专利名称：冬虫夏草活性组份及其分离方法
技术领域：
本发明涉及一种冬虫夏草活性组分的分离方法，以提取出可抑制活化的人类肾膈细胞，使改善gA肾炎，避免病程进行至尿毒症的活性成分(Ha—A)。
近年来药理学研究证实，一种寄生于鳞翅目昆虫的幼虫，而长出子座的麦角菌科冬虫夏草真菌，其活性与药理作用系多面，其包括(一)免疫系统冬虫夏草浸出液可提高动物巨噬细胞吞噬指数、刺激第一介白质(IL—1)分泌、诱发脾Thy—1细胞增生、刺激免疫球蛋白M(IgM)合成与分泌、T淋巴细胞增殖、和B淋巴细胞表现更多之第二介白质(IL—2)受器。其水抽出液并可提高常人及白血病患者的自然杀手细胞活性。
(二)肾功能方面冬虫夏草可减轻肾小管损伤，保证其细胞膜上Na+-K+-ATPase酶，其作用可能与减少细胞脂质过氧化有关；亦可减低慢性肾功能不全及改善大白鼠的血尿与延缓肌酸酐值上升。
(三)心血管系统冬虫夏草菌丝抽出物可增加实验动物冠状动脉血流量，降低动脉、脑及周边血管阻力及降压。其水溶性主成份腺苷具有松驰血管平滑肌及扩张血管的活性，冬虫夏草亦可捉进血小板生成，此外冬虫夏草亦有抗缺氧、抑制脑单胺氧化酶(MAOB)的作用。然而，上述药理作用因尚未采用完全纯化的冬虫夏草活性成份进行，并且有关改善肾病变之组织学变化及临床症状的研究亦未曾有采用免疫球蛋白A(IgA)肾炎之模式进行。
IgA肾炎临床上以阵发性血尿和/或蛋白尿表现，往往以慢性病表现，人们于罹患本症后约20％其病程会逐渐进行至尿毒症，迄今尚无证实有任何结构的疗剂可阻止疾病的进行，故以其他方法提取并寻找治疗药为十分重的课题。
IgA肾炎之致病机制是由于致肾病性IgA免疫复合体沉积于肾丝球的肾膈，使原本呈休止态的肾膈细胞活化，活化的肾膈细胞会放出第一介质(IL—1)、第六介白质(IL—6)、肿瘤坏死因子(TNFα)，使肾膈细胞增生，增生之肾膈细胞会释出IL—1、IL—6、血小板生长因子(PDGF)、转型生长因子-β(TGF-β)等，此等细胞激素及生长因子的作用如同自泌素(autocoids)，会使肾膈的增生呈恶性循环，且会促使肾膈细胞放出O2-、H2O2、血小板活化因子(PAF)、前列腺素E2(PGE2)、thromboxan B2(TXB2)、及neutral proteinase等，因此造成肾膈增生、丝球硬化、导致肾基底膜的伤害。
在过去业已建立离体人类肾膈细胞的培养方法、人类肾膈细胞活化后放出细胞激素及会伤害肾基底膜的化学物质的离体模式，并建立IgA肾炎的动物模式。人们利用抑制离体的活化肾膈细胞，急性毒性试验及IgA肾炎的动物模式找出可治疗IgA肾炎之特定组成和一种活性成份。
本发明的目的是(1)将自冬虫夏草菌丝体中所产生的特定组成(fractions)及一活性成份，用于(a)抑制活化的肾膈细胞增殖、(b)改善动物模式IgA肾炎动物的肾组织病理学变化及血尿/蛋白尿。以及(2)获取此“活性组份”及特定“活性成份”有分离方法。
本发明的上述目的是通过以下方式实现的一种冬虫夏草活性组成及其分离方法，其特征在于采冬虫夏草(子座部份)于45—50℃暗处烘干，粉碎后以20倍甲醇(w/v)浸泡24小时，抽出液经减压浓缩，粗抽出物以硅胶柱层析法分离，收集正己烷/乙酸乙酯比例1∶1(v/v)至净乙酸乙酯范围的可冲提部分(F—2层)，于较大规模的分离程中，亦可将甲醇抽出物(或F—2层)进行较细分割的正己烷-乙酸乙酯混合液冲提，以乙酸乙酯渐增方式进行，收取比例为1∶2(v/v)的冲出部分(C—11)，F—2与C—11层均具较明显的“可抑制人类肾膈细胞活化”生物活性，此二组“活性组成”均可于4℃保存至少三个月而仍保有上述活性；欲自“活