处理骨组织的方法以及相应的可移植的生物材料的制作方法

专利名称：处理骨组织的方法以及相应的可移植的生物材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种处理骨组织的方法以及相应可移植的生物材料。
特别是，这种方法能够按照将骨组织移植到人体内的目的而对骨组织进行处理。这种组织一定要不会引起排斥反应(或者至少尽可能少的发生排斥反应)，并具有良好的骨传导能力，即它必须使得受体新长出的骨组织能够形成和移动。
骨组织移植是世界上大多数整形外科门诊的日用技术。这种移植可分为三类，即-同种异体移植，-自体移植，-异种移植。
同种异体骨移植的要点在于把骨组织从供体移植到同一物种的不同于该供体的受体上。自体骨移植的要点在于取出骨组织并将其移植在同一个体上。异种骨移植是指将取自动物(通常是猪或牛)的骨组织移植到人体上。
为了进行此类移植，首先要对骨组织进行机械清洁处理并清洗会对其移植造成不利影响的所有物质。在做这些工作时我们发现，采用现有的处理方法有损于骨组织的机械性能。这是因为分离的有机物质会影响骨质的机械性能。不过，进行骨移植通常是为了在存在着强度问题的部分重建骨骼，其中，机械性能是最为重要的。因此，拥有其机械性能与天然骨头相当甚至优于天然骨骼的现成骨头移植物是非常有利的。
例如，这种移植物可用于整形外科，特别是当移植物负载时，即脊髓外科(颈推合并，脊椎盘置换等)，髋臼基的再造，关节成形外科，切骨手术，假关节，关节固定术等。
因此，当移植物是用于修复支承移植的人造假体(关节假体，牙齿假体等)时，采用其机械强度尤其是在加压情况下高于原始的损坏骨头的机械强度的移植物，从假体的寿命和功能来看是一个决定性的有利因素。而且，安插在假体与骨头之间的移植物可使得机械性能的变化更加平缓，且由于避免了强度的过陡的局部化梯度而改善了应力传送的质量。此外，如果移植物从被植入时起其强度就与骨头的强度相同，就可以消除在移植物被新形成的骨组织吸收期间发生变质的危险。
因此，本发明的目的是提供一种可移植的生物材料，其机械性能，特别是加压条件下的强度至少与天然骨头的强度相当。特别地，本发明的目的是提供一种在加压条件下其强度为天然骨头的一至二倍的可移植的生物材料。
此外，本发明的目的还在于提供这样一种生物材料，它可以改善骨移植的机械学和生物学功效。
事实上，同种异体移植有很多缺陷。首先，因骨组织从一个个体转移到另一个体中所引起的感染的危险性很大。在AIDSHIV病毒传播方面尤为如此。随着这类疾病的大量增加，发生此类感染的危险性在近年也明显增加。除了这些感染(它们病毒)还涉及其它的危险以外，与采用同种移植物有关的主要并发症是骨折以及被植入骨组织(移植物)的不成功的移地再发育和对移植物的排斥。如今，移植物不成功的移地再发育具有一个突出的问题。这是因为移植物的组织据认为要被新形成的骨组织吸收、侵入和取代。但是，迄今为止，这种修复还是不结实。
因此，本发明的目的之一是生产一种可移植的骨组织，这种骨组织从感染和免疫系统角度来看是安全的。
本发明的另一个目的是使得这类骨移植具有良好的骨传导能力(即有助于成功地移地再发育的能力)。
自体移植一般比同种异体移植更可取，因为这种移植可更完善地移地再发育并倾向于促成移植物处的骨细胞生长。其结果是感染和对免疫系统破坏的可能性明显减少了，但是，这类方法并不完全令人满意。这是因为这种方法很疼痛，患者常会做出拒绝的反应，并具有在供体位点上发生并发症的危险。此外，在很多手术中需要大量的骨组织，这与自体移植是相矛盾的。
异种骨移植同样具有许多缺陷。通常，这些移植物会引起强烈的免疫反应(排斥)。为了减轻这一缺陷，做出了各种以减少或消除这种反应为目的的努力。他们通常都是基于这样的原则在移植之前从骨组织中分离蛋白质。因为骨组织中所含蛋白质是某些排斥反应的诱因。这种排斥反应也与髓状组织中细胞碎片的存在和这种组织的其它因子有关。
