专利名称：新的抗肿瘤抗生素的制作方法
本申请描述的主题与1990年1月12日提交的美国专利申请序号464，046(CT-1970)中所公开的主题有关。
已知可通过发酵多种类型的微生物来生产抗生素。某些生物学活性发色团是以它们与蛋白质部分结合形成色蛋白复合物这样一种方式产生的。“Neocarzinostatinchromophore”，Napier，M.A.，etal.Biochem.Biophys，Res.Commun.89，635-642(1979)和“AuromomycinChromophore，Suzuki，H.，etal.Biochem.Biophys.Res.Commun.94，255-261(1980)中描述了已研究过的色蛋白。抗肿瘤抗生素C-1027便是衍生于球孢链霉菌C-1027(StreptomycesglobisporusC-1027)的发色团部分。T，Otani等人在“IsolationandCharacteriza-tionofNon-proteinChromophoreanditsDegradationProductfromAntibioticC-1027”，JournalofAntibiotics，44，564-568(1991)中描述了该抗生素的分离，特性及生物学活性。
本发明涉及通过发酵马杜拉放线菌属(Actinomadura)的菌株得到的化合物BMY-46164，其组合物和其使用方法，以及其分离方法。应注意的是，申请人提到的“化合物”包括该化合物的所有医药上可接受的衍生物。
基于高分辨率快原子轰击质谱(FABMS)的分析数据，可以相信该新的发酵产物分子式为C40H43N2O12Cl，分子量为778。其为无色的、有下列性质的非晶形固体。
该发酵产品为非蛋白质、非共价结合的发色团，据信该产物通过发色团与马杜拉放线菌属的菌株产生的蛋白质相结合。
已发现该发酵产物具有对抗多种革兰氏阳性菌如粪肠球菌(En-terococcusfaecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau-reus)及枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的抗微生物活性。它还具有抗肿瘤模型如P388白血病的活性。
可在深层通气条件下，在液体营养培养基中发酵BMY-46164生产菌株或其突变体，得到新的抗生素，直到由所说的微生物在所说的培养基中产生实质量的BMY-46164。发酵后，从培养基中回收基本上没有共产生之物质的BMY-46164。
产生本发明化合物的马杜拉放线菌属的Q473-8菌株的生物学纯培养物已寄存在Rockville，MD美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并给予保藏登记号ATCC53806。
该菌株的培养物也作为亲液培养物保存在Wallingford，Conn-ecticut的Bristol-MyersSquibbCompanyPharmaceuticalResearchInstituteActinomycetesCultureCollection。
在本申请申请之日前即已完成了ATCC寄存，并已完全符合35U.S.C.112条款的要求。
图1显示BMY-46164在甲醇中的紫外光谱。
图2显示BMY-46164(KBr压片)的红外光谱。
图3显示BMY-46164在d6-DMSO中的质子NMR谱。
图4显示BMY-46164在d6-DMSO中的碳NMR谱。
称为化合物BMY-46164的发酵产物具有经验式C40H43N2O12Cl，和778的分子量。
生产BMY-46164的一个优选方法包括下列步骤(1)发酵放线菌的适当菌株，(2)提取蛋白质类发酵产物，(3)使步骤(2)的产物变性，并(4) 分离经验式为C40H43N2O12Cl，分子量为778的化合物。
这种无色的非晶形固体物的化学结构尚未确定，但已知其具有下列性质质谱KratosMS50TC质谱仪。FABMS778.2527。另外在294.1339和149.0603处有优势的碎片离子。
紫外光谱Hewlett Packard 8452A Diode Array 光谱仪;浓度1.0mg/100ml甲醇。中性溶液给出下列最大吸光值λnmmax(E1%1cm)278(635)。
红外光谱Perkin-Elmer 1800 FTIR光谱仪，KBr压片，cm-13424，3076，2934，2838，2170，1640，1578，1520，1490，1462，1424，1376，1292，1248，1184，1156，1112，1072，1046，952，900，880，832，810，754，682，666，648，576，524.