性组成”中获取“活性成份”时，可将C—11层用制备硅胶薄层层析法再除去一些杂质，其展开液用正己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)，且展开二次，回收Rf＝0.5—0.7范围(T—4区带)，利于后续的半制备级逆相式高效液相层析再对T—4层进行纯化，其中，逆相式层析冲提液为甲醇，管柱固定相为C18(8×250-mm，5-μm)型，洗提液流速为2ml/min，紫外光检测器波长设定于254nm，“活性指标成份(HA—A)”即可被完全纯化。
其特征在于，将冬虫夏草菌株编号(CS—1)接种于葡萄糖 2％胨 0.5％麦芽抽出物 2％土豆葡萄糖肉汤培养液24g/l成份的液相培养基中，于26±1.0℃下静置培养(培养期30天)，收集其菌丝体，于45—50℃烘干，所获干重物研碎后以20倍体积的甲醇抽取24小时，粗抽出物检压浓缩(VGH—CS—1—MX)，VGH—CS—1—MX采用逆相式高效液相层析分析出含有H1—A活性指标成份的“活性组成”与“活性成份”的方法。
其特征在于，从冬虫夏草中分离出的“活性组成”F—2，可计算出从F—2中所纯化的活性天然物H1—A成份的GI50(50％增殖抑制)为40微莫耳(μM)，由此推算出H1—A疗剂量约为40毫克。
其特征在于，其中活性成份的光谱资料与结构为
(1)分子式C28H42O2(2)1H-NMR参见图6(3)质子碎片(EIMS)(m/z)410分子离子，基峰，395，367，349，325，285，267，253，241，213，191，173，125。
(4)13C-NMR(CDCl3)(δ)11.95(q)，17.65(q)，19.66(q)，19.97(q)21.12(q)，23.73(q)，24.59(t)，27.74(t)，29.47(t)，30.69(t)，33.11(d)，34.67(t)，35.57(t)，40.31(d)，41.81(d)，41.89(t)，42.35(s)，42.88(d)，48.43(d)，53.35(d)，72.05(d)，126.81(d)，132.15(d)，134.05(s)，135.49(d)，160.96(s)，161.60(s)，186.65(s)，由于IgA肾炎临床上以阵发性血尿(宏观性或微观性)及/或蛋白尿表现，IgA肾炎往往以慢性病表现，它以急性恶化中间伴随着无症状之病程在进行。据报导，法国，意大利及西班牙的数据显示发病后二十年大约20至30％病人其病程会进行到肾衰竭。因此可以预估大约由诊断出此病后算起每年约1—2％病人逐渐进行至肾衰竭。很不幸的，迄今并未有证实可以完全阻止该疾病进行的治疗方法。为何会形成IgA肾炎，迄今不详，然而由IgA肾炎之肾脏切片上可以见到大量之IgA及第三补体(C3)沉积于肾膈部，表示很可能为IgA免疫复合体沉积于肾膈部再经异径路活性补体所导致肾伤害。
这些致肾病性IgA免疫复合体如何导致肾丝球伤害，简述之则为原本呈休止状态之肾膈细胞，经由致肾病性免没负合体的刺激后，会使肾膈细胞活化，活化的肾膈细胞会放出第一介白质(IL—1)，第六介白质(IL—6)，肿瘤坏死因子(TNFα)，使肾膈细胞增殖、分化，而放出各种生长因子包括血小板生长因子，转型生长因子β(TGF-β)等，这些细胞激素及生长因子的作用如同自泌素，会使肾膈的增生呈恶性循环，且会促使肾膈细胞放出O2、H2O2、血小板活化因子、前列腺素、Thromboxan B2(TXB2)、Neutral proteinaxe等，因此造成间质增生、丝球硬化、导致肾基底膜的伤害。