用于从骨组织中提取蛋白质的有机溶剂是已知的，最常用的溶剂是乙二胺、过氧化氢、各种氯化溶剂如三氯甲烷或二氯甲烷、以及乙醇和丙酮。通过这种方法将蛋白质分离之后，大多数骨组织很少出现或不出现免疫反应。通常，他们可以成功地再生血管并被受体的骨细胞侵入。不过，他们本身并没有骨诱发性能。其机械强度通常也低于天然骨质的强度，或与之相当。
然而，应当指出的是，用于分离蛋白质的溶剂通常是剧毒的。因此，必需对骨组织进行仔细漂洗(就其多孔性而言，这一点是难于做到的)以免对受体位点造成任何污染。
法国专利申请FR-A-2，654，625公开了一种将这种有毒溶剂与一种选择的脲基分离剂配合使用分离蛋白质的方法。然而，这种方法会得到极为不同的脂质分离结果，因为根据该专利，会有0.5-5%的残留脂质。
从动物的组织或器官中分离各种物质，如脂质、蛋白质、核苷酸和糖类的超临界状态的流体是已知的。但是，这些已知方法在使用时被认为是复杂的和昂贵的，与其他分离方法相比无任何突出优点。
因此，在现有技术中没有公开在处理骨组织时分离有机物质的可行性，作为这种分离的结果，骨组织的机械强度得以改进。
本发明的目的是减少现有技术中的各种缺陷，特别是提供一种与天然骨质相比具有改进的强度的可移植的骨组织，这种骨组织对于感染和免疫系统来说是安全的，具有良好的骨传导能力且不使用有毒制品。本发明的特殊目的是提供一种能这样处理骨组织的方法。
为此，本发明涉及一种为了得到可植入人体并适于承受机械应力的生物材料而处理动物和人的骨组织的方法，在该方法中对骨组织周围的所有有机物质进行机械清理并将其从骨组织上分离，其特征在于它包括至少一个将超临界状态下的一种流体渗透到骨组织里的步骤。
本发明人惊奇地发现，在处理过程中可以极方便地将骨组织与超临界流体接触，以便在分离有机材料的同时提高其机械强度。
根据本发明，在一个步骤中将这种超临界状态下的流体渗透到骨组织里，以使骨组织里可溶于该流体的大部分脂类物质被分离。用这种超临界流体所实现的分离具有特别适用于骨组织的特性。
根据本发明，该方法包括(a)对骨组织周围的所有有机物质进行机械清理;
(b)按照预定形状切割上述骨组织;
(c)清理骨组织以便将对成功地再植有害的成份与之分离，将适于溶解于该骨组织并适于将存在于该组织中的大部分脂类有机物质分离的超临界状态的流体渗透到骨组织里;
(d)对以上述方式清理过的骨组织进行清洗、脱水和消毒。清理步骤(c)中还包括对骨组织进行化学处理和/或酶处理，以便分离出残留在其中的特定蛋白质。
这种处于超临界状态的流体是一种具有低动态粘度(接近气体的动态粘度)，高扩散系数、极低的界面张力和高密度(接近液体的)易于扩散到多孔材料里而无任何吸收问题。另外，这种流体的溶解能力很高(接近液体的溶解力，有时能达到气体溶解力的108倍)，而且能通过改变压力而加以改进。其结果是，这种超临界状态的流体可轻易地溶解骨组织中大部分的脂类有机物质，实际上是完全溶解。从而显著减少免疫系统和感染的危险。
本发明一个优点是将二氧化碳(CO2)用作超临界状态的流体，因为这种成分具有很多优良特性，即-其临界温度较低，为31℃。因此，有可能在大约31℃的温度和约7.38MPa的压力下工作时使CO2处于临界状态。根据所施加的压力，可以在31～60℃的温度下工作，在此温度下可能对骨组织造成的唯一损害是胶原蛋白的变性，这会使其失去其抗原特征。
-其溶解力十分优越，尤其是对脂类的溶解。例如，已知许多种脂肪酸和甘油三酯在超临界状态下在CO2中有接近10%的溶解度。然而，这些脂类大量存在于髓状组织中，这种髓状组织渗透在海绵状骨组织里，这些脂类是很强的抗原，并且总是极难除去;另外，由于它们不能被吸收，所以就形成妨碍移植物移地再发育的物理屏障;
-它能加强骨质的生物力学性能并有助于被植入骨组织的骨整合;
-它是一种天然的、完全无毒的物质;