500MHz1H-NMRBruker Model AM-500光谱仪。双重碳一质子探头，5mm。溶剂 d6-DMSO。观察到的化学位移(ppm)是9.18(br.5，1H)，8.09(dd，1H)，7.40(d，1H)，7.25(d，1H)，6.97(d，1H)，6.81(d，1H)，6.58(d，1H)，6.37(t，1H)，5.41(s，1H)，5.37(dd，1H)，5.27(m，1H)，5.13(br.s，1H)，4.91(s，1H)，4.89(m，1H)，4.65(d，1H)，4.22(br.d，1H)，4.13(ddd，1H)，3.94(m，1H)，3.80(dd，1H)，3.54(s，3H)，3.46(dd，1H)，3.21(d，1H)，3.12(s，3H)，2.94(ddd，1H)，2.73(m，1H)，2.71(dd，1H)，2.58(dd，1H)，2.31(dd，1H)，2.19(s，3H)，2.10(s，3H)，1.26(s，3H).
125 MHz13C NMRBruker Model AM-500光谱仪。质子去偶光谱。双重碳一质子探头，5mm。溶剂 d6-DMSO。观察到的化学位移(ppm)是168.4，168.1，153.3，152.8，139.3，138.5，133.0，131.4，131.3，131.0，130.8，126.8，124.7，124.3，122.5，122.1，121.0，109.2，97.5，95.7，94.3，94.2，93.3，90.1，74.0，73.2，70.9，69.8，69.6，66.3，62.5，55.4，54.4，52.3，43.2，37.5，33.6，22.7，19.5，16.1.
在本文所述的所有检测中，均使用下列参数溶剂在使用前未经重蒸馏。甲醇、乙酸乙酯、氯仿、己烷、二乙醚、二氯甲烷和乙腈均为ACS级试剂。HPLC使用的水是指经Barns-teadNanopureⅡ系统处理的去离子水。HPLC使用的甲醇和乙腈是B&JBrandHPLC级溶剂。醋酸铵是FisherHPLC级的。DEAE纤维素是Schleicher和Schuell阴离子交换纤维素(批号2932和2893)。Tris缓冲液〔三(羟甲基)氨基甲烷〕是酶级超纯试剂(BethesdaResearchLaboratories)，0.05M，pH7.4。代卡利特(Dicalite)是快速高级助滤剂(GrefcoMinerals)。
正相薄层层析(TLC)在硅胶60，F254平板(EMReagents，cat.＃5765，5×10cm，0.25mm厚)上进行。用WhatmanMKC18平板(cat.＃4803-110，0.2mm厚)完成反相TLC。平板在带盖和含有10ml洗脱液的Whatman圆筒形缸中展层。用254nm紫外光观察作为UV骤冷带的发色团。
在硅胶60，F254平板(EMReagents，cat.＃5766，20×20cm，2mm厚)上进行制备性薄层层析(PLC)。平板在带盖和含有100ml洗脱液的玻璃罐中展层。
真空液相层析(VLC)装置由Buchner漏斗(Kontes，Art.＃K-954100)构成，其包括一个密封的烧结玻璃皿(M孔隙度)、一个连接真空的侧面软管和一个接通接收瓶的低位24/40接头。通过在真空下抽吸起始洗脱液平衡漏斗以形成紧密充填的5cm吸附床高度。将样品预吸附到吸附剂上并作为在起始洗脱液中形成的浆液加入漏斗中。使用预定体积有渐增极性的洗脱液进行梯度洗脱。然后分别吸干漏斗内容物。在旋转蒸发器上浓缩各部分，并基于体外生物学检测结果及HPLC-UV和TLC分析结果合并之。
代卡利特层析是指在硅藻土上进行的吸附层析。将样品溶解于氯仿-甲醇(2∶1)中并吸附到代卡利特硅藻土上。将所得粉末加在己烷中制成浆液并装入烧结玻璃VLC漏斗中。通过硅藻土(代卡利特)将预定体积的溶剂推入已在旋转蒸发器上浓缩过的圆底烧瓶中。
排阻层析装置由下列部分构成装有抗溶剂特弗隆(Teflon)端板的Glenco柱(2.5 I.D.X100cm);FluidMetering，Inc.FMI实验室泵(RP-G150型);Glenco玻璃储存器(500ml);Isco328型分级收集器。用在洗脱溶剂中预溶胀的SephadexLH-20(Pharmacia)浆液装柱。在用实验室泵控制流速的条件下，通过柱向下放出溶剂。