由以上所述可知治疗上人们希望由阻止IgA合成或IgA免疫复合体处着手，然而在今日免疫学之技术是无法作到，故人们退而求其次，希望以特殊的分离方法，于习见的自然物中提取出可抑制活化的肾膈细胞，使之不再增殖及放出细胞激素及成长因子的药物结构上着手；当活化的肾膈细胞被抑制不再增殖，往后释出细胞激素、生长因子的步骤即被阻断，因此吾人以抑制活化的肾膈细胞增殖为吾人寻找治疗药的体外筛选方法。在我们的实验室可将肾膈细胞活化，以〔3H〕-胸苷结合的方法可作为DNA合成的指标，故人们以上述培养人类的肾膈细胞，加入IL—1及IL—6使之活化，以加入冬虫夏草之“活性成份”降低〔3H〕-胸苷结合作为离体筛选抑制活化之肾膈细胞增殖的药物模式。
体内的筛选系统动物模式必须具备专一性，可造成肾组织损伤及与相对应之人类疾病非常相似的特性，基于上述的考虑，本发明实验系采用Rifai A等人所建立的IgA肾炎模式，所使用的抗原为R36A，它系由一种肺炎链球菌所纯化出来的一种C一多糖。使用的抗体是对抗R36A的IgA单株抗体，该种鼷鼠骨髓瘤细胞株TEPC—15融合瘤细胞株可生产(分泌)抗phosphorylcholine(PC)的IgA单株抗体，此单株抗体会非常专一地与PC结合。当上述抗原和抗体结合在一起，即形成IgA免疫复合体，实验上系自鼷鼠腹腔注射抗原(R36A)，由尾静脉注射抗体(抗R36A的IgA单株抗体)，在鼷鼠血管内会形成IgA免疫复合体，经血液循环至肾脏而沉积于肾膈部，引发血尿/蛋白尿。将老鼠的肾脏取出作肾脏组织切片之组织学检查，以ematoxyline-Eosin(HE)染色可见及和人类的IgA肾炎相同的变化一一即肾膈细胞增殖，肾膈增生。复以冰冻切片作荧光染色可见到和人类的IgA肾炎相同之变化一一即IgA及沉积于肾膈部。
毒性冬虫夏草对鼷鼠腹腔注射，其LD50值为21.7±2.6g/kg静脉注射之LD50为24.5±2.2g/kg。口服最大耐受量为252.5—300g/kg，说明无论采静脉注射、腹腔注射或灌胃，其毒性均非常低，而本发明案所作的急毒性测试，其方法为以含2％的“活性组成”饲料喂食ICR鼷鼠5天之后将之牺牲，以检视有无急毒性。
故，冬虫夏草系一药理作用广泛，且毒性非常小的药物，在过去的研究已知“IgA肾炎”是一种由免疫机制所引发的肾炎，且目前无特殊药物可治疗，基于此原因，致人们以冬虫夏草为研究对象，并以“抑制体外培养活化的人类肾膈细胞增生”及“改善体内诱发小鼠发生IgA肾炎”为筛选方法，寻找冬虫夏草中对离体能抑制活化的肾膈细胞增生，体内可阻止IgA肾炎发生及/或恶化的有效“活化组成”与“活性成份，以期能用于IgA肾炎的治疗。
而有关获取“活性组成”与“活性成分”的说明将通过附图和实施例作进一步的详细说明。
图1为本发明自冬虫夏草子座抽取活性组成及活性成份(H1—A)的流程。
图2为本发明活性组成T-4(编号CS-F2-C11-T4)的逆相液相层析谱。
图3为本发明完全纯化的活性成份H1-A的逆相层析谱。
图4为本发明的冬虫夏草液相培养菌丝体甲醇抽出物的逆相层析谱。
图5为本发明活性成份H1-A结构图示。
图6为本发明活性成份H1-A的氢核磁共振(1H-NMR)谱。
参见图1，为本发明自冬虫夏草子座抽取活性组成及活性成份(H1-A)的方法，首先将冬虫夏草成品采烤箱烘干(35—60℃)或风干均可，由于冬虫夏草成品含水量甚高，干燥处理可避免后续抽取时带出较多之极性物质，因而影响硅胶层析纯化之表现。干品须用研磨机或粉碎机研碎，以提高抽取的效率。