-它易于得到并且无论对于被处理的物质还是实验者均无危险。
在骨组织的处理上辅以化学处理或酶处理是有利的，它尤其适于分离骨组织中的蛋白质材料。
本发明还涉及根据上述方法所获得的可移植的生物材料，它由纯化的骨组织构成，将其在超临界状态下与一种流体接触，该组织适于移植到人体上骨组织受损的位点。
根据本发明，通过采用超临界状态的流体分离将骨组织中的大部分脂类有机物质清除。
这种材料的强度与天然骨质的强度相当或更高，而且对于感染和免疫系统来说是安全的，无毒的，由于分离出了其原先所含的几乎所有脂类，所以它具有良好的骨传导能力。
通过以下描述，本发明的其它目的、特征和优点将更为明显，结合表示完成本发明方法的装置的附图
给出了非限定性实施例。
图中所示的装置包括一个反应器1，骨组织2放在其中，并有超临界状态的CO2从中通过。
CO2以液态储存于筒3中，通过过滤器4，再由冷冻装置5冷却到某一温度，在该温度下它总呈液态，例如0℃左右，然后再送入缓冲槽6中。在槽6的下游安装一台限量泵7，由它将液态CO2压缩变成超临界状态的压力。在泵7的下游安装一个阀8，使泵7与反应器隔离，以便对反应器1施压或减压，CO2由一个加热器9加热，以使其在离开加热器时呈超临界状态。CO2从反应器1中通过并从与进入端相反的另一端出来。阀10安装在反应器1的下游，以使其与回路隔离。阀10还使得CO2在被送入第一分离器11之前将压力减少。在分离器11的出口12处回收溶解于CO2中的物质。该装置还包括第二个分离步骤，它包括一个使压力进一步降低的阀13和第二个具有用于回收有机物质的出口18的分离器14。视需要可设置两个以上的分离步骤。CO2在分离步骤的出口12、18处由阀15反馈到该回路中。筒3通过单向阀16和阀17与该密闭的回路连通。
下面将讲述本发明的处理骨组织的方法。
依惯例，首先对骨组织进行机械清理，然后切割成需要的尺寸和预定的形状。举例来说，骨组织的形状可以是直角平行六面体、柱状或其它任意适宜形状。然后将该骨组织放入分离反应器1中。在31～60℃的温度和大约1.5×107～4×107Pa的压力下可达到最佳工作状态。
CO2由限量泵7以流体形态泵入。该液体在分离反应器1的上游被预热，以使以超临界形态进行反应器1。
应当指出的是，超临界状态的流体可定义为处于这种温度条件和压力下使其特性介于气体与液体之间的气体。也可称之为“高密度气体”或“膨胀的液体”。对于一种特定的化学物质来说，温度压力曲线上液相和汽相趋于同一种相的那个点被称为临界点。超过该临界温度(Tc)和临界压力Pc，流体就处于所谓“超临界”状态。
超临界状态的CO2通过反应器1可溶解骨质中大部分的有机物质，主要是脂类物质。特别是，它可溶解骨组织中所含髓状组织里的脂肪。
由于超临界流体的特性，这种分离是极为有效的。特别是通常不溶于已知方法中所用化学溶剂里的脂肪可以被超临界状态的CO2所分离。
为了控制由CO2所实现的脂类的分离，分离器11和14里经常没有分离物，而回收脂肪残余物。骨组织与超临界的CO2接触，同时在分离器11、14的出口12、18处回收脂肪残余物流。处理时间与被处理骨组织的重量和输入反应器1中的超临界CO2流成比例的变化。因此，该处理过程可以通过控制通过骨组织的CO2量而被中止，CO2量本身是确定的。实际上，我们已经知道分离的质量产率是恒定的。因此，采用质量流量计系列安装在反应器1的出口处，这样在所用CO2量充足时可以阻断该过程。
应该指出的是，所分离的物质包含98%以上的脂肪。在处理之后，骨组织含有不到平均2%的脂，且这一含量是平均分布的。此外，其耐压强度约为10～20MPa。
值得一提的是，与在化学反应器中常出现的情况相反，不是提取物(主要是脂类物质)被连续使用，而是残余物(骨组织)被连续使用。
因此，超临界状态下的流体还具有强化骨质改善其生物力学特性和净化骨质的双重功效。