在由下列部分组成的BeckmanSystemGold装置上进行HPLC纯化126型溶剂输送组件;166p型程序可控检测器;溶剂储存药盒;Altex注射器;Dynamax60°A半制备柱;正向硅胶(25cm×10mm，8微米，Si-83-111-c或25cm×21.4mm，8微米，Si-83-121-c)和反向硅胶(25cm×10mm，8微米，C18-83-211-C)。
可经发酵放射菌的BMY-46164生产菌株生产本发明的抗菌素抗肿瘤剂。优选的生产菌是从在Athens，Greece收集的土壤样品中分离的放线菌，并定名为Q473-8菌株。如上所述，Q473-8菌株的生物学纯培养物已保藏在ATCC。
在美国专利申请系列号464，046中详细描述了对Q473-8菌株的分类学研究。Q473-8菌株的化学分类学资料以及形态学特征表明该生物体为马杜拉放线菌属的成员，其形态学和碳利用特性更接近于Actinomaduramadurae〔参见Williamsetal，“TheProkaryotes，Vol.Ⅱ”，pp.2103-17，1981(Starr，Stolp，Truper，BalowsandSchlegel，eds)〕。
为了确定Q473-8是否具有与最近提出的新的Nonomuria菌属相一致的性质，还须进行包括甲基萘醌分析在内的其他鉴定。〔参见Coodfellowetal，“BiologyofActinomycetes，1988”PP.223-38，1988(Okami，BeppuandOgawara，eds.)〕。
应明确的是，本发明不限于使用上述的特定优选菌株或充分明确其特征的微生物。本发明特别倾向于包括可通过常规方法，如x射线照射、紫外光照射、用氮芥处理，接近噬菌体等方法产生的、能生产BMY-46164的上述微生物的其他变异体或突变体。
可在深层通气条件下在液体营养培养基中培养马杜拉放线菌的BMY-46164生产菌株，最好是Q473-8菌株或其变异体或突变体以产生BMY-46164。
该微生物体可生长于含有可同化之碳源如蔗糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、蜜二糖、甘油或可溶性淀粉的营养培养基中。培养基还应含有可同化的氮源，如胨、鱼粉、大豆粉、花生饼粉、棉籽粉、玉米浸泡液的浓缩液、酵母浸膏或铵盐。必要时可加入无机盐，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙、磷酸盐等。
需要时还可向培养基中加入铜、锰、铁、锌等微量元素，或将它们作为培养基其他成分的杂质补入培养基中。
可在能使生产菌得以充分生长的温度下，如大约16℃至41℃的温度下生产BMY-46164。较好在大约25℃至35℃，最好在大约27℃至32℃下进行发酵生产。培养基较好为中性pH。抗生素的生产一般进行大约4至5天。
发酵过程可在培养瓶或不同容量的实验室或工业发酵罐内进行。当使用罐发酵时，可通过用微生物斜面或冻干培养物接种小体积培养基在营养培养液中产生营养种子菌。
以这种方式得到活性种子菌后，可将其无菌转移到发酵罐培养基中，以大批量产生BMY-46164。用于产生营养种子菌的培养基可以是与发酵罐所利用的培养基相同或不同的，只要它能使生产菌得到良好生长即可。发酵期间可由机械叶轮提供搅拌。必要时可加入常规消泡剂，如猪脂油或硅油。
可用常规溶剂提取及层析技术从发酵培养基中分离BMY-46164抗生素并纯化BMY-46164。亦可通过下述方法进行分离。
用代卡利特助滤剂过滤全发酵液(90升)。向滤液内加入1kgDEAE纤维素，充分混合并冷却至4℃。过滤回收DEAE纤维素并用新鲜的冷(4℃)Tris缓冲液冲洗之。通过在6升甲醇-乙酸乙酯(1∶1)混合物中静置1小时以提取DEAE纤维素网垫。过滤该提取混合物并再用乙酸乙酯(3升)冲洗所得到的纤维素网垫。向合并的有机提取物中加入6升冷水。分离乙酸乙酯层并在减压下浓缩，得到1.0g粗制发色团提取物。
得到发色团提取物的另一种方法是在分配步骤中用二氯甲烷代替乙酸乙酯。为此，向一体积从提取蛋白质结合的DEAE纤维素网垫得到的甲醇内加入2体积冷水(4℃)和1体积二氯甲烷。在旋转蒸发器上浓缩有机层以得到粗制发色团提取物。
