胞中收集的培养物上清液特异识别，而不能被从未激发绵羊(
)的肝白细胞中收集的培养物上清液识别(图9，箭头)，当该六钩蚴制剂被稀释1/2和1/4时，这两条抗原色带仍可以被阳性培养物上清液检测到，其分子量约为22k和35k(图10)。
(2)当使用同样的阳性肝培养物上清液探测囊壁(B)或头节(S)制剂的Western印迹时，检测不到这2条六钩蚴抗原色带(图10)。这表明这2条在六钩蚴制剂中被特异检测到的抗原色带对于六钩蚴对免疫攻击可能是敏感的寄生期，是时期特异的。
(3)当以阳性肝培养物上清液作于“探测”六钩蚴的Western印迹时检测到的这2条抗原色带，在用取自感染后相同时间相同绵羊的血清作为探针时却探测不出(图11)。
(4)当使用从新感染动物淋巴结中分离出的白细胞培养物上清液时也检测到这2条六钩蚴抗原色带(图12)。
例4假结核棒状杆菌干酪性淋巴结炎(缩写CLA，也称为干酪腺)是一种由假结核棒状杆菌(syn，绵羊棒状杆菌)引起的绵羊和山羊的慢性感染。在现有技术中已知一种复杂的无细胞CLA疫苗(GLANVAC，Cmmonwealth，SerumLaboratories)，它普遍地被单独或作为一种6组分抗菌疫苗的一部分(6合1)服用。由这种疫苗取得的保护作用功归于这种失活毒素(即类毒素)成分。当这种毒素在还原条件下在12.5%SDS-PAGE上泳动时，具有大约31千道尔顿的相对分子量。虽然这种现有技术的疫苗确实产生一些防护作用，但这种疫苗是复杂和昂贵的，所以大量感染仍会发生。
本例是描述从假结核棒状杆菌感染分离出一个防护性抗原，此抗原的分子量约为38-40千道尔顿。
抗原的鉴别使用与对捻转血矛线虫(例1)描述的基本相同的方法得到培养物上清液。免疫和非免疫绵羊的激发感染通过注射存活的假结核棒状杆菌悬浮液被局限于下腿部，取出淋巴结，然后在培养基中培养5-7天。
用培养物上清注进行全细胞的western印迹分析表明(ⅰ)免疫绵羊识别出复杂模式的抗原，但是在大量动物中38-40千道尔顿的抗原具有免疫优势。
(ⅱ)非免疫动物擅长于识别38-40千道尔顿的抗原而通常显示不出其它的活性。
抗原萃取在BrainHearth浸渍琼脂上，经过在37℃好气培养1-3天，获得汇合生长的假结核棒状杆菌。将细胞从固体培养基上刮下。
将细菌团块重新悬浮于无菌水中通过涡流洗涤，然后在3000Xg下离心15分钟。倾出上清液并将湿的细胞小片悬浮于约是它4倍体积的1.0%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液中进行萃取，并加热至70℃-100℃10分钟。在10000Xg下离心15分钟除去细胞和碎屑。粗的混合物含有不同于所要求的抗原。
可以从用SDS如上所述地从假结核棒状杆菌全细胞中萃取的复杂混合物中，或从无细胞培养上清液中纯化蛋白质抗原。可以使用常规生化技术，包括离子交换和分子筛色谱、硫酸铵分级分离结合疏水色谱。此外，可以利用从被固定于合适的固相上的由探针分离的抗体使用亲合色谱。另一个办法是通过用纯化抗原使动物免疫能够培养多克隆或单克隆抗体。
将此抗原在高达50%饱合度的硫酸铵溶液中仍是可溶解的。38-40千道尔顿抗原的特性当此蛋白在还原条件下在12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶上泳动时，其表现分子量为38-40千道尔顿。它可以用考马斯亮篮R250和银染色。在进行Western印迹法之后也可以使用酰胺黑在硝化纤维素上染色。其结果被表示在图13A上。
在含有11.4%山梨糖醇和PH5-8两性电解质的0.95%琼脂糖中进行薄层等电点聚集，使抗原集中于PH6.8-6.9，使用了如下的Biorad等电点标记(见图14)藻青素-4.65、B-乳球蛋白-5.10、牛碳酸酐酶6.0、人碳酸酐酶6.5、肌球蛋白7.0、人血红蛋白A7.1、人血红蛋白C7.5、细胞色素C9.6。
对从SDS-聚丙烯酰胺凝胶上洗脱的天然抗原进行的氨基酸顺序分析表明了位于或接近于氨基末端的顺序部分为(向羧基末端展开)ESATLSKEPLKASPGRADT，VGVQ(或者最好是Glu，Ser，Ala，Thr，Teu，Ser，Lys，Glu，Pro，Leu，Lys，Ala，Ser，Pro，Gly，Arg，Ala，Asp，Thr，Val，Gly，Val，Gln.)最后，应该明白，在不脱离本文中概括的本发明要旨的条件下，可以作出各种其它的修改和/或改变。
参考文献-Henderson，L.E，Oroszlan，S.及Konigsberg，W.1979.《分析生物化学》93153-157-KerlerodeRosbo，N.，Carnegie，P.R，Bernard，C.C.A.及Linthicum，D.S.1984.《神经化学研究》，91359-1369。
-Laemmli，U.K.1970.《自然》(London)277680-685.