以这种方式处理过的骨组织还要进行常规处理，包括化学处理或酶处理，以提取特定的蛋白质。额外的化学处理可采用过氧化氢进行，而酶处理则由蛋白酶来完成。这些额外的处理可保证更有效地从骨组织上提取蛋白质，从而减少了以这种方法处理过的骨组织发生排异反应的危险。
接着，对骨组织进行清洗处理。该清洗过程是通过若干次在30～60℃的连续的蒸馏水浴实现的。
然后进行一个包括对骨组织脱水和消毒的步骤。这一步骤是通过让其通过若干个浓度逐渐增高的乙醇浴，例如70%、95%和100%。值得一提的是，由于乙醇是一种优良的杀病毒剂，它使得有可能在使骨组织脱水的同时提高该生物材料就感染而言的安全性。在30～60℃温度下在通风炉中干燥结束该处理。
在包装之后再对骨组织进行消毒处理。这一消毒处理可通过β-粒子或γ射线(25KGray)辐射来实现。在移植之前对骨组织进行再次切割以使其适应受体骨组织是可行的，这是因为这样处理过的骨组织较坚硬，可以再次切割而不会破碎。
在下表中可看出未经处理骨组织的分析结果(例1)，使用超临界态CO2处理的骨组织的分析结果(例2)，以及除用CO2处理外还经过一个化学处理(例3)或酶处理(例4)步骤的骨组织的分析结果。
给出了四个例子中有机物质OM、有机碳C、N和脂类残余物(脂质)的相应的比例值和耐压强度。所列出的值是平均值;括号中给出了允许范围。
骨组织分析是以牛股骨末端为材料的。
第二组相同的试验是以不同来源的牛骨为材料进行的。在下表中，例1和例4是38次测量的平均值，例2是39次测得的平均值，例3是28次测得的平均值。
就仅用超临界状态的流体进行处理而言(例2)，可注意到在例3和4中C和N含量的减少，更常见的是有机物质的减少。这种减少与髓状组织中非脂组分的消失有关，也与骨组织中可溶性蛋白质的溶解有关。这种手术可明显减少炎症反应并进一步改善骨传导性，正如在动物上实验所证实的。
应当注意的是，这种移植物的生物力学性能从统计学观点来看优于用于制成这种移植物的骨质的(例1)生物力学性能。事实上，处理过的骨组织的耐压强度优于未处理的对照骨组织的耐压强度。
应当注意的是，作为上述方法的改型，清理和切割骨组织的步骤可以如下方式进行。
清理步骤可以通过喷砂处理完成，其中，氧化铝以4×105～106Pa的压力作用于骨质，以除去附着在它上面的所有软组织，包括骨膜。该项技术比完全手工的常规方法更为迅速而有效，而喷砂处理可以由全自动化遥控机器完成。
另一方面，切割步骤可以是喷水切割。这种切割可以精确到10μm，它是由喷纯水完成的，因而避免了由切割工具所致的一切污染，且可将其用于大量生产。
当然，本发明并不局限于所选择的实施例，还包括本领域熟练技术人员能力范围之内的各种改进。因此，由超临界状态流体所进行的清理步骤，可辅以在超临界状态的流体中溶解一种流体，在反应器本身中可对骨组织发生特殊作用。
因而有可能在同一地方(反应器)和同一时间实现蛋白质分离和脱脂反应。另外，这样溶解在超临界状态流体中的流体处于非常有利于此类反应的温度和压力下。
这样，如果需要从髓状组织或胞外骨基质或再次从其强抗原作用主要负责免疫反应的髓状组织的细胞碎片中除去蛋白质，则将下列物质引入反应回路是有利的针对有机物质的去污剂、氧化剂，对其它反应之一专一的酶类，更普通的是适用于所进行处理的任何物质，只要它可被超临界状态下的CO2溶解。
值得一提的是，上述方法和生物材料可以用人或动物骨骼实现和生产。可将其用于移植，特别是用于整形外科，和用于移植物需要承受机械应力的情形中，例如脊髓外科(颈推合并，脊椎盘更换等)，髋臼基再造，关节成形外科、切骨手术、假关节、关节固定术等。
权利要求
1.为了获取可植于人体并适于承受机械应力的生物材料而对动物或人体的骨组织进行处理的方法，其中，骨组上的所有附在骨组织周围的有机物质进行机械清理并将这些有机物质从骨组织上分离，其特征在于它包括至少一个使超临界状态的流体渗透到骨组织里的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于骨组织被放置在经过它的超临界流体流中。
