专利名称：白细胞介素-4/或白细胞介素-10的新用途及其抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用来治疗白细胞介素-2(IL-2)依赖性肿瘤细胞的增生，迟发型变态反应(DTH)和炎性肠病的组合物和方法;以及加强T细胞抑制细胞激活素产生或增加γ干扰素(IFN-γ)产生的组合物和方法。这些组合物和方法使用了白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-10(IL-10)或其混合物，或者IL-4和IL-10的拮抗剂如中和性抗体。
白血病是起源于造血细胞恶性转化的一组异源型肿瘤，并能从淋巴或骨髓细胞产生。这些转化的细胞开始在骨髓和淋巴组织中增生，在那里它们干扰正常的造血和免疫。它们也可渗透到血液中并浸润其它组织，常导致不同细胞类型的异常分布。白血病的例子包括急性淋巴性白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴性白血病(CLL)，毛状细胞白血病(hairycall)，和成熟T细胞白血病(ATL)。白血病依临床病程的性质常分为急性或慢性。
与白血病相比，淋巴瘤是主要存在于淋巴组织中的细胞的成瘤转化。淋巴瘤常被分为何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤。在何杰金氏病中，多数细胞是具有一个T细胞表现型的小淋巴细胞。所有非何杰金氏淋巴瘤病症的90%多是B细胞产生的。
这类疾病的多数治疗并不是完全成功的，而现有技术领域的研究已主要集中于化学治疗和放射治疗的使用上。然而，到目前为止，这些治疗一般不能有效地长期缓解或治愈。因此对于这类疾病，尤其是那些依赖于IL-2的肿瘤细胞的增生需要一种安全，可靠的疗法。
IFN-γ已知是巨噬细胞的一种有效激活剂，而巨噬细胞主要是抵御各种感染因素和疾病而保扩宿主。由于IFN-γ在抗感染防御中的重要作用，需要能够增长IFN-γ产生的组合物和方法。
免疫系统可进行许多自然和适应性免疫反应，这两大类被称为体液和细胞免疫反应。体液免疫广义地指通过B细胞包括浆细胞产生抗体并发挥作用。细胞免疫是通过细胞包括T-细胞，单核细胞，巨噬细胞和组织细胞而介导的。
按照不同的功能或标记，还可以把T细胞分类。如T细胞可被分作辅助性T细胞或抑制性T细胞。另外，T细胞能被激活变成细胞毒性细胞或完成其它更多特定的功能。正常地，T细胞和B细胞能相互影响，在某种程度上相互调节其它的活性。见如，Paul(ed.)FundamentalsofImmunology(2ded.)RavenPress，NewYork(1989)。
对不同的抗原，细胞反应或者体液反应一般以不相容的形式占有主要作用。某些疾病如麻风，利会曼病和一些自身免疫性类型疾病的严重程度可使一类反应比另一类反应有不相称的优势。Mosmann等，Immunol.Today8∶223(1987);Mosmann等，Ann.Rev.Immunol.7∶145(1989);Parish，Transplant.Rev13∶35(1972);和Liew，Immunol.Today10∶40(1989)。
调节免疫系统所采用的机制之一就是产生称作为细胞激活素(cytokines)的蛋白。淋巴因子是由T细胞和一些B细胞产生的细胞激活素。单核因子(monokines)是由单核细胞产生的细胞激活素。可被糖基化的细胞激活素介导许多免疫反应。
IL-4是能刺激产生抗体的B细胞生成的一种细胞激活素，它也能促进杀伤性T细胞或细胞毒性T细胞的生长。IL-4也能抑制辅助性T细胞1型(Th1)的活性。这种Th1细胞又能够抑制多数B-细胞的生成或抑制由多数B细胞产生抗体。因此，IL-4是内部调节机制的一部分。
IL-10是能够调节许多功能和效应的一种细胞激活素。IL-10已从鼠和人的细胞中分离出来并且涉及到控制辅助性T细胞(Th)不同类型或亚群的免疫反应。Th细胞可被分成为不同的亚群，这些亚群可由它们的细胞激活素产生情况来区分。
Th1细胞克隆生成白细胞介素-2(IL-2)和IFN-γ，而Th2细胞克隆分泌IL-10，IL-4和白细胞介素-5(IL-5)，一般是在被抗原或促有丝分裂植物血凝素激活之后产生上述成份。这两类Th细胞克隆都生成细胞激活素如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-3(IL-3)，和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三类型的Th细胞(Th0)同时产生IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，TNF-α，IL-3和GM-CSF。
Th1和Th2细胞的不同细胞激活素生成类型反映了它们的辅助功能。Th1细胞主要涉及迟发型变态反应，而Th2细胞与抗体产生有关。由于抗体(Th2通道)和迟发型变态反应(Th1通道)常是不相容的，Th1和Th2被看作具有交叉调节作用。由Th1产生的IFN-γ抑制Th2细胞的增殖，而由Th2细胞产生的IL-10抑制Th1细胞克隆合成细胞激活素，尤其是TFN-γ和IL-2的产生。
迟发型变态反应(DTH)是一种细胞介导的免疫反应，其特征是组织的水肿和细胞浸润，一般由T细胞和单核细胞和/或巨噬细胞介导。一些类型的细胞激活素分别与迟发型变态反应和体液免疫反应有关。Cher等，J.Immunol.138∶3688(1987);和Mosman等，(1987和1989，)。与这类反应相关的疾病可能是由相关类型的细胞激活素的不适当的产生而引起的。
炎性肠病(IBD)是指以慢性非特异性胃肠道的部分炎症为特征的一类胃肠疾病。溃疡性结肠炎和节段性回肠炎是(人类IBD中最显著的例子)。有许多症状和并发症，包括儿童生长迟缓，直肠脱垂，血便(如，黑便症和/或便血)，消瘦，缺铁，和贫血，如，缺铁性贫血和慢性疾病性或慢性炎症性贫血。
IBD的病因是溃疡。见，Wyngaarden和Smith(eds.).Cecil′sTextbookofMedicine(W.B.SaundorsCo.1985)，Berkow(ed.)TheMerckManualofDiagnosisandTherapy(MerckSarp&DohmeResearchLaboratories，1982)，和Harrison′sPrinciplesofInternalMedicine，12thEd.，McGraw-Hill，Inc.(1991)。
溃疡性结肠炎是在结肠粘膜最初表现出的一种慢性，非特异性，炎症和溃疡性疾病。它常以带血腹泻，腹部痛性痉挛，粪便中有血和粘液，不适，发烧，贫血，厌食，体重减轻，白细胞增多，血白蛋白减少，以及血沉率升高(ESR)为特征。并发症包括出血，中毒性结肠炎，中毒性巨结肠，偶发性直肠阴道瘘，和有发展为结肠癌的危险。
溃疡性结肠炎也与远离结肠的并发症有关，如关节炎，关节强硬性脊椎炎，骶髂关节炎，后葡萄膜炎，结节性红斑，疣状脓皮病，以及巩膜外层炎。治疗随疾病的严重程度和持续时间而明显不同。例如，在剧烈发作时经常使用防止脱水和电解质失调的液体疗法。另外，特殊的饮食措施有时也是有用的。药物包括各类皮质甾类。柳氮磺胺吡啶，和它们的一些衍生物，以及可能使用免疫抑制药物。
节段性回肠炎与溃疡性节肠炎共有许多特征。节段性回肠炎的区别在于，与溃疡性结肠炎的完全弥漫性损害相比，它的损害倾向于与相邻的正常肠组织完全划分开。另外，节段性回肠炎主要患于回肠(回肠炎)以及回肠和结肠(回肠结肠炎)。在一些病情中，只有结肠发生病变(肉芽肿结肠炎)而有时也涉及整个小肠(空肠回肠炎)。有很少情况，涉及到胃，十二指肠，或食管。在几乎一半的临床病例中损害包括一种类肉瘤型上皮样肉芽肿。
节段性回肠炎的损害是透壁的，包括深度溃疡，水肿和纤维化，这些能导致瘘和梗阻的形成以及脓肿的形成。尽管有时在溃疡性结肠炎中也可见到纤维化，梗阻，瘘形成和脓肿形成的并发症，但这与溃疡性结肠炎相对而言，后者通常产生更浅的损害。对这两种疾病来说目前的疗法是相似的，包括使用甾类，柳氮磺胺吡啶和其衍生物，以及免疫抑制药物如环胞菌素A，巯嘌呤和硫唑嘌呤，所有这些都能产生不需要的强烈的副作用。
由于迟发性变态反应和炎性肠病的医疗重要性，需要用于治疗这些疾病的改良的组合物和方法。
本发明提供用于治疗上面提到的疾病的组合物和方法满足了上述需要。
特别是，本发明提供了一种抑制IL-2依赖性肿瘤细胞增殖的方法，它包括给患有IL-2依赖性肿瘤细胞增殖病的哺乳动物使用一种有效剂量的IL-10。
本发明还提供了一种增加患者IFN-γ水平的方法，它包括给患者联合使用一定量的抗IL-4和IL-10的抗体，有效地增加患者的IFN-γ的产生。
本发明还进一步提供了一种治疗哺乳动物炎性肠病的方法，它包括给患有炎性肠病的哺乳动物使用有效量的IL-10。
本发明还进一步提供了一种加强抑制哺乳动物中由T细胞产生的细胞因子，它包括给哺乳动物联合使用一个有效量的IL-10和IL-4。这种治疗的哺乳动物最好是人。
本发明还提供了一种抑制哺乳动物的迟发型变态反应的方法，它包括使用有效量的IL-10。在优选实施例中，一定有效量的IL-4与IL-10联合使用。
用上述方法在给人治疗时优选使用人IL-4和IL-10。
这里所引用的全部参考文献在本发明中以其全文形式被引用。所公开的所有核酸序列按照正常的5′到3′顺序，从左到右读。用标准的单个字母缩写表示序列中的核苷酸碱基(37C.F.R.§1.822)。
细胞激活素和抗体的来源这里所使用的“白细胞介素-4”或“IL-4”是指一种蛋白，它(a)有一个基本上与国际专利申请公开号WO87/02990的
图1C中所公开的成熟人IL-4的序列一致的氨基酸序列和(b)具有与天然IL-4相同的生物活性。氨基酸序列基本相同是指与公布的专利申请所公开的序列相比其它的IL-4序列是相同的，或不同的，这种差别是基本不消弱生物活性的一个或多个氨基酸的改变(缺失，增添，取代)。
IL-4在商业可从各种来源得到，如GenzymeCorporation，Cambridge，MA.，或它能通过利用自然来源的已知方法或重组DNA方法的制得[Sheehan.等，J.Immunol.142∶884(1989)和Starnes等，J.Immunol，145∶4185(1990)]。
另一方面，可用以已知的IL-4核苷酸序列为基础的寡聚核苷酸探针混合物在用一般方法制备的基因组或cDNA文库中识别编码IL-4的DNA。这样识别出的DNA能用限制性核酸内切酶裂解的方式从基因库中切下或者用适当的引物和多聚酶链反应(PCR)的方法制备[Saike等，Science239∶487(1988)]，并在真核表达系统或(如果需要的话在用一般方法使内含子缺失之后)在原核或真核表达系统中表达并测序。当然，可以用标准表达克隆方法，代替用寡聚核苷酸探针或PCR来筛选cDNA和基因组DNA文库。这样生成的IL-4是可以通过用已知方法如免疫化学或生物测定方法检测出的。
所使用的IL-4最好是人的重组IL-4。糖基化的IL-4(如，在真核表达系统中生成的重组IL-4)以及非糖基化的蛋白(如，化学合成的或在细菌表达体系中生成的)也可以使用。
这里所用的“白细胞介素-10”或“IL-10”定义为一种蛋白，它(a)具有基本上相同于国际申请号WO91/00349中所公开的成熟(如，缺少一个分泌引导序列)IL-10的氨基酸序列，和(b)具有与天然IL-10共同的生物活性。可以使用糖基化的(例如在真核细胞如CHO细胞中生成的)和非糖基化的(如，用标准方法化学合成的或者在大肠杆菌中生成的)IL-10。还包括突变蛋白和其它类似物，包括BCRF1(埃-巴二氏病毒病毒性IL-10，也称为简单病毒性IL-10)蛋白，它具有IL-10的生物活性。国际申请公开号WO91/00349公开了许多适于测量IL-10活性的体外检测法。在这份申请中也描述了许多优选的IL-10的修饰。
适用于本发明的IL-10可从许多来源中得到。如，它能从可分泌蛋白的活化T-细胞的培养基中分离到。另外，IL-10或其活性片段能用本领域中熟知的标准技术进行化学合成。见，如，Merrifield，Science233∶341-47(1986)和Atherton等，SolidPhasePeptideSynthesis，APracticalApproach1989，I.R.L.Press，Oxford。
重组人IL-10也是一种商品，可以买到，如，从Peprotech，Inc.，RockyHill.NJ.买到。
另一方面，重组IL-10能使用已知的人IL-10或病毒IL-10序列信息按照以上所描述的用于IL-4的方法生成。制备重组人IL-10的方法已被公开，如，在国际申请公开号WO91/00349中。含有编码人IL-10的序列的克隆已于1989年12月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，并给以保藏号68191和68192。在埃-巴二氏病毒中对病毒IL-10(BCRFI蛋白)的表达和克隆已被Moore等公开[Science248∶1230(1990)]。