使发色团提取物吸附到3.5gUniversal硅胶(63-200微米)
表1BMY-46164作为抗菌剂的效能初步MIC值(μg/ml)微生物BMY-46164青霉素粪肠球菌A2068880.25粪肠球菌A25707425粪肠球菌A2570880.5金黄色葡萄球菌A953740.06金黄色葡萄球菌/NCCLS菌株160.06金黄色葡萄球菌160.5大肠杆菌A15119>5001大肠杆菌/NCCLS菌株>5002大肠杆菌A9751>5000.25肺炎克氏杆菌A20468>50016肺炎克氏杆菌A20468>50032普通变形杆菌A21559>50032铜绿假单胞菌A9843>500>128铜绿假单胞菌A20235>50032铜绿假单胞菌/NCCLS菌株>500>128枯草芽胞杆菌A9506-A641
将5ml该营养培养物转移到含100ml由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸钙组成之生产培养基的500ml培养瓶中。再次在旋转振荡器(250转/分钟)上28℃保温4～5天。在发酵周期的大约第4天培养物产生最大水平的BMY-46164。
实施例2在实验室发酵罐内发酵生产BMY-46164为了在50升标定体积的Biolafitte发酵罐内发酵而使用两阶段营养培养基。将实施例1制得的16ml营养培养物转移到含有400ml由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸钙组成之第二营养培养基的2升培养瓶中。将该第二营养培养物在旋转振荡器(250转/分钟)28℃保温3天。
将1200ml该营养培养物转移到4升Vitro瓶中，然后接种于含30升由2%葡萄糖、2%胨和0.5%碳酸钙组成之生产培养基的50升标定体积的Biolafitte发酵罐内。使微生物在下述条件下生长搅拌，250rpm;温度，28℃;通气，30升/分钟;使用消泡剂(聚丙二醇2000，DowChcmical)以控制泡沫形成。在发酵周期开始后的4～5天内，BMY-46164达到最大生产水平。
实施例3抗菌活性研究使用下述方法将BMY-46164与氨苄青霉素相比较，以研究BMY-46164对一系列微生物的抗菌效能。结果示于表1中。
上并加入含25g Lichroprep Si 60硅胶(EM Science，Art.9390，25-40微米)的60ml VLC漏斗内。用300ml洗脱液进行氯仿-甲醇梯度洗脱。用体外检测法检测第3-5管中洗脱的活性。这些部分内洗脱液组成分别是含3%MeOH、5%MeOH和8%MeOH的氯仿。然后使用CHCl3-MeOH(90∶10)作展层剂的制备性薄层层析法(PLC)进一步纯化这些合并的洗脱物(202mg)。
使用Dynamax半制备硅胶柱(Si-83-111-C)经HPLC再次纯化所收集的主活性带(Rf0.37，48mg)，其中利用等容条件(CHCl，MeOH94∶6)以4ml/分钟的速度洗脱。经UV检测(254nm)表明在13.3分钟时洗脱出主峰。收集该峰并蒸发至干。将残留物(28mg)加于第二块MerckPLC板上。使用氯仿-乙腈(60∶40)展层。所回收的主带(Rf0.15)量为16.5mg。
使用Dynamax半制备柱(C18-83-211-C)，以反相HPLC法进行最后的纯化。在40分钟内按20%A-80%B→40%A-60%B的次序进行梯度洗脱，其中A＝乙腈，B＝0.1M醋酸铵-甲醇(3∶1)。在30.9分钟时洗脱出所需的发色团(11mg)并定名为BMY-46164。
从发色团粗提物中得到BMY-46164的另一个纯化方法是将粗提物(12.9g)溶解于氯仿-甲醇(2∶1)中并吸附于300g代卡利特(硅藻土)上。用1升下列溶剂洗代卡利特床己烷、二乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷及甲醇。在二乙醚和乙酸乙酯中浓缩BMY-46164，两部分合并的质量为0.6g。
将该残留物溶解于5ml氯仿-甲醇(1∶1)中并加于用相同溶剂预溶胀的SephadexLH-20柱上。洗脱流速为1.5ml/分钟。共收集5管。所洗脱的BMY-46164主要在占0.7柱床体积的第三管中。浓缩后，称得该部分的重量为143mg。