-Mclachlan，R.，和Cornell，F.N.1978.《病理学》10395。
-Morrissey，J.H.1981.《分析生物化学》，117307-310-Ward，E.S.，Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P.T.和Winter，G.1989《自然》341544-546。
权利要求
1.一种产生至少一种抗疾病病原体抗体的方法，该方法包括提供一个被病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品；从该生物样品中分离细胞；在合适的培养基中进行细胞体外培养；收集由所述细胞产生的抗体。
2.根据权利要求1的方法，其中生物样品取自免疫动物。
3.根据权利要求2的方法，其中生物样品是在用病原体或病原体提取物激发免疫动物后的一个短时间上采取的。
4.根据权利要求1的方法，其中生物样品取自感染部位或病灶区域或接近于感染部位或病灶的区域。
5.根据权利要求1的方法，其中疾病病原体选自寄生虫、肿瘤、细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、真菌、原生动物、蠕虫及外寄生节肢动物，或是一个自身抗原。
6.根据权利要求2的方法，其中从生物样品中分离的细胞是一种在已知包括了分泌和/或产生抗体的时期的时间上分离的B细胞。
7.根据权利要求6的方法，其中B细胞是在用病原体或病原体提取物激发免疫动物后的一个短时间上分离的。
8.根据权利要求1的方法，其中从生物样品中分离的细胞包括记忆细胞。
9.根据权利要求1的方法，该方法进一步包括向培养基中加入一种细胞活化剂使所分离的细胞活化和/或增殖，从而分泌和/或释放抗体。
10.根据权利要求9的方法，其中细胞活化剂选自分裂素和辅助因子或其人工合成的等同物、或它们的组合物。
11.一种纯化抗原的方法，该方法包括提供一个粗抗原混合物;一种固定于合适支持物上的抗疾病病原体的抗体，产生此抗体的方法包括提供一个被病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;从该生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体;利用被该固定化抗体对此粗抗原混合物进行亲合色谱;以及分离所形成的纯化抗原。
12.一种包括至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其产生方法包括提供一个被病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;从该生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体。
13.一种制备与疾病病原体关连抗原的方法，该方法包括提供一种疾病病原体样品;以及一种包括至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其产生方法包括提供一个用病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;从生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体;用该抗体探针探测病原体样品以检测至少一种抗原;以及分离所检测的抗原
14.根据权利要求13的方法，其中疾病病原体样品选自寄生虫、肿瘤、病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体、真菌、原生动物、蠕虫和外寄生节肢动物。
15.根据权利要求14的方法，其中疾病病原体样品是一种寄生虫、寄生虫提取物或寄生虫切片。
16.根据权利要求15的方法，其中寄生虫选自捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)、肝片吸虫(Fasciolahepatica)和绦虫(Taeniahydatigena)。
17.根据权利要求13的方法，其中病原体样品是细菌或细菌提取物。
18.根据权利要求17的方法，其中细菌是假结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)。
19.根据权利要求13的方法，其中样品取自于被认为是对攻击最敏感的发展期的疾病病原体。