尽管病毒IL-10或来自一些其它哺乳动物种中的IL-10也能替代使用，但用于人的治疗最好是使用人IL-10。所用的IL-10最佳为重组人IL-10。
无论什么来源的IL-4和IL-10都能用标准方法进行纯化，这些方法包括但不限定于酸或盐沉淀法，离子交换色谱层析法，金属鳌合色谱层析法，凝胶过滤法，快速蛋白液相层析法(FPLC)，高效液相层析法(HPLC)，制备性圆盘凝胶式或幕式电泳，等电点聚焦，低温有机溶剂分馏法，逆流分配和免疫亲和性色谱层析法。
用标准方法能够制备抗IL-4和IL-10的抗体。这里所用的，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体(McABs)二者。它也包括免疫球蛋白和结合它的片断的抗原。
用IL-4或IL-10免疫接种于一种宿主动物如兔，大鼠，山羊，绵羊，小鼠等方法可产生多克隆抗体，最好是，在开始注射后给一次或多次加强注射。以增加抗体滴度。然后从动物体抽血并制备血清，并用标准方法如使用多肽作抗原的酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行筛选。用常规方法制备免疫球蛋白部分。
最好用与许多已知佐剂中的一种结合的方式和/或者在免疫接种前转化为较大形式如通过使用常规方法的交联来增加IL-4或IL-10的免疫原性。
如此免疫的动物体内产生的血清能被直接使用。另一方面，也可以用标准疗法如血浆除去法或用IgG特异吸附剂如固定的蛋白A进行吸附层析从血清中分离出IgG部分。
在本发明中优先选用的单克隆抗体能用标准方法制备，如，Kohler等所描述的方法[Nature256∶495(1975);Eur.J.Immunol.6∶511(1976)]。一般地，用上述的方法免疫动物而产生分泌抗体的体细胞。然后从免疫的动物中分离这些细胞以与骨髓瘤细胞融合。
具有产生抗体能力的体细胞，尤其是B细胞，适合与一个骨髓瘤细胞系融合。这些体细胞可从已接触抗原动物的淋巴结，脾，和外周血液中得到。常用大鼠脾细胞，主要因为这些细胞能产生一个相对高百分率的与小鼠骨髓瘤系稳定融合的。尽管如此，它可能用人，小鼠，兔，羊，山羊或其它细胞替代。
已由淋巴肿瘤制得特异性骨髓瘤细胞系以用于产生杂交瘤的融合方法中[KohlerandMilstein，Eur.J.Immunol.6∶511(1976);Shulman等，Nature276∶269(1978);Volk等，J.Virol.42∶220(1982)]。产生抗体的脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞杂交体的制备方法通常就是分别在一种或多种促进细胞膜融合的因素(化学的，病毒性的或电的)存在下以10∶1的比例(尽管这种比例可在约20∶1至1∶1范围内变化)把体细胞与骨髓瘤细胞混合。融合方法已由Kohler和Milstein，同前，Gefter等[SomaticCellGenet.3∶231(1977)]，和Volk等(J.Virol.42∶220(1982)]进行了描述。这些研究者所用的融合促进剂是仙台(Sendai)病毒和聚乙二醇(PEG)。
因为融合步骤以非常低的出现率产生活杂交体(如，当用脾作为体细胞源时，大约每1×105个脾细胞仅获得一个杂交体)，所以有必要用一种方法从剩余的非融合细胞中，尤其是从非融合的骨髓瘤细胞中选择出融合细胞杂交体。在其它所得到的融合细胞杂交体中检测所需的能产生抗体的杂交瘤的方法也是必需的。
一般地，选择融合细胞杂交体是通过在促进杂交瘤生长并阻止非融合骨髓瘤细胞(它们一般将进行无限分裂)生长的培养基中培育这些细胞而完成的。在融合中所用的体细胞在体外培养中不能维持长期的活性，因此不会出现问题。例如可以使用缺少次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT-阴性)的骨髓瘤细胞。在次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)培养基中进行以这些细胞为背景的选择，在这种培养基中由于脾细胞是HPRT-阳性基因型，这些融合细胞杂交体可以存活。也可以使用具有不同基因缺陷(药物敏感性，等)的骨髓瘤细胞，这种基因缺陷能在支持基因型竞争杂交体生长的培养基中选择。
选择性培养融合细胞杂交体需要几周时间。在这段时期的早期，必须鉴别那些能产生所需抗体的杂交体，从而能使它们继续被克隆和繁殖。一般是10%左右所得到的杂交体产生所需的抗体，但在从1左右到30%左右范围内并不少见。
对产生抗体的杂交体检测能用几种常规测定法中任何一种来完成，这些测定法包括已在文献中描述的酶联免疫分析法和放射免疫分析技术[见，如，Kennet等(编者)，MonoclonalAntibodiesandHybridomas∶ANewDimensioninBiologicalAnalyses，pp.376-384，PlenumPress，NewYork(1980)]。
一旦所需的融合细胞杂交体被选出并克隆进单独的产生抗体的细胞系中，每个细胞系可以以两种常规方式之一进行繁殖。可把杂交瘤细胞的悬浊液注射进一种组织相容性动物体中。然后被注射过的动物将产生能分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。抽取该动物的体液如血清或腹水液来制备高浓度的单克隆抗体。另一方面，可以在实验室培养容器中体外繁殖个体细胞系。用倾析，过滤或离心方法收获含有高浓度的单一特异性单克隆抗体的培养基，并接着纯化。
一旦获得能产生所需单克隆抗体的杂交瘤，就能使用一种方法来生成种间单克隆抗体，这种方法是把一个种类的结合区与其它种类抗体的非结合区结合[Lie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84∶3439(1987)]。例如，把啮齿类单克隆抗体中的CDRS移植到人抗体骨架上，从而使啮齿类抗体“人类化”[Riechmann等，Nature 332∶323(1988)]。特别是，把CDRS移植到有或没有人不变区的人抗体可变区中。已使用这类方法，如，使抗人白细胞介素-2受体的p55(Tac)亚单位鼠单克隆抗体人类化[Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶10029(1989)]。
另一方面，使用IL-4或IL-10和Banchereau等所描述的方法[Science251∶70(1991)]能够制备人单克隆抗体。
本发明也包括抗体结合片段如Fab，F(ab′)z，Fv片断等。抗体片断的使用和产生是公知的，如，Fab片断[Tijssen，PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays(Elsevier，AmsterdamFvfrogments[Hochman等，Biochemistry12∶1130(1973);Sharon等，Biochemistry15∶1591(1976);Ehrlich等，美国专利号4，335，023]和抗体半分子(AuditoreHargreaves，美国专利号4，470，925)。
本发明所用的抗体和抗体片断优选特异性结合IL-4或IL-10并中和其生物活性，这些抗体和片段就是利用它们制备的。
抑制IL-2依赖性肿瘤细胞的增殖如以下实施例中所示，人的和病毒的IL-10能直接作用于人的T细胞。当用FcrRⅡ(CD32)所转染的L细胞与抗CD3单克隆抗体或者一对促有丝分裂的抗CD2单克隆抗体合用时，发现人Th0-，Th1-和Th2样细胞的增殖反应全部可被IL-10抑制。另外，当用相关类型ⅡMHC分子转染的鼠L细胞作为APCS时，人T-细胞克隆的抗原特异性增殖反应可被IL-10所抑制。由于转染类型ⅡMHC基因的结构表达是在SV40启动子的控制下，在这个系统中，IL-10不影响ⅡMHC类型的表达。
IL-10的抑制作用主要归因于IL-10通过在mRNA水平上抑制IL-2的产生直接作用于T细胞克隆。这种抑制作用对IL-2是特异的，因为IL-10不影响IFN-γ，IL-4，IL-5和GM-CSF的产生。IL-10与IL-10受体相互作用明显启动了特异性抑制IL-2合成的信号通道。
也可以使用其它测定法来证实本发明组合物的功效。例如，使用裸鼠异种移植模型。这类模型已被用于测试各种各样的化学治疗剂[见，Howard等，CancerRes.51∶3274(1991)和McLemore等，CancerRes.47∶5132(1987)]。
这种细胞增殖是与白血病如B细胞CLL相关。使用本发明方法所治疗的哺乳动物最好是患有IL-2依赖性肿瘤细胞增殖的人类患者。
本发明抑制IL-2依赖性肿瘤细胞增殖的方法包括给哺乳动物，最好是患有肿瘤细胞增殖的人类患者使用一治疗有效剂量的IL-10。还可以使用一治疗有效剂量的第二种生物活性剂。
含有IL-10和一种生理上可接受的载体的药用组合物常常是静脉内给药。IL-10也可以被包裹在脂质体中。
这里所用的述语“IL-2依赖性肿瘤细胞增殖”被定义为任何新的或异常组织的生长，其中这种生长是不可控制的，进行性的和IL-2依赖性增殖。这种生长或者是良性的或者是恶性的。一般恶性生长特征是在肿瘤细胞中有更大程度的退行发育(反分化)。IL-2依赖性肿瘤细胞常源于淋巴或骨髓细胞系。
IL-2是由T细胞产生的，并在各种细胞类型中具有复合活性，这些细胞类型包括T细胞，NK细胞和B细胞。IL-2已被表明能用作T细胞生长剂，并且当在IL-2存在下通过刺激T细胞对细胞激动素的产生。IL-2可激活自然杀伤(NK)细胞以MHC非特异性方式杀伤靶细胞。另外，IL-2与定型细胞的膨胀有关，由此来提高这些细胞产生抗体。
基于IL-2的这些活性，在一些疾病病情中用IL-10抑制IL-2的产生是重要的。例如，在一些不需要T细胞增殖和生长的情况中可作为减少IL-2驱动的T细胞增殖的一种方法，如在自身免疫性疾病中，象自身免疫性甲状腺炎，胰岛素-依赖性糖尿病，类风湿关节炎，全身性红斑狼疮和脑脊髓多发性硬化。
另外，在治疗急性移植物与宿主疾病和慢性炎性疾病如炎性肠病，类肉瘤和肺纤维化中，IL-10减少IL-2驱动的T细胞扩大的功效具有潜在的临床用途。而且，通过抑制IL-2驱动的变态反应原特异性T细胞的增殖(这种T细胞是IL-4和IL-5的较强产生者)，可使用IL-10治疗过敏性疾病如气喘和变态反应性湿疹。
用本发明的药用组合物能够治疗的与肿瘤生长有关的疾病包括已知依赖于IL-2的白血病，如B细胞CLL和ATL。本发明药用组合物适合用于各种药物运送体系。目前药物运送方法的简要综述，见Langer，Science249∶1527(1990)。制备可给药的化合物的方法对本领域熟练技术人员是熟知的或显而易见的并已更详细地描述过例如，Remington′sPharmaceuticalScience，17thed.，MackPublishingCompany，Easton，PA(1985)。
本发明所用的IL-10可以用药学上可接受的溶剂制备成制剂，这些溶剂如，生理盐水，磷酸缓冲盐水(PBS)，林格氏溶液，右旋糖/盐水，Hank′s溶液，和葡萄糖。该组合物可以含有药学上可接受的近乎要求的生理条件的辅助物质，如缓冲剂，张力调节剂，润湿剂，洗涤剂，等等。附加剂也包括另外的活性成分，如，杀菌剂或稳定剂。给患者施用的量随给药的对象，给药的目的如预防或治疗，宿主的状态，给药的方式，等等不同而改变。
一般药物组合物是经皮肤或胃肠外给药，如，静脉内，皮下，或肌肉内。口腔给药形式也是需要的，并且可改进组合物以绕过胃环境的方式提供。该组合物能被用于预防和/或治疗疗法。该药物组合物优选静脉内给药。因此，本发明提供的组合物含有溶于或悬浮于一种可接受的载体，最好是一种含水载体中的IL-10多肽。这些组合物可用常规灭菌技术灭菌，或者可通过无菌过滤灭菌。
所得到的含水溶液可储存备用，或者被冻干，在给药前把这种冻干制剂与一种无菌含水载体结合。IL-10还可以与第二种生物活性剂如常用的化学治疗剂一起给药。这种试剂包括但并不限定为长春新碱，柔毛霉素，左旋天冬酰胺酶，mitoxantrone和胺苯吖啶。
在治疗使用中，给患者以足以抑制IL-2依赖性肿瘤细胞增殖的用量施用该药物组合物。足以产生所需功效的用量被定义为“治疗有效剂量”。IL-10的治疗有效剂量随着如，进行治疗的特定用途，给药方式，患者的健康状况，和治疗医生论断的不同而变化。例如，对一个70Kg患者连续输入的剂量一般是每天500ng左右到800μg左右的范围，优选在约1.0μg和约300μg之间。该剂量一般为700ng/Kg/天和16μg/Kg/天之间。