使用21.4mmDynamax制备柱(Si-83-121-C)以正向HPLC法作最后的纯化，其中洗脱速度为10ml/分钟。在40分钟内进行从氯仿-甲醇(95∶5)到氯仿-甲醇(85∶15)的梯度洗脱。检测300nm吸光率。BMY-46164(34mg)在27.7分钟时洗脱。
作为药物组合物，除化合物BMY-46164和/或其酸或碱加成盐外可含有适当量的其他成分。一般含有大约0.001-99.99%的一种或多种医药上可接受的赋形剂，如充填剂、载体、稳定剂、胶凝剂、着色剂、香料等。组合物中的药物含量一般为大约0.01%至10%，较好为大约0.17%至5%。
下列优选的具体实施例旨在进一步举例说明本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1在摇瓶中发酵生产BMY-46164在试管中维持Q473-8菌株，并转移到添加有CaCO3之酵母浸膏一麦芽提取物的琼脂斜面上。该培养基由4.0g葡萄糖、4.0g酵母浸膏、10g麦芽提取物、1.5g碳酸钙和15g琼脂组成，并加蒸馏水至1升。接种菌株的琼脂斜面在28℃上保温5至7天。
为制备生产阶段使用的种子菌，将斜面培养物的表面生长菌转移到含100ml营养培养基(含20%葡萄糖、1%鱼粉和0.5%碳酸钙)的500ml培养瓶中。然后在旋转振荡器(250转/分钟)上28℃保温3天。
使用培养液(Difco)以系列培养液稀释法检测BMY-46164的抗菌谱。
实施例4抗肿瘤活性研究使用小鼠动物模型检测BMY-46164作为抗肿瘤剂的抗P388白血病性能。表2中列出对橄榄霉素A和BMY-46164作比较试验的结果。
表2BMY-46164作为抗肿瘤剂的性能肿瘤:P388治疗AWC小鼠数材料和载体MG/KG/剂量、MED.%GM存活数/总数程序或稀释度S.T.T/CD.6D.5(30)移植量和部位1×10(6)细胞,IP橄榄霉素A0.8 IP,Q01D×5;115.0150-0.26/6BMY332720.414.51450.96/6PBSC39174 W000225 IP,Q01D×5;112.5125-2.14/4G443BMY461641014.0140-0.94/4DMSO+PBS515.51550.34/4214.01400.24/4对照10.01002.510/10
“TransplantedAnimalTumors”，Bradner，W.T.，CancerandChemotherapyVol.1，PP.221-227，1980(S.T.CrookeandA.W.Prestayko，eds.)AcademicPress中描述了用于得到表2所示数据的方法。
这些实施例举例说明了主题化合物及其医学上可接受的衍生物在治疗宿主的细菌性感染及恶性肿瘤中的实用性。
“宿主”不仅是指体外试验细胞和小鼠，还包括高等生物体，如哺乳动物。人被试者或病人是最优选的试验对象。
可将本发明的化合物或组合物通过各种途径给予适当宿主如患有细菌性感染和/或肿瘤的病人。给药途径包括口服、胃肠道外给药、局部或鼻内给药，以及含服或滴眼等多种方式。
在不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员可对本发明作各种可能的改动。
权利要求
1.一种生产由发酵马杜拉放线菌Q473-8菌株衍生之药理学活性化合物的方法，该方法包括下列步骤(1)发酵适当的放线菌菌株，(2)提取蛋白质类发酵产物，(3)使步骤(2)的产物变性，以及(4)分离试验式为C40H43N2O12Cl，和分子量为778的化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)和(3)是在离子交换树脂存在下完成的。
全文摘要
适当处理马杜拉放线菌Q473-8菌株的某些发酵产物，以产生具有抗菌和抗肿瘤活性的化合物。
文档编号A61K35/74GK1071950SQ9211155
公开日1993年5月12日 申请日期1992年10月20日 优先权日1991年10月22日
发明者D·R·施罗德, S·L·金, J·M·维齐 申请人:布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司