20.根据权利要求19的方法，其中疾病病原体是一种寄生性绦虫感染，而该样品取自于六钩蚴期。
21.根据权利要求19的方法，其中疾病病原体是一种寄生性蠕虫感染，而该样品取自于幼虫期。
22.根据权利要求19的方法，其中疾病病原体是一种寄生性吸虫感染，而该样品取自于吸虫蚴期。
23.一种制备与疾病病原体关连抗原的方法，该方法包括提供一个疾病病原体样品，该样品取自于被认为是处于对攻击最敏感的发展期的疾病病原体;以及一种包括至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其产生方法包括提供一种免疫动物的生物样品，该样品取自用病原体或病原体提取物激发免疫动物后的一个短时间内;从该生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集从所述细胞中产生的抗体。
24.一种抗疾病病原体的防护性抗原，其制备方法包括提供一种疾病病原体样品;以及一种包括至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其产生方法包括提供一种用病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;从该生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集所述细胞产生的抗体。
25.一种抗绦虫感染的防护性抗原，如前所述，它选自于分子量约为25至34千道尔顿的抗原。
26.一种抗捻转血矛线虫感染的防护性抗原，如前所述，它的分子量约为67到75千道尔顿。
27.一种抗肝片吸虫感染的防护性抗原，如前所述，它的分子量约为120-125千道尔顿。
28.一种抗假结核棒状杆菌感染的防护性抗原，如前所述，它的分子量约为38-40千道尔顿。
29.一种制备抗疾病病原体抗原的单克隆抗体的方法，该方法包括提供一种能产生抗所述抗原的抗体的B细胞，它是从一种用抗疾病病原体的防护性抗原而免疫的动物获得的;以及一种骨髓瘤细胞;将此B细胞与骨髓瘤细胞融合;繁殖所产生的杂交体;以及收集由所述杂交体产生的抗体。
30.一种按照权利要求29的方法产生的抗防护性抗原的单克隆抗体。
31.一种抗疾病病原体的合成抗原性多肽的制备方法，该方法包括提供一个从疾病病原体样品得到的CDNA库或基因组库;以及一种从如上所述抗体探针中选出的抗体探针;由此产生的单克隆抗体或其衍生物;用该抗体探针探测CDNA或基因组库;以及分离由此检测的合成抗原性多肽。
32.一种包括由一种方法制备的抗疾病病原体的诊断抗原的诊断药盒，所说方法包括提供一种疾病病原体样品;以及一种包括至少一种抗疾病病原体抗体的抗体探针，其制备方法包括提供一种用病原体或病原体提取物感染或激发动物的生物样品;从该生物样品中分离细胞;在合适的培养基中进行细胞体外培养;以及收集由所述细胞产生的抗体;用抗体探针探测病原体样品以检测至少一种抗原;以及分离检测出的抗原。
33.一种预防动物疾病的方法，该方法包括给动物施用有效量的至少一种抗疾病病原体的防护性抗原，如上所述，病原体选自绦虫、捻转血矛线虫、肝片吸虫和假结核棒状杆菌。
34.一种治疗动物疾病的方法，该方法包括给动物施用治疗有效量的抗如权利要求30的防护性抗原的单隆抗体。
35.一种疫苗或兽药组合物，其中包括一个预防有效量的至少一种抗疾病病原体的防护性抗原，病原体选自绦虫。捻转血矛线虫、肝片吸虫和假结核棒状杆菌。
36.一种疫苗或兽药组合物，其中包括一个治疗有效量的至少一种如权利要求30的单克隆抗体。
全文摘要
本发明包括制备病原体抗体或抗体探针的方 法，即从被病原体或其提取物感染或攻击过的动物体 上采取生物样品，从中分离到的细胞进行体外培养 后；收集由细胞产生的抗体或抗体探针；利用所制备 的抗体或抗体探针，纯化、检测和分离制备抗原的方 法；从用防护性抗原而得到免疫的动物中获得的B 细胞与骨髓瘤细胞融合，繁殖所产生的杂交体，制备 得到单克隆抗体的方法；含有所述单克隆抗体的药物 组合物可用于防治动物、家畜的寄生虫和病原菌等的 感染。
文档编号A61K39/05GK1046188SQ9010146
公开日1990年10月17日 申请日期1990年2月1日 优先权日1989年2月1日
发明者埃尔莎·尼科·特里西亚·米于森, 马尔科姆·莱伊·布兰登, 马克·道格拉斯·戈雷尔, 约翰·沃尔克, 弗农·莫里森·鲍尔斯 申请人:墨尔本大学, 澳大利亚肉类及牲畜研究及发展公司