在药物制剂中IL-10的浓度能够较大地变动，就是，从约10μg到约5mg/ml，优选在约100μg和约2mg/ml之间。一般根据所选的特定给药方式，主要用液体体积，粘度等方法来选择浓度。这样，用于静脉内输入的常用药物组合物能被制成含有250ml右旋糖/盐水溶液和2.5mgIL-10。
对于固体组合物，可使用常规的非毒性固态载体，它包括如，药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等等。对于口腔给药，一般混合常用的赋型剂，如前面所列出的那些载体，和一般为10-95%的活性成份，也就是本发明的IL-10多肽，优选25%-75%，来形成一药学上可接受的非毒性组合物。
对于气雾剂给药，IL-10最好是以磨成细粉的形式与表面活性剂和推进剂一起使用。一般IL-10的百分率是0.01%-20%(按重量计)，优选1%-10%。当然，表面活性剂必须无毒，并最好溶于推进剂中。这类试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸酯或部分酯，如癸酸，辛酸，十二烷酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，油硬脂酸，油酸与脂族多元醇或其环状脱水物，如，乙二醇，丙三醇，丁四醇，arbitol，甘露醇，山梨醇，源于山梨醇的己糖醇脱水物形成的酯，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。可以使用混合酯类如混合的或天然的甘油酯。
表面活性剂可占有组合物重量的0.1%-20%，优选0.25-5%。组合物的余量通常推进剂。液态推进剂一般在环境条件下为气体，并在压力下被压缩。适宜的液化推进剂是含5个碳原子的低级烷烃，如丁烷和丙烷;最好是氟化的或氟氯化的烷烃。也可以使用上述的混合物。在制备气雾剂时，用适宜的推进剂填充含有磨成细粉的肽和表面活性剂的配有适当阀门的容器。将这些组分在高压下保持直到启动阀门释放出来。
为了提高该血清的半衰期，IL-10可被包裹，引入脂质体腔，制备为一种胶体，或者使用其它常规技术，这种技术能提供一个延长的肽的生存期。因而，在特定实施例中，IL-10可被包裹于脂质体中。制备脂质体可使用各种方法，如在Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9∶467(1980)，美国专利号4，235，871，4，501，728，和4，837，028中所述的。
制备完之后，按一定大小制备该脂质体从而得到所要求的大小范围和相对窄分布的脂质体体积。按一定大小把脂质体制备为所要求体积可以使用好几种技术，在美国专利号4，737，323中公开了其中的之一。
即使用最有效的包裹方法，在最初依一定大小制备好的脂质体悬浮液中也含有高达50%或者更多的自由状态的(未被包裹的)药物。从脂质体悬浮液中除去未被包裹的化合物可以用好几种方法。在一种方法中，使用高速离心法使脂质体沉淀，将游离的化合物和很小的脂质体留于上清当中。另一种方法包括用超滤法浓缩该悬浮液，然后把浓缩的脂质体再悬浮于一种替换介质中。另一方面，也能使用凝胶过滤法将溶解的分子与较大脂质体颗粒分开。
上述方法处理之后，使该脂质体悬浮液达到用于静脉内给药的所需浓度。这些方法包括把该脂质体悬浮于适当体积的注射溶媒中，其中的脂质体已用如离心法或超滤法浓缩，或者浓缩该悬浮液，其中药物分离步骤已增加了总悬浮液的体积。然后用以上所描述的过滤法对该悬浮液灭菌。含有本发明肽的脂质体可按上述方法进行胃肠外给药。
增加IFN-γ的产生当患者患有一种感染性疾病，这种疾病中由于IL-4和IL-10的产生使患者的免疫系统抑制了IFN-γ的产生时，本发明的这种方法特别有用。代表必的疾病包括内脏利什曼病;瘤型麻风;和真菌感染。典型的真菌感染包括选自于由念珠菌属;类球孢子菌病;芽生菌属;和cryptospiroidium组成的小组中的真菌属。
许多感染性生物或者直接或者间接得益于低水平的IFN-γ。这类感染常是慢性感染，其特征是Th2与Th1对感染因素的反应的不平衡。这种不平衡的结果是因Th2细胞产生IL-4和IL-10而抑制了Th1细胞产生IFN-γ。
本发明所用的抗体对患者来说最好是自体的。也可以用源于同种细胞的非自身抗体。也能使用不同种的抗体，但是指用来控制可能不利的免疫反应(HAMA)的抗体。例如，人类化的鼠抗体能够使人类患者中的免疫反应降低到最小，和各种结合片断所达到的效果一样。这种抗体最好具有近似或超过IL-4和IL-10与它们天然受体亲和力的结合常数。
优选使用的抗体具有大于这些细胞激活素与它们相应受体亲和力不到100倍的结合常数。使用标准的平均方法进行结合对照。这些基本技术在Immunochemistry，Fd，D.M.Weir编，第4版，1986，BlackwellScientificPubl.第1卷第25章25.1-25.30中有描述。另一方面，使用一种检测方法来测定剩余抗体的克分子量，这种抗体在一般的体外生物检定中能亲和一定量的IL-4或IL-10。这类检定方法的例子可见于Mosmann等，J.Immunol.Methods116∶151(1989)(IL-4)和Fiorentino等，J.Exp.Med.170∶2081(1989)。能够亲和定量IL-4或IL-10的那些抗体的合理范围是在10到1000倍剩余量间。
这里所用术语“联合给药”是指尽可能地将抗IL-4的抗体和IL-10的抗体在时间上接近使用，从而使它们在患者体内同时存在。施用的特定次序并不重要，或者用预先混合法或者用分别给药的方式同时或者分别使用这些抗体。
给药方式通常是胃肠外，最好是静脉内。使用一般静脉内给药技术把这种抗体输入患者体内。首先把该抗体悬浮于一种无菌的，生理上相容的溶媒中如，磷酸缓冲盐水。除该抗体外也可以包括药学上可接受的赋型剂如卵磷脂，葡萄糖，在旋糖，抗菌素。
联合给药的抗体用量范围是每种抗体1-10mg/Kg体重。理想的是以一定的用量使用抗体，这种用量对每种抗体来说都能提供约1-150μg/ml，优选10-100μg/ml血清的循环含量。该抗体一般有2-7天的半衰期，当每种抗体之一的含量下降到低于所需含量时，重复给药是合适的。使用常规的免疫检测法优选ELISA检测法能够测得血清样品中的抗体含量。
尽管抗IL-4和IL-10的单克隆抗体被用来详细说明本发明的具体实施，但也能使用其它的缬抗剂。例如，能够使用与IL-4或IL-10受体特异性结合并由此抑制细胞激活素结合的抗体。同样地，能够使用溶解形式的缺少横跨膜区的IL-4和IL-10受体，最后，也能使用突变拮抗剂形式的IL-4和IL-10，能与相应受体较强结合但基本上没有生物活性。一种IL-4突变型拮抗剂已被Kruse等描述[EMBOJ.11∶3237(1992)]，其中野生型人IL-4的124位酪氨酸残基已被天冬氨酸残基取代。
优选使用一种无菌含水混合物，静脉内联合使用该拮抗剂。该混合物可以含有任何药学上可接受的赋型剂，如无菌缓冲液，盐水，抗菌素等等。
当根据患者临床反应测定感染被控制时，一般就结束治疗。常规的抗菌治疗也可以与本发明联合使用。
炎性肠病这里所用的术语“炎性肠病”或“IBD”包括溃疡性结肠炎和书段性回肠炎。使用IL-10治疗IBD最好是胃肠外给药，如血管内给药。最佳给药是静脉内给药并且所治疗的哺乳动物是人。
所使用的IL-10的用量一般在每4克体重约1μg到约100mg的范围内。通常，该范围是每千克体重约10μg到约1000μg。最佳的是，使用每千克体重约50μg到约100μg的剂量。
IL-10能被单独使用或者与一种或多种辅助治疗剂联合使用。用于控制肠组织的节段性炎症的这类试剂的例子包括皮质甾类，柳氮磺胺吡啶及其衍生物，免疫抑制药物如环孢菌素A，巯嘌呤，和硫唑嘌呤，以及其它的细胞激活素。该联合用药可以顺次进行或者同时进行。联合用药常指在特定时间间隔期间多种(两种或更多)治疗剂存在于接受者中。一般如果第二种试剂在第一种试剂的半衰期内给药的话，就认为这两种试剂被联合使用。
本发明还提供一种预测哺乳动物以IL-10含量不适为特征的炎性状况发展倾向的方法，它包括检测从该哺乳动物得到的样本的IL-10含量。这种不适含量包括测定不出的量。可测定的含量可以与已知正常的IL-10的含量相比较。另一方面，人们使用商业上可买得的诊断药盒来测定炎性介质如IL-1，IL-6，TNF，和IFN-γ。
这些介质之一的生产过剩能够表明IL-10的含量不足。最好以血液为样本来源。这种方法可以用来预测许多炎症状态的倾向，如IBD，贫血，关节炎，皮炎，或者与IBD相关的其它症状。
也提供了药物组合物。给患有IBD，如溃疡性结肠炎或节段性回肠炎的哺乳动物使用的组合物包括一定用量的能有效改善哺乳动物至少一种IBD症状或指征的IL-10，以及如上所述的药学上可接受的载体。
一般情况下，术语“症状”是指疾病或者患者的状况的任何主观性表现。它包括患者感觉到的表现。IBD症状的例子包括腹泻，腹痛，发烧，黑粪，便血和体重减轻。术语“指征”常指疾病或状况的任何客观表现，常常由检查医生所发觉或者在实验室评价或其它检查如超声波检查或放射线检查而呈现的特征。
IBD指征的一些例子包括腹部肿块，舌炎，口腔溃疡，肛裂，肛瘘，贫血，吸收障碍和缺铁。有时，指征和症状相同。例如，患者陈诉血便(一个症状)，而粪便实验室检查便血为阳性(一个指征)。
本发明这种实施例的药物组合物最好是适合于胃肠外给药的形式。有效用量最好是存在于一个安瓿的单位剂量。另一方面，有效用量也能存放于含多个剂量单位的小瓶中或者它能以一些其它方式来提供。药学上可接受的附加剂例子包括载体如含水载体，缓冲剂，稀释剂，抗菌剂和防腐剂。
也可用细胞激活素本身的生物检测法来测定IL-10的活性。人淋巴细胞毒素的生物检测法在Aggarwal，MethodsinEnzymology116∶441(1985)和Matthews，等，(Clemens，等，eds.)，CytokinesandInterferons;APracticalApproach∶pp.221-225(IRLPress，Washington，D.C.1989)中进行了描述。人IL-2和GM-CSF能用因子依赖性细胞系CTLL-2和KG-1检测，细胞系CTLL-2和KG-1可从ATCC得到，保藏号分别为TIB214和CCL246。利用人IL-3刺激软琼脂培养基中造血细胞集落大范围生成的能力可测定人的IL-3，如，Metclaf，“TheHemopoieticColonyStimulatingFactors”(Elsevier，Amsterdam，1984)所描述的。用抗病毒检测法可定量IFN-γ，如，MeagerinClemens，等，(eds.)在129-147页。当使用了有效量的IL-10时，对这些细胞激活素的监测能够提供有用的信息。也能使用免疫化学检测法如ELISA。
可以在含有或没有各种附加剂和/或稀释剂的含水载体如水，盐水或缓冲载体中使用IL-10。另一方面，也能够制备含有IL-10的悬浮液，如锌的悬浮液。这类悬浮液能被用来皮下(SQ)或肌肉内(IM)注射。IL-10和附加剂的比例能在较宽范围内变化，只要二者以有效用量存在即可。以每个剂量为单位，IL-10的用量是从约1微克(μg)到约100毫克(mg)范围变化。
每日总剂量一般从每千克体重约1μg到约100mg范围内变化。该剂量最好选于每千克体重约10μg到约1000μg范围内。最佳的剂量是选于约50μg到约100μg每千克体重的范围。按照能产生所希望的治疗效果的计划来使用剂量，并在较短或较长期间内是周期性的，或按照这类炎症的节段性所示不规则地使用。
组合物可被口服或注射到体内吸收。口服使用的制剂包括能保护多肽免受胃肠道中产生的蛋白酶破坏的化合物。注射常是肌肉内，皮下，皮内或静脉内注射。另一方面，关节内注射或其它途径也能在适宜条件下使用。另外，含有IL-10的组合物也可被植入给患者或用药物运送系注射。见，如Urquhart，等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24∶199(1984);Lewis，ed.“ControlledReleaseofPesticidesandPharmaceuticals”(PlenumPress，NewYork，1981);美国专利号3，773，919和3，270，960。
该肽最好是胃肠外给药，并优选以单位剂量的注射形式给药。注射形式的例子包括溶液，悬浮液和乳浊液。最佳的是静脉内给药有效用量的IL-10。
这里的词组“有效用量”被定义为一种足以改善自身免疫病态的症状或指征或改善不理想的或不适的炎性或免疫反应的症状或指征的用量。典型的哺乳类宿主包括小鼠，大鼠，猫，狗和灵长类。以及人。对特定患者的有效用量随各种因素如被治疗的状态，患者全身健康状况，给药的方法，途径和剂量，以及副作用的严重程度的不同而变化。