3.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于上述步骤是这样的骨组织中可溶于这种超临界状态流体中的大部分脂类有机物质在该步骤中被分离。
4.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于它包括(a)机械清理骨组织周围的所有有机物质;(b)按预定形状切割该骨组织;(c)清理骨组织以便分离其上对成功的再移植有害的成份，使适于溶解和分离骨组织中大部分脂类有机物质的超临界状态的流体渗透到骨组织里;(d)对所清理的骨组织进行清洗、脱水和消毒。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于清理步骤(c)还包括为了分离出残留于骨组织中的特殊蛋白质而对其进行的化学或酶处理。
6.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于所使用的超临界状态的流体是CO2。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于超临界流体状态下的CO2具有31～60℃左右的温度和承受1.5×107～4×107Pa的压力。
8.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于超临界状态下的流体中含有特别溶解的流体，这些特别流体适于从骨组织中分离蛋白质或其它特殊物质。
9.如权利要求1～8所述的方法，其特征在于上述适于从骨组织中分离特殊蛋白质的特别流体被用于在使用超临界状态流体的步骤之后的清洗步骤中。
10.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于通过机械地喷氧化铝来清理骨组织。
11.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于骨组织是通过高压水喷射而被切割的。
12.如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于在用超临界的流体处理骨组织之后，在20～60℃的温度下使其通过若干个连续的蒸馏水浴而对它进行清洗。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于骨组织在清洗之后通过经过若干个浓度逐渐增大的连续的乙醇浴而被脱水和消毒，然后在通风炉中31～60℃温度下干燥。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于在脱水之后，将骨组织包装后辐射消毒。
15.根据上述权利要求之一所述方法获取的可移植的生物材料，其特征在于它由与超临界状态下的流体接触过的净化骨组织组成，该组织适于移植到人体内有受损骨组织的位置。
16.如权利要求15所述的生物材料，其特征在于骨组织通过用超临界状态的流体分离的方法清除了大部分的脂类有机物质。
17.如上述权利要求之一所述的生物材料，其特征在于其脂类残余少于2%，耐压强度为10～20MPa左右。
全文摘要
本发明涉及一种处理取自动物或人体的骨组织的方法，以及相应的可移植的生物材料。根据本发明，让一种超临界状态的流体渗入骨组织。如此处理过的骨组织随后便可实施分离特殊蛋白质的步骤。这种组织用来安放在受损的骨组织上且具有起码与天然骨质相当的机械性能。
文档编号A61L2/00GK1090206SQ9311999
公开日1994年8月3日 申请日期1993年12月21日 优先权日1992年12月21日
发明者J·法吉斯, A·马蒂, D·康比斯, J·-S·康多雷特 申请人:生物园地有限公司