适宜剂量的测定是使用本领域已知参数由临床医生进行。一般，开始用少于最佳剂量的某一用量开始给药，然后逐渐增加剂量直到获得所希望的或理想的效果。常见，The Merck Manual § 269“Pharmacokinetics and Drug Administration”。当达到有效剂量时TNF2，IFN-γ，IL-1和IL-6的含量是重要的指示剂。最好使用源于所治疗的哺乳动物种的IL-10。
一般地，IL-10与一种药物载体共同被注射，这些药物载体如普通盐水，林格氏溶液，右旋糖溶液，和其它本领域中已知的含水载体。也可以使用合适的不含水载体，例子包括不易挥发的油类和油酸乙酯。优选的载体是5%右旋糖的盐水。在该载体中常包括附加剂如缓冲剂和防腐剂或其它物质来提高等渗性和化学稳定性。
每日总剂量可一次注射或连续输入。另一方面，也可以把每日总剂量分为好几个较小剂量来静脉药团给药或通过其它途径如肌肉内注射给药。IL-10最好是以静脉药团的形式给药。
IL-10可被单独使用或与其它治疗剂结合使用。用在肠炎适应症中的这类试剂例子包括皮质甾类，柳氮磺胺吡啶，和柳氮磺胺吡啶的衍生物，以及选择的细胞毒素药物如环孢菌素A，巯嘌呤和硫唑嘌呤。一般复合药物是被分别输入或依次注射。在合适情况下，把复合药物混合并一起同时输入或注射，如，IL-10与其它细胞激活素，甾类或其它治疗试剂共用。
应当清楚IBD症状可以是发作性的，因而在适当时候使用小剂量就可获得有效治疗。另一方面，小量连续用药可以给患病的靶动物提供长期无发作的健康。
这种联合用药能够同时或依次进行。通常，“联合用药”指的是在一个特定时间间隔期间两种细胞激动素共存于患者体中。一般如果第二种细胞激活素在所使用的第一种细胞激活素的半衰期内使用，这两种细胞激活素是在联合用药。优选是胃肠外联合用药，更优选的是静脉内给药。有效用量选自每千克哺乳动物体重约15μg到约1500μg范围。
迟发型变态反应的抑制本发明的实施例提供了一种抑制哺乳动物体内迟发型变态反应的方法，它包括给该哺乳动物使用有效的IL-10。有效量的IL-4能够与IL-10联合用药给该哺乳动物，该哺乳动物一般是人。IL-4和IL-10联合用药能够同时或依次进行。通常，给药是胃肠外方式，最好为血管内方式。
另外，本发明也提供了抑制哺乳动物体内细胞向炎症部位迁移的方法。该细胞迁移指的是把哺乳动物的细胞免疫反应包括淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞募集或吸引到炎症部位。还提供了抑制哺乳动物组织肿胀的方法。
上述方法包括胃肠外如血管内或者在局部炎症附近使用IL-4和/或IL-10。IL-4或IL-10之一的有效用量常选自每千克哺乳动物体重约15μg到约1500μg的范围。
本发明进一步提供了限制哺乳动物体内迟发型免疫反应的方法，它包括给该哺乳动物联合使用有效用量的IL-4和IL-10之一，其中联合用药是胃肠外进行的而有效用量是选自约15μg到约1500μg每千克该哺乳动物的体重范围内。该有效用量选自约100μ到1000μg范围。
另外，本发明包括一种药盒，以用于加强哺乳动物体内IL-10介导的对T细胞产生细胞激活素的抑制。该药盒包含一个含有单位剂量的IL-4和IL-10混合物的安瓿。也能用其它一些容器代替安瓿。这些容器的例子包括小瓶，塑料袋，玻璃试管，等等。IL-4和IL-10的混合物最好是适于胃肠外给药的形式。IL-4和IL-10每种的单位剂量常选自约15μg到约1500μg每千克该哺乳动物的体重的范围。
本发明的基本原理是IL-4和IL-10协同作用于T-细胞活性。本发明首次表明这种配合作用与T-细胞特别相关。以前的数据已表明对巨噬细胞或单核细胞和巨噬细胞的效应子作用有影响。IL-4和I-10的叠加作用是出人意料的，并支持特别是与细胞介导的免疫相关的辅助治疗用途。因为IL-4和IL-10的结合使用加强了IL-10介导的对T-细胞细胞激活素产生的抑制，无论何时需要控制与细胞激活素相关的T细胞反应，本发明都是有用的。例如包括作用于迟发型变态反应，细胞介导的炎症和T-细胞的增殖和活化。
例如，自身免疫疾病糖尿病Ⅰ型是以淋巴细胞，巨噬细胞和血浆细胞对胰岛细胞的浸润为特征的。通过抑制T-细胞对细胞激活素的产生可以改善这种症状和糖尿病中胰岛细胞的破坏。此外，本发明在涉及器官移植和移植物的细胞介导的免疫反应的治疗中也起作用。
肾排斥已知包括细胞免疫。在移植肾区的细胞激活素能引起细胞活化，增殖，集聚，纤维化，生长抑制和细胞毒性。同样地，本发明在GVHD的治疗中起着有益的作用。而且，类肉瘤病，一种淋巴细胞增殖性疾病，也是与DTH降低和激活的T或辅助细胞有关，后来继发形成肉芽肿。
实施例用下列非限定实施例来详细说明本发明。除非另有说明，以下所给出的固体在固态混合物中，液体在液体中和固体在液体中的百分比分别是重量/重量(wt/wt)，体积/体积(vol/vol)，和重量/体积(wt/vol)比。
IL-2-依赖性肿瘤细胞增殖的抑制实施例1-IL-10抑制用交联到CD32转染的鼠L细胞上的抗-CD3单克隆抗体活化后的人Th0，Th1和Th2“样”克隆的增殖。
细胞和细胞系所用的T细胞系是CD2+，CD3+，CD4+和CD8-。克隆HY-06，827和837以前已有描述[Yssel等，Eur.J.Immunol.16∶1187(1986)和Haanen，等J.Exp.Med.174∶583(1991)]。T细胞克隆827识别HLA-DR3菌肉中的破伤风毒素(TT)而T细胞克隆HY-06识别来源于麻风杆菌65KD热休克蛋白的肽2-12。T细胞克隆837的抗原特异性是未知的。
T细胞克隆SP-B21和SP-A3是从患有严重的综合性免疫缺陷症(SCID)患者中获得，该患者是经胎儿胸腺和胎儿肝脏的移植而成功恢复的(Roncarolo，等。J.Exp.Med.168∶2139(1988))。T细胞克隆NP12，NP14和NP44是从PBMC建立的，它特异性地对DerpI分子的p89-117肽(一种室内尘螨的主要变应原)产生反应而增殖(Yssel，等，J.Immunol.148∶738(1992))。T细胞克隆CR253，CR378，CR380，AP74和AP75是从患有慢性Lyme关节炎的患者的PBMC中分离的，并可与Borreliaburgdorferi60KD热休克蛋白同源物(HSP60)反应[Shanafelt，等，J.Immunol.146∶3985(1991)]。
根据这些T细胞克隆的淋巴因子生成情况(表1)将它们分为T辅助亚群，如上所述[Spits，et al.，J.Immunol.128∶95(1982)]，在24孔Linbro平板(Flow，Mc lean，VA)上以两周的时间间隔用一种喂养细胞混合物激发T细胞克隆(2×105个细胞数/ml)，该混合物是由106/ml照射过的(4000rad)同种外周血液白细胞(PBL)，105/ml照射过的(5000rad)埃-巴二氏病毒转化的B细胞系(EBV-LCL)JY细胞，和0.1mg/ml纯化的PHA(Wellcome Diagnostics，Beckenham，Kent，UK)组成。每次重新激发后三到四天，把该培养物分开并在含有20U/ml rIL-2的培养基中进一步扩展。在Yssel′s培养基(Yssel，等，J.Immunol.Methods 72∶219(1984))中培养所有克隆的T细胞系和EBV-LCL，用1%的人AB+血清来补充培养基。
如这里引用为参考文献的Peltz，J.Immunol.141∶1891(1988)中所述制备用CD32(FcrRⅡ)(16.2CG7)转染的鼠L细胞。简单地说，使用一个FcrRⅡcDNA克隆，16.2，它是分离于人的单核细胞系U937突变型(见，Stuart等，J.Exp.Med.166∶1668(1987))。使用标准的位点特异诱变技术，通过诱导突变构建缺少细胞质区的突变体，这种突变将在预测胞质区的第一个氨基酸(精氨酸)之后的两个赖氨酸密码子改变为终止密码子。按照常规技术进行鼠L细胞的瞬时转染。
试剂按照在deWaalMalefyt等J.Exp.Med.174∶915(1991)和WO/91/00349上所描述的方法在大肠杆菌中表达并纯化重组体IL-10。
增殖的检测使用由喂养细胞激活10到12天后的克隆的T细胞，在这个阶段T细胞克隆较小并处于“休息”状态。在200μl平底平板(Falcon，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)上有抗-CD3 mAbs(SPV-T3b)(1μg/ml)[Spites，等，Hybridoma 2∶423(1983)]存在下用CD32转染的L细胞(2×104细胞数/孔)孵育T细胞克隆(2×104细胞数/孔)。加入T细胞之前在有或无IL-100(100U/ml)存在下用mAbs(1μg/ml)预先与L细胞一起保温1小时，然后再培养72小时。在37℃用丝裂霉素C(50mg/ml)(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)处理L细胞45分钟并在使用前依次洗涤四次。在37℃和5%CO2条件下孵育细胞72小时，用[3H]TdR脉冲4小时，并如前Yssel，等，Fur.J.Immunol.16∶1187(1986)中所述的方法收获。结果用[3H]TdR掺合物的cpm来表达，并代表了三次培养物的平均值。
IL-10对T细胞克隆增殖的作用并不依据T细胞淋巴因子产生模式而变化。在激活时T细胞克隆837，SP-B21和827能够产生IL-2，IL-4，IFN-γ，所以它们被认为代表人Th0克隆。HY-06，CR253，CR378，CR380，AP74和AP75能产生高含量的IFN-γ和测定不出的或低含量的IL-4和IL-5。这些克隆被认为是代表人Th1类克隆，而NP12和NP44代表人Th2类克隆，因为它们由特异性抗原激活后能产生高含量的IL-4和IL-5以及测定不出的或低含量的IFN-Y。T细胞克隆SP-A3被激活后能产生IL-2，IL-5，IFN-γ和GM-CSF，但不能产生IL-4。
如表1所示，IL-10抑制了激活后T细胞克隆837，SP-B21，SP-A3，827，HY-06，CR253，CR378，CR380，AP74，AP75，NP12和NP44的增殖。因此，IL-10能够抑制属于全部T辅助亚群的T细胞克隆的增殖。一般，IL-10在本实验条件下抑制了20-50%的T细胞克隆的增殖。由于用中和性抗-IL-10mAb19F1可逆转这种抑制，所以这种抑制是剂量依赖性和特异性的。
表1IL-10对用交联到CD32(FcrRⅡ)转染的L细胞上的抗-CD3mAbs激活后的人Th0，Th1和Th2克隆增殖反应的作用[3H]TdR掺入(cpm×10-3)T细胞克隆类型T细胞克隆对照+IL-10(100U/ml)T辅助08376951SP-B2188518275.53.5SP-A32812T辅助1HY-06118CR25312.810CR37814.94.3CR38019.88.5AP74229AP753833T辅助2NP127249NP4415.37种属特异性鼠的IL-10对这些人T细胞克隆的增殖没有作用。这表明IL-10是直接作用于T细胞克隆而不是通过用于交联抗-CD3mAbs的CD32转染鼠L细胞实现的。这些结果表示IL-10直接抑制由TCR/CD3复合物激活后的人Th0，Th1和Th2克隆的增殖，该复合物是由抗-CD3mAbs与CD32转染的L细胞交联而得到。
实施例2 在不依赖于由ICAM-1，LFA-3或B7所提供的共同刺激信号情况下IL-10可抑制CD4+T细胞克隆的增殖。
通过T细胞上的附属分子与其在抗原存在细胞(APC)上的相应结构的相互作用来调整人的T细胞克隆的活化。已经表明LFA-1和ICAMI，CD2和LFA3，CD28和B7，或CTLA-4和B7之间的相互作用可提供共同刺激信号来增强T细胞的增殖和效应因子作用。为了判断是否IL-10是通过影响这些附属分子的共同刺激功能来抑制T细胞的增殖，构建表达CD32和ICAM-1，LFA-3或B7的L细胞。
构建pCD-SRα-LFA-3HYG，pCDM8-ICAM-1HYG和pBJ-B7HYG用LFA-3特异性引物通过PCR扩增从一种RajicDNA文库中获得LFA-3cDNA。如前所述在pCD-SRa载体中构建RajicDNA库。Matsui等，Science154∶1788(1991)。用下列引物来克隆LFA-3的横跨膜形式有意链5′-GGCTGCAGCGACGAGCCATGGTTGCTGGGAGCGACGCG-3′(nt1-30)和反意链5′-TTCATCTTCTGGTACCAATCAATTGGAGTTGGTTC-3′(nt780-745)。
用Pst-Ⅰ用Pst-Ⅰ位点来设计LFA-3有意义引物并用Kpn-1位点来设计LFA-3反意引物以便于亚克隆扩增的产物。在下列条件下进行扩增在一种50μl反应液中扩增1μmHind-Ⅲ消化的Raji文库的质粒DNA，这种反应液含有25nmole的每种引物，125mM的每种dGTP，dATP，dCTP和dTTP(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，50mM KCl，10mM tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2mg/ml动物胶和5个单位的Taq聚合酶(IBI，New Haven，CT)。
在一种Perkin-Elmer/Cetus DNA热循环器中保温该混合物20个循环(94℃变性30秒，55℃退火30秒72℃扩充60秒)。取出5μl等分试样并在相同条件下进行第二轮扩增。用CHCl3提取该反应液并放在1%的琼脂糖凝胶上。展开分离之后从该凝胶上切下具有785bp所需大小的扩增产物，通过用一种Geneclean药盒(Bio101，La Jolla，CA)吸附硅胶到硅胶上分离，用Pst-1和Kpn-1切割，并亚克隆于BluescriptⅡ ks(+)中(Stratagene，La Jolla，CA)。
用常规技术分离含LFA-3的许多克隆，并用一种序列酶DNA测序仪(USB，Cleveland，OH)以双脱氧终止方法对4个克隆进行测序。所有四个克隆与所公开的顺序100%的一致。分离这些克隆之一的Pst-1-Kpn-1片断，并亚克隆于pCD-SRa292表达载体中(Matsui等，同上述)。
pCDM8-ICAM-1[Blanchard等，J.Immunol，138∶2417(1987)]，由Dr.BrianSeed(MassachusettsGeneralHospital，Boston，MA)馈赠。将编码潮霉素-B抗性的氨基环醇磷酸转移酶基因置于SV-40启动子和多聚腺苷信号控制下，并用常规技术插入pCD-SRα-LFA-3和pCDM8-ICAM-1的Sfi-Ⅰ的位点，分别获得pCD-SRα-LFA-3HYG和pCDM8-ICAM-1HYG。pB7-B7-HYG含有在SRα启动子控制下的人B7，Makgoba等，Nature331∶86(1988)，并且由L.Lanier博士(DNAXResearchInstitute)馈赠。
按照厂家说明以脂转染(lipofection)(BRL，Gaithersburg，MD)方式用pCD-SRα-LFA-3-HYG，pCDM8-ICAM-1-HYG或pBJ-B7-HYG转染表达HLA-DR3或CD32的L细胞。转染后48小时分离细胞并加入含200μg/ml潮霉素-B(Lilly，Indianapolis，IN)的培养基，且每隔三天进行更换。
12天后可见抗潮霉素-B的个体集落。汇集这些细胞，用直接免疫荧光染色来显示LFA-3，ICAM-1或B7，并在FACSStarPlus上经两轮连续的阳性分离来纯化。把共同转染的细胞系保持于用200μg/ml潮霉素-B和10%FCS补充的RPMI-1640。
为了FACS分析，在有纯化mAb(10μg/ml)的V-底微量滴度板(FlowLaboratories，McLean，VA)上4℃孵育细胞30分钟。用含有0.02mM叠氮化钠和1%BSA(Sigma，St，Louis，MO)的PBS洗涤两次之后，用FITC标记的山羊抗-鼠抗体(TAGO，Inc，Burlingame，CA)F(ab′)2片断的1/40稀释液在4℃孵育该细胞30分钟。另外洗涤三次后，在FACScan(BectonDickinson，Sunnyvale，CA)上用流动显微荧光测定法(FMF)分析所标记的细胞样本。使用在Krensky，等，J.Immunol.132∶2180(1984)中描述的抗LFA-3mAbTS2/9。所使用的抗-ICAM-1mAbLB2和抗-B7mAbL307在Azuma，等，J.Exp.Med.175∶353(1992)中已被描述。
在有或无IL-10存在下，由交联于共同表达CD32和ICAM-1，LFA-3或7的L细胞上的抗-CD3或抗-CD2mAbs来激活T细胞克隆。已经发现当用由CD32转染的且共同表达ICAM-1和LFA-3的L细胞所携带的抗-CD3mAbs激化克隆时，提高了T细胞克隆SP-B21和NP12的增殖。在提高T细胞克隆的增殖方面与ICAM-1或B7比较，LFA-3的共同表达是更有效的，所产生的一直性结果是使增殖增加2到4倍。由ICAM-1的共同表达仅观察到引起中等程度的增殖提高。B7一般不影响T细胞克隆的增殖。
即使在ICAM-1，LFA-3和B7存在下，IL-10也能抑制由交联于CD32转染的L细胞上的抗-CD3mAbs激活之后的T细胞克隆的增殖反应。尽管如此，IL-10对由表达LFA-3的LCD32细胞激活的T细胞克隆增殖的抑制还是不太显著的。
对T细胞克隆SP-B21和NP-12来说，由交联于LCD32细胞上的抗-CD2 mAbs的促有丝分裂结合物也能诱发T细胞克隆的增殖。如上所述，在200μl圆底平板(Linbro，Flow laboratories，Mc.Lean，VA)上，用抗-CD2mAbs Ⅻ-1(0.5mg/ml)和D66(0.5mg/ml)激活T细胞克隆(2×104细胞/孔)。在Brottier，J.Immunol.135∶1624(1985)中描述了这些抗体的产生。
当ICAM-1或LFA-3被共同表达时，也不影响T细胞的增殖。然而，当用共同表达CD32和B7的L细胞时，可观察到一个中等程度提高的增殖。当使用表达CD32和ICAM-1，LFA-3或B7的L细胞时，在IL-10存在下也能抑制30-50%抗-CD2诱发的T细胞克隆增殖。IL-10并不影响T细胞克隆对LFA-1，CD2或CD28的表达。总之，这些结果表明IL-10对T细胞增殖的直接抑制作用不是由ICAM-1，LFA-3或B7提供的共同刺激信号的变化引起的。
实施例3-IL-2，而不是IL-4，能够逆转IL-10对T细胞增殖的抑制为了确定是加入IL-2还是IL-4能够逆转由IL-10诱导的对T细胞增殖的抑制，在IL-2或IL-4存在下用交联于表达CD32和ICAM-1，LFA-3或B7的L细胞上的抗-CD3或抗-CD2mAbs激活T细胞克隆。加入20U/ml IL-2和200μ/ml IL-4。由Schering-Plough Research(Bloomfield，NJ)提供纯化的人的γ-IL-4(特异活性2×107U/mg)。
已发现以低浓度加入IL-2能够完全逆转IL-10对T细胞克隆SP-B21和NP-12的增殖的抑制作用。然而，以200U/ml的浓度所加的IL-4不能逆转IL-10对T细胞增殖的抑制作用。在IL-10存在下培养T细胞克隆达72小时也不能导致IL-2受体α或β链表达的低调节(downregulation)。此外，在IL-10存在下用PHA激活T细胞克隆并不影响诱导IL-2受体α和β链表达。使用的抗-IL-2RαmAbBB10在Herve等，Blood75∶1017(1990)中被描述。也可以用在Takeshita，J.Exp.Med.169∶1323(1989)中所描述的抗-IL-2RβmAbTu27。总之，这些结果表明IL-10对T细胞增殖的抑制作用可被IL-2，而不是IL-4逆转，并且IL-10的这种抑制作用可能是由抑制IL-2的产生造成的。
实施例4-IL-10抑制人T细胞克隆对IL-2的产生，而不抑制对IL-4，IL-5，IFN-γ和GM-CSF的产生。
为了确定IL-10对T细胞克隆增殖的直接抑制作用是否归因于抑制IL-2的产生，在有IL-10存在或有IL-10存在下，用交联于CD32和ICAM-1，LFA-3，或B7转染的L细胞上的抗-CD3mAbs激活T细胞克隆837，SP-B21，827，HY-06，CR253，NP12和NP4424小时，并用细胞激活素-特异性ELISA测定IL-2，IL-4，IL-5，IFN-γ和GM-CSF的产生。这些ELISA的敏感度为IL-2，10pg/ml;IL-4，50pg/ml;IL-5，50pg/ml;INF-γ，300pg/ml;以及GM-CSF，50pg/ml。
为测定淋巴因子的产生，如上所述用喂养细胞激活T细胞克隆10-12天后，收集之。在37℃5%CO2的湿润气氛中孵育细胞24小时，收获培养物上清液，以250xg离心，等分试样，并且在试验之前存放于-20℃。
对T细胞克隆的激活依其适宜的Th细胞亚群细胞激活素产生情况而导致了IL-2，IL-4，IL-5，GM-CSF和IFN-γ的产生。一般当由表达CD32和LFA-3或B7的L细胞激活T细胞克隆时，可测出最高含量的细胞激活素产生。实际上，在由LCD32-LFA-3和LCD32-B7转染子上的抗-CD3激活的T细胞克隆上清液中主要测得IL-2的产生。IL-10强裂地抑制T细胞克隆对IL-2的产生。IL-10并不影响IL-4的产生，而IL-10仅仅轻微地抑制IL-5，GM-CSF和IFN-γ的产生。因此IL-10特异性地抑制活化人T细胞克隆对IL-2的产生。
实施例5-IL-10抑制多克隆激活后的人T细胞克隆对IL-2的产生。
为进一步确定是否IL-10能够直接作用于人的T细胞克隆来抑制淋巴因子的产生，在没有附属细胞存在下用乙酸十四烷酰佛波醇酯(TPA)(Calbiochem)，抗-CD3mAbs和TPA，PHA和TPA，或抗-CD2mAbs的促有丝分裂结合物激活T细胞克隆827，SP-B21和NP44。以1×106细胞/ml浓度用PHA(100ng/ml)，抗-CD3mAb SPV-T3b(1μg/ml)和TPA(1ng/ml)来刺激T细胞克隆。
如表2所示，按照T细胞克隆827，SP-B21，和NP44的淋巴因子产生的概况，多克隆激活的这些T细胞克隆导致高含量淋巴因子的产生。IL-10强烈地抑制这些T细胞克隆以所有被测试的方式对IL-2的产生，而对IL-4，IL-5，IFN-γ和GM-CSF的产生并不受影响。IL-10能够抑制由抗-CD3+TPA和Ca++离子载体+TPA激活后的这些T细胞对IL-2的产生，这表明抑制机理不涉及T细胞受体/CD3信号转导通道，并且这种机理作用于蛋白激酶C激活下游。
实施例6-IL-10在mRNA的水平上抑制人T细胞克隆对IL-2的产生为了判断IL-10在什么水平上抑制IL-2的产生，在没有或有IL-10存在下，用Northern印迹分析被抗-CD3mAbs和TPA激活后的T细胞克隆NP-12，HY-06，827，SP-A3，837和SP-B21中的表达IL-2，IL-4，IL-5和IFN-γmRNA。用Chirgwin，等，Biochem.18∶5294(1979)的方法分离总RNA。按deWaalMalefyt，J.Immunol.142∶3634(1989)所述进行Northern分析。
将下列探针用于Northern分析在Yokota，等，InLymphokines13(1987)中所述的pCD-hIL-2的285bpPst-I-Xba-I片断(nt1-285);在Yokota，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83∶5894(1986)中所描述的pCD-hIL-4的318bpNhe-I-EcoRI片断(nt106-424);上述Yokota所述的pCD-hIFN-γ的1100bpPst-I-Hinc-Ⅱ片断(nt5-1106);和deWaalMalefyt，等，J.Immunol.145∶2297(1990)中所述的pAL的1200bpPst-I片断。
IL-10可强烈抑制在这些克隆中表达的IL-2mRNA的水平，但不影响Th0-和Th2-样克隆对IL-4和IL-5的表达，或者Th0-和Th1-样克隆对IFN-γ的表达。这些结果表明了IL-10在mRNA的水平上特异性地抑制人T细胞克隆对IL-2的产生。
实施例7-IL-10抑制从外周血液细胞中分离T细胞对IL-2的产生测定IL-10是否能抑制静止T细胞的增殖和对IL-2的产生。从外周血液中分离T细胞，并用交联于只用CD32转染的L细胞或同时表达ICAM-1，LFA-3或B7的CD32L细胞上的抗-CD3或抗-CD2mAbs激活。按照Boyum，A.，Scan.J.Clin.Lab.Invest.21(Suppl97)∶77(1968)所述的密度梯度在Ficoll-Hypaque(SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)上离心从健康供血者的血沉棕黄层中分离总PBMNC。
用塑料吸附通过尼龙纤维柱，并用去磁法阴性选择来从PBMNC中纯化T细胞。简要地说，在100mm组织培养皿(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中用1%人AB血清补充的Yssel′s培养基在37℃培育100×106PBMNC 30分钟。取出未被吸附的细胞，并通过尼龙纤维(Robbins Scientific，Sunnyvale，CA)柱[Julius，等，Eur.J.Immunol.3∶645(1973)]。然后用抗-CD14(Leu M3)，CD16(Leu 11a)，CD19(Leu 12)和CD56(Leu19)mAbs的饱和浓缩液在4℃孵育细胞30分钟，洗涤并用羊-抗-鼠IgG包裹的磁珠(Dynabeads.M450，Dynal A.S.，Oslo，Norway)以珠与细胞40∶1的比例孵育。
在轻微振荡下4℃孵育该混合物30分钟并按照厂家的建议用磁性颗粒聚集器除去玫瑰花结样细胞。T细胞群是97-99%CD2+，CD3+。从Becton Dickinson，Mountain View，CA购买抗-CD14(Leu-M3)CD16(Leu 11a)，CD19(Leu 12)，和CD56(Leu 19)mAbs和适宜同型的对照mAbs。
如上所述方法用交联于LFcrRⅡ细胞转染子上的抗-CD3或抗-CD2mAbs刺激PBMNC T细胞(2×105个细胞/孔)。在37℃24小时孵育后收获培养物的上清液。
已发现静止T细胞的激活完全取决于在CD32L细胞上的B7抗原的存在。交联于CD32L细胞上的抗-CD3或抗-CD2mAbs都不能有效地诱导T细胞增殖和淋巴因子的产生。另外，在ICAM-1或LFA-3共同转染于这些细胞之后这些细胞仍然是不起作用。然而，交联于用B7转染过的CD32L细胞上的抗CD2或抗CD3mAbs强裂诱导T细胞的增殖和高水平的IL-2，IFN-γ和GM-CSF产生。在这些条件下IL-10不能显著抑制静止T细胞的增殖。相反，IL-10能够抑制IL-2的产生，但不能抑制这些细胞对IFN-γ和GM-CSF的产生。
尽管如此，在IL-10存在下所产生的IL-2的含量仍足以在该测试时间点(第3天)诱导最大的增殖。综合这些结果表明对于诱导静止T细胞的增殖和对淋巴因子的产生来说，通过与辅助细胞上的B7相互作用而使CD28或CTLA-4位于T细胞上是绝对需要的，并且在这些条件下IL-10仍然能够抑制IL-2的产生。
实施例8-当用人HLA分子转染的鼠L细胞作为APC时IL-10抑制抗原特异性T细胞的增殖如上所述，当用HLA-DR3或HLA-DR3和ICAM-1，LFA3或B7转染的鼠L细胞作为抗原携带细胞时检测IL-10对破伤风毒素(TT)特异性T细胞克隆827和M.Leprae65KDhsppt[2-12]特异性T细胞克隆HY-06的抗原特异性增殖的作用。由L细胞转染子表达的HLA-DR，ICAM-1，LFA3和B7的FACS概况表明IL-10对这些细胞上组ⅡMHC的构成表达不起作用。
破伤风毒素由B.Bizzini博士(InstitutePasteur，巴黎，法国)提供并以1μg/ml的最终浓度使用。用固相肽合成方法制备Hsppt[2-12]，并用分析性反相HPLC和氨基酸分析法检验。以0.5μg/ml的最终浓度使用这种肽。
如上所述的方法进行T细胞克隆827和HY-06的刺激，增殖检测和细胞激活素的测定。已经发现用HLA-DR3转染的L细胞作为抗原携带细胞，IL-10以一种剂量相关形式抑制HY-06和327的抗原特异性增殖。以10U/ml加入的IL-10具有抑制活性，以100U/ml和500μ/ml加入时可获得对增殖高达30-50%的抑制。
当用HLA-DR和ICAM-1，LFA3或B7转染的L细胞作为APC时这些结果可被证实。当使用LFA3共同转染的L细胞时T细胞克隆827和HY-06的增殖反应增加，而IL-10的抑制作用并不显著。IL-10对827和HY-06的增殖反应的抑制作用可被中和性抗-IL-10mAb19F1完全逆转，表明了这种抑制的特异性。这些结果表明当用HLA-DR转染的鼠L细胞作为APC时IL-10能够抑制827和HY-06的抗原特异性增殖反应。
已发现IL-10对抗原特异性增殖的抑制是在T细胞水平上。为了证实这一点，在人或鼠IL-10存在下由TT和pt[2-12]激活T细胞克隆827和HY-06来研究是否IL-10作用于抗原携带L细胞上还是直接作用于T细胞克隆上。如上述所讨论的，人IL-10是对人和鼠细胞都是有效的，但鼠IL-10只对鼠细胞起作用。
已经发现，当使用HLA-DR单独转染的或者ICAM-1LFA3或B7共同转染的L细胞作为APC时鼠IL-10不能够抑制827和HY-06的抗原特异性增殖。这些结果表明IL-10直接作用于人T细胞克隆的增殖。
在有或没有IL-10和IL-2存在下，用单独表达HLA-DR或共同表达ICAM-1LFA3或B7的L细胞通过TT或pt[2-12]激活T细胞克隆827和HY-06，来检测是否外源性IL-2的加入能够逆转IL-10的抑制作用。低浓度的IL-2能够逆转IL-10对T细胞克隆827和HY-06的抗原特异性增殖的抑制作用。
在有或没有IL-10的存在下用只表达HLA-DR3或共同表达ICAM-1LFA3或B7的L细胞通过pt[2-12]激活T细胞克隆HY-06，并在24小时收获的培养物上清液中检测IL-2和IFN-γ的产生。IL-10抑制抗原特异性激活后的T细胞克隆HY-06对IL-2的产生，但不抑制IFN-γ的产生。总之，这些结果表明IL-10通过特异性抑制IL-2的产生来抑制抗原特异性T细胞的增殖。
炎性肠病已设计出了一种IBD的鼠模型。这种模型帮助阐明IBD的病源学或机理。另外，它也为各种治疗剂提供了一个实验机会。为设计该模型，在实验动物体中除去IL-10基因或者使之无作用或使之成为不可表达的基因。该动物被称之为是IL-10基因“缺失”或者称为“基因缺失”(KO)动物，用本领域中许多已知方法中的任何方法都能够完成这种KO。
例如，可制备一种IL-10基因不能被激活的转基因动物。见Goodnow，C.，“TransgenicAnimals”，1502-1504，EncyclopediaofImmunology，Roitt(ed.)，AcademicPress，SanDiego(1992)。简要地说，是把纯化的DNA微量注入已受精的卵母细胞的原核中，之后，把该卵母细胞用外科法植入养母的输卵管中。另一方面，也可以使用常规的基因育种技术来分离纯合的突变型动物株。
此外，还有在鼠种系中失活特异性基因的方法。在这种情况中，通过同源重组导入突变型转基因来替代野生型基因。胚胎干(ES)细胞系“能被分离于鼠胚细胞并在体外培养，然后再移植到另一个胚细胞中，从而部分地移植该鼠的体细胞和种系组织”Goodnow在1503。
将DNA导入培养的ES细胞中，并把胚胎细胞用外科法移植于养母体内。结果产生杂合突变型后代，这些后代相互交配最后产生具有两个突变型等位基因的后代，如纯合突变体。这些后代不具有有意义基因的功能性等位基因，并可以进行“基因解剖”来除去特定的基因。对所得到的后代的分析能够深入了解KO鼠体靶基因在产生最终表现型中的作用。
制备具有特定基因缺失的实验动物的其它方法，见McMahon，等，“The Midbrain-Hindbrain Phenotype of Wnt-1-/Wnt-1-Mice Results from Stepwise Depletion of engrailed-Expressing Cells by 9.5 Days Postcoitum，”Cell 69∶581(1992)和Travis，“Scoring a Technical Knockout in Mice，”Science 256∶1392(1992)。其它可用的技术包括诱变和反意技术。见上述Coodnow，C.(1992)。
实施例9-炎性肠病的鼠模型。
制备无IL-10基因的小鼠。见Kuhn等，Science254∶707(1991);Capecchi，Science244∶1288(1989);Robertson(ed)Teratocarcinomasandembryonicstemcells∶APartticalApproach，I.R.L.Press，Oxford.(1987);和Zijestra，等，Nature336∶348(1989)，这些文献描述了一般技术和制备缺失选择基因的小鼠的方法，以下将缺失IL-10基因的小鼠称之为IL-10T小鼠，或基因缺失(KO)小鼠。
第一组.处死四只小鼠进行骨髓检测。分析它们的一部分骨髓来判断它们产生髓细胞和红细胞前体的能力(见表3)以及鉴定干细胞的产生(见表4)。剩余部分的骨髓被用于长时间骨髓培养以鉴定微环境细胞支持正常造血再生的能力。胸腺和脾脏含有正常数量的T细胞和正常数量的B细胞。以下用列表方式给出短期前体和干细胞测定。分别列出了对照组和基因缺失鼠的细胞。
表3集落形成细胞的/股骨集落形成细胞的/股骨总细胞数/股骨GMBFU-eCFU-eMegMeg/Mix对照 9.5×10618,430 475 42,500 2,470 285IL-10T 9.4×10621,902 940 59,700 2,271 658GM=粒性白细胞和巨噬细胞;BFU=血形成单位;
CFU=集落形成单位;-e=红细胞系的;
Meg=巨核细胞集落;Mey/Mix=巨核细胞与其它细胞系混合。用于测定的集落刺激因子:IL-3+IL-6+红细胞生成素(Epo)
表4第14天CFU-S的数目对照组1,678每股骨IL-10T组1,517每股骨干细胞产生是以鼠的股骨中CFU-S的数目表示。CFUS测量移植后辐射致死鼠的脾中促红细胞生成素小结的形成。见Tiil等,RadiationResearch14:213(1961)IL-10T鼠在髓细胞、红细胞和干细胞的产生方面没有显示任何明显缺陷。同时，在包括那些来源于IL-10T鼠的所有培养物中长时间培养形成一层支持性基质。这些培养物是经两个阶段形成的首先，把细胞放入培养基中形成支持继续造血所需的复合基质层，然后用源于等同类型供体的另外骨髓细胞再接种到这些培养基中以提供与该基质细胞相关的实际前体。在第二和第三组鼠已备好时进行第二步骤。
第二和第三组需要这些动物的骨髓细胞来完成长时间骨髓培养实验。为此目的除使用它们的骨髓外，还要进行其它步骤(见表5-9)，IL-10T动物是贫血的但似乎有正常含量的骨髓前体。所以，评价它们的贫血情况并在组织学上观察它们的器官。
表5外周血液计数WBC/mlRBC/ml血小板数/ml鼠 ×106×109×108对照#17.27.312.6#211.25.610.7#310.06.78.5#48.25.69.8#57.75.68.0IL-10T#14.02.420.6#24.87.18.0#37.53.927.3#46.55.523.9WBC=血细胞,RBC=红细胞表6.外周血液的分类鼠%Lymphs%Neut%Mono%Eos%Retics对照#18712102.4#27226201.2#38018110.6IL-10T#13664013.8#24057035.3#323770017.1
Lymphs＝淋巴细胞，Neut＝中性白细胞Mono＝单核细胞，Eos＝嗜曙红细胞，Retics＝网状细胞RBC形态学.所有对照动物具有正常形成红细胞(RBC′s)。IL-10T鼠显出了不同形态。IL-10T＃1有小红细胞;＃2和＃3有小红细胞加一些巨红细胞，多色细胞和偶见的有核红细胞(NRBC′s)。用新亚甲蓝给红色血液涂片染色并计数显示核蛋白体染色的细胞。阳性染色出现于很年轻的红细胞(网状细胞)，这表明它从造血器官中被过早地释放出来。这称作网状细胞计数。
IL-10T鼠的器官组织学。检查心脏、肺、肾和胸腺切片都正常。肝脏除偶见单核细胞和嗜中性粒细胞聚集外表现正常。脾几乎全部异常。有滤泡存在，但红髓区充满了造血细胞，多数是NRBC′s和胚细胞形式(未成熟细胞)。有一些或没有成熟RBC′s并且巨噬细胞中没有铁贮存。
表7脾细胞分类(总细胞数的百分数)细胞数/血浆Nuc鼠脾脏LymphMonoNeuEosCellBlastRBC对照 #1 1.5×10888 2 1 <1 <1 1 6#2 1.5×10889 1 <1 <1 <1 2 7#3 1.1×10879 3 4 1 2 2 8IL-10T #1 2.1×10864 2 7 1 1 2 22#2 2.5×10854 2 13 3 1 6 21#3 1.6×10843 2 10 1 1 10 32
Lymph＝淋巴细胞，Mono＝单核细胞，Neu＝中性白细胞，Eos＝嗜曙红细胞，Retics＝网状细胞，Blast＝胚胎细胞，NucRBC＝具核红细胞表8骨髓分类(%总量)NeuEosNuc血浆Blast鼠NeuMBEosMBRBC细胞LymUndif对照#1461210420<144#23995337<152#3351012429<162IL-10T#146127228<122#256194118<111#353142127111NeuMB＝中性原始粒细胞;EosMB＝嗜曙红原始粒细胞;
NueRBC＝具核红细胞;BlastUndif＝原始未分化的胚细胞;
Lym＝淋巴细胞下列数据是集落一形成检测结果。用脾细胞以及骨髓细胞进行了测定。用IL-3+C-kit配体替代IL-3+IL-6刺激集落形成细胞。把第一测定(上述)中所得到的BFU-e数与下列测定中所得到的BFU-e数比较证明IL-3+C-kit配体的结合在刺激红细胞体方面更有效。
表9集落形成测定MEG/小鼠GMGEMGEMMBFU-eCFU-eMEGMIX脾脏(集落数/脾脏)C118,5356183099,26842,3226181,236C27,7368935952,67844,9261,488893C38,6706506507,15271,741433433K155,0208,4003,36051,660393,1202,1006,300K2111,06025,74610,60196,925498,76214,13512,116K368,27420,0969,890103,0501,012,63314,3579,252骨髓(集落数/股骨)C137,3003,6328387,96335,065978419C249,1592,5525105,95481,4786801,021C330,3431,9166396,06924,754958958K163,4401,8231,6418,75058,3361,2761,276K237,3406,5704388,87047,0859861,424K335,4324,0061,75314,27352,2081,6284,132C1，C2和C3是指也称之为对照＃1，＃2和＃3的相同对照鼠。K1，K2和K3是指也称之为IL-10T＃1，＃2和＃3的相同小鼠。
CM＝粒细胞，巨噬细胞GEM＝粒细胞，红细胞，巨噬细胞GEMM＝粒细胞，红细胞，巨噬细胞，巨核细胞表10潜血试验小鼠第1天第2天对照#1阴性阴性#2阴性阴性#3无标本阴性IL-10T#1阴性阴性#2阳性阳性#3阳性阳性排泄物的检查，IL-10T鼠的排泄物的试验没有发现有代表寄生虫感染的虫卵。也没有迹象表明有成熟寄生虫寄生于上部或下部肠中。
动物变化于轻微或显著贫血之间，这种贫血不能用不能产生红细胞来作解释。IL-10T鼠显示出试图补偿贫血的迹象。首先，它们在其脾中产生了大于正常数目的RBC前体。在鼠体内，脾正常地试图补偿RBC的缺乏。鼠脾比正常动物的大两倍并且在试图产生RBC′s方面过度活跃。
一些鼠进行了极好的补偿。在它们的血液中它们已有近于正常数目的RBC′s，并且，它们没有向循环中释放许多未成熟的细胞，因为它们的网状细胞比较正常。然而，其它鼠却落后，并且它们过早地把细胞推入循环中，这也是它们的网状细胞数如此高(即17%)的缘故。它们也有一些循环的具核RBC′s。
这些鼠也具有高于正常的血小板数以及在它们的脾中有较高数目的巨核细胞。这是它们可能正在出血的一种迹象。失血可以解释这种缺铁性慢性贫血(这种铁的缺乏明显存在于脾和骨髓区中)。尸体解剖很清楚发现没有内部出血。然而，大多数IL-10T鼠在它们的粪便中有血并且还表现出直肠脱垂。仔细检查这些鼠并发现蛲虫，绦虫，或其它寄生虫感染呈阴性。便血阳性和它们贫血的严重程度之间有直接相关性。
除了贫血和出血问题，IL-10T鼠血液中的嗜中性粒细胞比淋巴细胞多。对鼠来说这与正常情况相反。见外周血液分类表(表6)。这种观察也与脾集落-形成测定表9)中发现的骨细胞样前体的巨大增加相一致。所以，该鼠患有“慢性炎症性贫血”综合症。
在尸体解剖中，检查从IL-10T鼠和同窝仔交配的对照组制备的组织切片。对照组的所有切片呈现正常。关于IL-10T鼠，胸腺和脊髓组织呈现正常。脾脏的红细胞样未成熟细胞和髓样未成熟细胞加巨核细胞呈现轻度至显著的增长。RBC库很小或几乎不存在。普鲁士兰染色表现出铁贮存的缺乏，并有髓外造血增长的迹象。
铁贮存的缺乏与失血一致，并导致异常的红细胞生成。在粗略的检查中，该脾是正常大小的1.5到3倍。肠系膜的淋巴结比正常体积非常大并且几乎与正常脾一样大。B和T细胞的滤泡同样被扩大了，并且这种图片与炎性反应一致。
小肠表现出形成完好的粘膜和粘膜下层。在一些切片中，多形核白细胞(PMN)和单核细胞数有轻微的增加。大肠和直肠显示出显著的直肠炎症，几乎扩散到结肠的较低部位。已出现显著的水肿和细胞浸润。PMN′s是主要的细胞类型，但也出现嗜曙红细胞，淋巴细胞，血浆细胞和上皮状细胞(类似上皮的细胞)。炎症涉及到粘膜，隐窝，和粘膜下层。有时，在肌层部分，特别是在内扩红肌区发现有浸润。在许多区域中，上皮已消失或不存在。多处损伤表现出集聚有RBC′s和PMN′s的纤维物质。一些血管被RBC′s栓塞。上皮状细胞团表示早期肉芽瘤形成，但没发现形成完好的肉芽瘤。没有能引起慢性炎症的寄生虫，虫卵或细胞内细菌的存在。多处损伤和出血与粪便潜血实验的阳性结果一致。综合上述情况与伴有贫血和消瘦的IBD一致。
实施例10-IL-10KO鼠对用外源性IL-10的治疗有反应检测四只无IL-10基因(IL-10KO)的鼠和三只正常对照鼠。对照鼠有正常的物理表现。所有三只对照鼠有阴性潜血粪便试样和正常形态的直肠。一些IL-10KO鼠明显小于对照组并且它们显出较差的健康状态。与正常对照组相比，它们毛发枯槁和活动力较差。四只IL-10KO鼠中有一只驼背，走路步态异常。四只IL-10KO鼠都出现直肠肿胀和出现红斑样直肠组织或者明显的直肠脱垂。
在两个不同时间，两只实验KO鼠明显地具潜血粪便试样，而第三只鼠一次是阴性，第二次是模棱两可。四只KO鼠都进行直肠切片，三只有大量嗜中性粒细胞的化脓性渗出物。在取样时正在出血的该动物直肠切片上也存在红细胞。因为IL-10KO鼠显示出随时间而消瘦，记录IL-10KO鼠和正常鼠的体重作为检查的一个部分。
给三只IL-10鼠每天用35毫克的IL-10注射两周。这三只鼠始终表现出化脓性渗出物(3只中的仅2只显出出血的迹象而3只中的1只异常地爬行和走动)。给一只IL-10KO鼠(对出血阴性并有化脓性渗出物)和正常对照组每天注射三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液，注射两周。监测一般状况，物理表现，直肠渗出物潜血和体重。
在注入IL-10二周后，三只IL-10KO鼠都显出增长的活力，平滑的毛发，以及正常姿态和走动。尽管仍存在炎症迹象，但三只鼠都表现直肠肿胀减轻。三只鼠都是潜血阴性，并且其直肠切片中没有红细胞的迹象。渗出物的量减少;然而，在它们的直肠切片中仍能观察到嗜中性粒细胞。现在一只动物的切片显示出较嗜中性粒细胞更多的上皮状和淋巴细胞。一只动物保持其体重约16克。其它两只增长了体重，从16增加到17.8克和11.4增加到14克。
接受TRIS缓冲液两周治疗的IL-10KO鼠仍有阴性潜血粪便试样。它的大量渗出物含有大量嗜中性粒细胞。直肠仍就肿胀并容易脱垂。也显出明显的驼背和行走异常，并且体重已从16.6下降到14克。也用TRIS缓冲液注射过的正常对照组保持一种正常的健康表现(包括它们的直肠)。它们的潜血粪便试样仍为阴性并且观察不到直肠渗出物。它们的体重增长从17.1到19克和从17.4到18.7克。甚至几周后，这些动物继续增重。
实施例11-炎性肠病引起的症状或指征的改善如下所述按照本发明能够用IL-10治疗患有IBD的病人。这类病人具有的典型症状包括腹泻、腹痛、发烧、黑粪、便血和体重减轻，以及指征包括腹部肿块，舌炎，口腔溃疡，肛裂，肛瘘，贫血，吸收障碍以及缺铁。这些患者开始每天用每千克体重5μgIL-10进行治疗。因为患者体重70Kg，启始剂量是每天350μg的IL-10。这个剂量是以静脉团块给药的。根据患者的耐受性和反应来决定增长每天的剂量约50到150μg。几天后得到一个每天约700μg的最佳剂量(每天每千克体重10μg)。
在第一次治疗前，和之后的每天直到最后治疗的后几天，以临床和实验参数监测患者。这些实验参数包括血细胞计数特别是总白细胞数及其分类。特别有意义的是与患者治疗前的水平比较白细胞数仍保持正常还是没有显著改变。就白细胞分类而言，特别引起注意的是外周血中是否出现不成熟形式的细胞和白细胞不同类型的正常比率保持不变或改变。还应特别注意的是外周血液中淋巴细胞和单核细胞的比率。
能够监测的其它参数包括红细胞沉降率(ESR)，化学分析，IL-6，TNF和IFN-γ的血中含量。最后，对患者粪便中血液和化脓性渗出物定期，如每日，检查可表示患者对治疗的反应。治疗可导致肠炎的一种或多种症状或指征的改善。
迟发型变态反应的抑制实施例12-鼠体中效应降低用抗-CD4单克隆抗体(MoAb)预先治疗BALB/C鼠，并且四周后用利什曼原虫(Leishmaniamajor)感染。BALB/C是从Simonsen实验室(Gilroy，California)得到的鼠近亲交配系，它可从商业上买到。所用鼠为8到12周龄。在含有30%胎牛血清(FCS)(从J.R.Scientific.Woodland，CA可得到)，2mML-谷氨酰胺和青霉素，链霉素每种各100μ/ml的M199中(从GIBO，Grand Island，NY可得到)把利什曼原虫(L.major)(WHO株命名WHOM/-/173)以原鞭毛虫形式培养。从稳定期培养基中收获原鞭毛虫，并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。用1.5×107活的原鞭毛虫皮下注射到鼠左后爪垫来感染小鼠。通过把寄生虫冷冻和解冰四次循环后离心分离制备利什曼原虫(L.major)抗原。以相当于2×106个微生物/ml量把该抗原制剂加到培养基孔中。
用下列单克隆抗体(McAbs)进行体外检测一种中和性抗鼠IL-4MoAb(ATCC号HB188)，一种中和性抗鼠IL-10McAb[Chatelain，等，J.Immunol.148∶1182(1992)公开的用于抗-IL-4的方法所制备]，和抗鼠CD4(ATCC号TIB207)。用离子交换层析法和凝胶过滤法从组织培养上层清液中纯化所有的抗体制剂并且使它含有至少3个内毒素单位(EU)/mg蛋白，这可用鲎凝集素测定法检测。
为了纯化细胞，使用下列纯化的McAbs生物素化(biotinylated)的RM-4-5和RM-4-4，抗鼠CD4和AMS-32.1，抗鼠Mac-1(ATCC号TIB128)，RA3-6B2，和抗鼠B220[Coffman，Immunological Reviews 69∶5(1982)]。在大肠杆菌中表达重组鼠IL-4和IL-10，并如前所述亲和纯化。
感染后4到6周从BALB/C或BALB/C抗-CD4预先治疗的鼠中摘除利什曼原虫(L.major)感染部位的腘淋巴结(LN)并把它挑开放入含0.25%牛血清清蛋白(BSA)的PBS中，制成单细胞悬浮液。为纯化CD4+T细胞，在4℃进行所有的操作。用含有每种各12μg/ml的抗-B220，抗-Mac-1，抗-CD8和抗-组Ⅱ I-Ad的2mlPBS/BSA溶液标记约4×108个LN细胞30分钟。McAb标记的细胞悬浮液，在用PBS/BSA洗涤后，与羊抗-鼠包被的Dynabeads小珠(Dynabeads可从RobbinsScientific，MountainView，Calif获得)以每个细胞3个珠的比率在旋转轮上孵育30分钟。用磁性分离法获得阴性细胞。
用一台磁性活化细胞分拣器(MACS，Miltenyi，Dusseldorf，德国)通过阳性选择从所得到的细胞悬浮液中(它约85%CD4+)进一步富集CD4+细胞。简要地说，用12μg/ml生物素化的抗-CD4PBS/BSA溶液标记细胞，约50ml/108细胞，标记15分钟。用PBS洗涤该细胞并与Streptavidin微球(来自Becton Dickinson，Sunnyvale，Calif)以约50μl/108个细胞孵育，15分钟之后，以最终浓度1/50加入Streptavidin-PE(来自Becton Dickinson)。按照生产厂指示再孵育5分钟之后，洗涤该细胞悬浮液并通过一只磁性柱(MACS，Miltenyi，Dusseldorf，德国)。从磁体上取下柱子并用PBS/BSA彻底清洗来洗脱保留在磁化柱上的细胞。所得到的细胞群是大于96%CD4+。
从正常供体的脾脏制备缺少T细胞的脾细胞，按上述对LN细胞的详细描述用羊抗-鼠Dynabeads小珠通过阴性选择法从这些脾细胞中除去抗-CD4和抗-CD8染色细胞。用FACS测定该制剂一般有99%CD4和CD8阴性。
在有或没有L.major抗原的存在下，把未分离的淋巴结细胞或纯化的CD4+T细胞以所示剂量在96孔园底平板上250μl含5%FCS的cRPMI中重复培养，对于纯化CD4+T细胞来说，要和5×105个去除T细胞的正常脾细胞一起培养。cRPMI是一种完全培养基，它含有RPMI-1640(从J.R.H.Bioscienses in Lenexa，Kansas可得到)，10%FCS，2mML-谷氨酰胺，0.05mM2-ME和每种各100μ/ml的青霉素和链霉素。
用L.major抗原(相当于2×106微生物/ml)或只用培养基激发抗原携带细胞(APC)4小时。然后在培养前把去除T细胞的脾细胞暴露于1000rad γ-辐射下。在某些情况下，把重组IL-10(rIL-10)(50μg/ml)，重组IL-4(rIL-4)(100ng/ml)，和/或抗这些细胞激活素的中和性McAbs加到培养孔中。72小时后收获上清液来检测细胞激活素的合成。
用上述对IFN-γ(见上文Chatelain等1992)，IL-4(上文Chatelain等1992)，IL-10和IL-3所使用的两点夹层ELISA方法测定上清液中细胞激活素的含量。与纯化重组或天然细胞激活素的标准曲线对照定量试样。
预先用抗CD4MoAb处理开始可去除动物的T细胞，但最后可提高动物对L.major寄生虫激发的抵抗力。尽管这种现象是可非直现的，并且它的机理尚不清楚，但它已被广泛地观察到了。DTH与动物对寄生虫感染的抵抗力密切相关的。
感染四周后，用利什曼冷冻-解冷的抗原在对侧爪垫上激发动物。在后来的48小时期间用一只测量卡尺监测爪垫的肿胀。每只动物腹膜内接受5个剂量的细胞激活素。一组接受5个剂量的IL-4，另一组接受5个剂量的IL-10而第三组接受5个剂量的IL-4和IL-10的混合物。抗原攻击前12小时给第一次剂量，以后每隔12小时给五次剂量中之一。
表11.IL4和IL-10的结合物抑制对L.major抗原的DTH治疗爪垫体积(mm×10-2)20μgIL-484±1620μgIL-1068±720μgIL-4+20μgIL-1033±114μgIL-4+4μgIL-1054±25PBS对照91±20表11表示注射利什曼抗原后24小时鼠爪垫的体积。只注射PBS的对照动物的反应与以所述剂量注射IL-4，IL-10或二者结合物的动物的反应进行比较。在抗原攻击前12小时开始给药，把细胞激活素在48小时内每隔12小时腹膜内(IP)给药。每组有五只动物。
该数据表明只用IL-4治疗的鼠与用PBS治疗的鼠生活情况基本一样。使用IL-10治疗的鼠比对照组肿胀较小。
用IL-4和IL-10结合治疗的鼠有最小的肿胀反应，特别是用每种细胞激活素20μg治疗的小组。
表12IL-4和IL-10结合物抑制对L.major抗原的DTH治疗爪垫体积(mm×10-2)50μgIL-473±1150μgIL-1065±1250μgIL-4+50μgIL-1043±1320μgIL-4+20μgIL-10+ICA42±920μgIL-4+20μgIL-10+aIL-10+aIL-493±21PBS对照119±27
表12表示了第二种独立实验的数据。实验形式与上述基本相同，不同的只是利什曼抗原注射后48小时获取爪垫数据。
每组有5只动物。通过使用2mg抗IL-4的单克隆抗体和5mg抗IL-10单克隆抗体来阻止IL-4和IL-10的抑制作用。在首次使用细胞激活素前12小时腹膜内给抗IL-4和IL-10的抗体，作为阳性对照。作为阴性对照组的，5mg同型对照单克隆抗体(ICA)没有抑制作用。如Chatelaim等1992(前面引用的)所述制备ICA。
加入抗IL-4和IL-10的抗体以显示对IL-4和IL-10的竞争减低该细胞激活素的作用。而且，对重组产生的细胞激活素来说这些抗体提供了进一步的对照。
这些数据表明在减低动物DTH反应方面IL-4和IL-10的结合比单用细胞激活素二者之一更有效。单用IL-10比单用IL-4更有效，但比结合使用作用较低。细胞激活素与抗每种细胞激活素的单克隆抗体结合给药会导致该细胞激活素治疗作用阴性。
表13发生DTH位点的LN细胞对IFN-γ的产生治疗IFN-γ(ng/ml)20μgIL-4147±3420μgIL-10109±4920μgIL-4和20μgIL-1053±33PBS对照242±54表13的数据是通过抗原激发前12小时开始给药，并在以后的24小时内每12小时给药一次细胞激活素产生的。在抗原激发5天后从接受细胞激活素和抗原的动物中取出利什曼抗原注射位点的淋巴结(LN)的细胞。表13中标有“治疗”一栏是指取出LN细胞的动物所接受的治疗。体外用L.major冷冻一解冻抗原刺激淋巴结。72小时后测定上清液中IFN-γ的含量。所显示的数据是来自三只个体动物中(n＝3±标准误差)。
这些数据表明用细胞激活素所治疗的动物比用PBS治疗的对照组产生较少的IFN-γ。而且，用IL-4和IL-10结合物所治疗的动物比接受单一细胞激活素的实验动物对照组中任一组出现显著少的IFN-γ。
表14.IL-4和IL-10对由Th1群产生的IFN-γ的抑制加入IFN-γ(ng/ml)无100±65ng/mlIL-1053±4100ng/mlIL-444±25ng/mlIL-10和100ng/mlIL-420±1为产生表14的数据，以四周前用L.major感染的并用抗-CD4预先治疗的鼠中分离CD4+T细胞(3.5×105/孔)。体外用L.major冷冻解冻抗原与去除T细胞的脾细胞(5×105/孔)一起作为APC源来刺激细胞。72小时后用ELISA法测得IFN-γ的含量。标有“加入”一栏指向培育Th1细胞的培养基中所加的物质。
表14的数据显示单用IL-4和IL-10二者给药，与用PBS所治疗的对照组作比较明显减低了Th1细胞产生的IFN-γ的含量。而且，给培养基中加入IL-4和IL-10结合物比单独加入每一种细胞激活素会导致约少50%的IFN-γ。
以上数据表明与对照组相比IL-10始终降低DTH反应，肿胀，以及一般由淋巴结，特别是Th1细胞对IFN-γ的产生。而且，在同样剂量范围，IL-4和IL-10的结合更优于单用IL-4或IL-10。以每种细胞激活素20μg结合治疗显出的结果优于每种IL-4和IL-10以两信多剂量(50μg)单一治疗的结果。因此，每种IL-4和IL-10各20μg结合治疗比50μgIL-4或IL-10单独治疗有优越之处。
实施例13对患有糖尿病Ⅰ型病人的治疗选择患有按照国际糖尿病数据组或世界卫生组织制定的标准诊断的糖尿病Ⅰ型或胰岛素-依赖性糖尿病的病人用于治疗。开始用每天每千克体重IL-4和IL-10每种各20μg治疗患者。因为患者体重70Kg，最初起始剂量每天每种细胞激活素1400μg。这种利量以静脉团块注射给药。根据患者耐受性和反应该剂量每天增长约250到1000μg。几天之后达到每天约7000μg的最佳剂量(每天每千克体重100μg)。
首次治疗前，以及治疗后每天直到治疗后几天，用临床和实验室参数来监测患者。这些实验室参数包括血糖和血细胞计数特别是白细胞总数及其分类。血糖监测是糖尿病治疗中所熟知的。其它有意义的是白细胞数相比于患者治疗前的含量是否保持正常或没有显著变化。对白细胞分类来说，主要关心外周血液中是否有未成熟形态出现以及白细胞不同类型的正常比率是否不变还是变化。特别关心的还有外周血液中淋巴细胞和单核细胞的比率。
在没有超出了本发明的构思和范围情况下可以对本发明进行许多改进和变化。这些对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。这里所描述的具体实施方案是仅以实施例的形式提供的，而本发明只能以所附的权利要求的范围所限定。
序列表(1)一般资料:
(i)申请人:
(A)姓名:ScheringCorporation(B)街:GiraldaFarms(C)市:Madison(D)州:NewJersey(E)国家:美国(F)邮政编码(ZIP):07940-1000(G)电话:201-822-7375(H)传真:201-822-7039(I)电报:219165(ii)发明名称:IL-4和/或IL-10的新用途及其抗体(iii)顺序数目:4(iv)计算机阅读格式:
(A)盘的型号:Floppydisk(B)计算机:AppleMacintosh(C)操作系统:Macintosh6.0.5(D)软件:MicrosoftWord5.1a(v)目前申请数据:
(A)申请号(B)申请日(vi)已有申请数据:
(A)申请号:US07/933950(B)申请日:1992年8月21日(A)申请号:US07/933462(B)申请日:1992年8月21日(A)申请号:US07/933419(B)申请日:1992年8月21日(A)申请号:US07/932900(B)申请日:1992年8月21日(2)SEQIDNO:1的资料:
(i)序列特征:
(A)长度:160个氨基酸(B)类型:氨基酸(D)拓扑结构:线型(ii)分子类型:蛋白质(xi)序列描述:SEQ.IDNO:1:
(2)SEQIDNO:2的资料:
(i)序列特征:
(A)长度:147氨基酸(B)类型:氨基酸(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:蛋白质(xi)序列描述:SEQIDNO:2:
(2)SEQIDNO:3的资料(i)序列特征:
(A)长度:38碱基对(B)类型:核酸(C)链型:单链(D)拓扑结构:线形(ii)分子类型:DNA(基因组)(xi)SEQIDNO:3的序列描述:
GGCTGCAGCGACGAGCCATGGTTGCTGGGAGCGACGCG(2)SEQIDNO:4的资料:
(i)序列特征:
(A)长度:35碱基对(B)类型:核酸(C)链型:单链(D)拓扑结构:线形(ii)分子类型:DNA(基因组)(xi)SEQIDNO:4序列描述:
TTCATCTTCTGGTACCAATCAATTGGAGTTGGTTC
权利要求
1.一种生产具有选自于由以下组成的小组中的一种用途的药用组合物的方法，(a)抑制IL-2-依赖性肿瘤细胞增殖；(b)增长IFN-γ的水平；(c)治疗炎性肠病；(d)加强抑制细胞激活素的产生；以及(e)抑制迟缓型变态反应；其中这类方法包括为(a)，(b)，(c)，(d)和(e)用途而分别把(i)IL-10；(ii)抗IL-4和IL-10的抗体；(iii)IL-10；(iv)IL-4和IL-10；和(v)IL-10与药学上可接受的一种载体混合。
2.权利要求1(e)(v)的方法，还包括把IL-4与载体和IL-10混合。
3.权利要求1或2之一的方法，其中IL-4或IL-10是人IL-4或IL-10。
4.一种具有选自于下列一组中用途的药物组合物(a)抑制IL-2-依赖性肿瘤细胞增殖;(b)增加IFN-γ的水平;(c)治疗炎性肠病;(d)加强抑制细胞激活素的产生;和(e)抑制迟缓型变态反应;其中这类药用组合物含有一种药学上可接受的载体，以及因(a)，(b)，(c)，(d)和(e)不同用途还分别含有(ⅰ)IL-10;(ⅱ)抗IL-4和IL-10的抗体;(ⅲ)IL-10;(ⅳ)IL-4和IL-10;和(ⅴ)IL-10
5.权利要求4(e)(v)的药用组合物，它还含有IL-4。
6.权利要求4或5之一的药用组合物，其中的IL-4或IL-10是人IL-4或IL-10。
7.(a)IL-10;(b)抗IL-4和IL-10的抗体;(c)IL-10;(d)IL-4和IL-10;和(e)IL-10的用途分别是(ⅰ)抑制IL-2-依赖性肿瘤细胞增殖;(ⅱ)增加IFN-γ的水平;(ⅲ)治疗炎性肠病;(ⅳ)加强抑制细胞激活素的产生;和(ⅴ)抑制迟缓型变态反应;
8.权利要求7(e)(v)的用途，其中IL-4是与IL-10协同给药。
9.(a)IL-10;(b)抗IL-4和IL-10的抗体;(c)IL-10;(d)IL-4和IL-10;和(e)IL-10用于制备一种药物的用途，该药物分别可用于(ⅰ)抑制IL-2-依赖性肿瘤细胞增殖;(ⅱ)增加IFN-γ的水平;(ⅲ)治疗炎性肠病;(ⅳ)加强抑制细胞激活素的产生;和(ⅴ)抑制迟缓型变态反应;
10.权利要求9(e)(v)的用途，其中这种药物还含有IL-4。
11.权利要求7到10的任一用途，其中IL-4或IL-10是人IL-4或IL-10。
全文摘要
本发明提供了使用IL—4和/或IL—10或抗IL—4和IL—10的抗体来治疗多种疾病的组合物和方法。在一种实施方案中，IL—10可用来抑制肿瘤淋巴细胞对IL—2的产生，或IL—2依赖性肿瘤细胞的增殖。在另一种实施方案中，IL—10可用来治疗炎性肠病。在另一种实施方案中，抗IL—4和IL—10的抗体可用来增长IFN—γ的水平。还一种实施方案是，IL—4和IL—10的组合可用来加强IL—10介导的对T细胞产生细胞激活素的抑制。还有一种实施例，IL—10，单用或与IL—4合用可用于抑制迟发型变态反应。
文档编号A61K39/395GK1090204SQ9311763
公开日1994年8月3日 申请日期1993年8月19日 优先权日1992年8月20日
发明者R·科夫曼, R·迪瓦尔马力菲特, D·兰力克, J·E·迪弗赖斯, F·包里 申请人:先灵公司