由于冬虫夏草所含活性成份(指对本发明申请说明书所述之可抑制活化之肾膈细胞与改善肾功能而言)，属较低极性之范围，用甲醇(或其他低碳数之醇类)、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷抽取均可完全抽取。若将活性成份回收高与一并抽取到之非极性杂质较少等因素一并考虑，则以使用甲醇和乙酸乙酯最为适当，实施例中则使用甲醇，而其抽取之程序则如图中流程所述者。
而本发明层析方法请附参第2—3图，其可分为二种范围(a)自小规模冬虫夏草检体中测知其所含生物活性及一种活性成份的方法。
(b)自较大规模的冬虫夏草中，依活性指标建立层析流程，以获取“活性组成”与一种“活性成份”。
就a项而言(较小规模层析法)将少许冬虫夏草甲醇抽出液通过逆相式小管柱(reversedphasecartridgecolumn，注，此管柱须先行活化)，并持续以甲醇冲提，活性组成与活性成份并不被吸附，但可除去不少非常低极性之杂质。冲提液即可进行筛检或以逆相式高效液相层析法，对活性成份(H1-A)进行定量(层析条件见实施例所述)，浓缩物并可进行活性初筛。
若用乙酸乙酯提取冬虫夏草，则将抽取液予以适当浓缩后，加入等比例的正己烷(或石油醚)，混合液先行以玻璃棉等方式过滤，而后通过一支小型硅胶柱，管柱持续以乙酸乙酯/正己烷(1∶1V/V)冲提，冲提液经浓缩后即可如前述进行高效液相层析或活性检测。
就b项而言(较大规模层析法)由于冬虫夏草之宿主为幼虫期昆虫，故成品堆积极多的低极性代谢物，造成较多属于低极性杂质很大的干扰，故于纯化流程纳入二段式硅胶层析(即重复进行二次(正相)或硅胶层析)第一次层析乃在分划活性组成与其他大量较诸活性成份的极性更低的一群杂质，大致将后者以正己烷混合低比例乙酸乙酯的方式冲提出(如正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1v/v)，然后迅即拉升移动相极性，使含不只一种活性成份的“活性组成”冲提出来。此步骤一则可以截除高低两端的杂质，立即提供活性增幅甚高的活性组成即可进行病理动物实验之用，另者因而大幅减少第二次硅胶层析的规模。依冬虫夏草成份特性，前其层析可视为极性大分划，后者由可视为对各特定活性组成与活性成份的细分划，而不必视为重复。若拟自菌丝体抽出液进行层析纯化，则仅须进行前述第二阶段之过程即可，因菌丝体所含的低极性杂质较子座成品大幅为低。
本发明的较佳实施例1.采用冬虫夏草(子座部份)于45—50℃暗处烘干，粉碎后以20倍甲醇(w/v)浸泡24小时，抽出液经减压浓缩，粗抽出物以硅胶柱层析法分离，收集正己烷/乙酸乙酯比例1∶1(v/v)至净乙酸乙酯范围的可冲提部分(F—2层)。于较大规模的分离流程中，亦可将甲醇抽出物(或F—2层)进行较细分划的正己烷—乙酸乙酯混合液冲提，以乙酸乙酯渐增方式进行，收取比例为1∶2(v/v)之冲出部分(C—11)。F—2与C—11层均较明显的“可抑制人类肾膈细胞活化”生物活性，此二组“活性组成”均可于4℃保存至少三个月而仍保有上述活性。
欲自“活性组成”中获取“活性成份”时，可将C—11层用制备硅胶薄层层析法再除去一些杂质，其展开液用正己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)，且展开二次，回收Rf＝0.5—0.7范围(T—4区带)。此过程虽与前述硅胶柱层析的分离机制相同，但仍可再除去C-11层的一些杂质，以有利于后续的半制备级逆相式高效液相层析再对T—4层进行纯化。其中，逆相式层析冲提液为甲醇，管柱固定相为C18(8×250-mm，5-μm)型，冲提液流速为2ml/min，紫外光检测器波长设定于254nm，“活性指标成份(H1-A)”可被完全纯化。
总结获取“活性组成”及纯化活性成份(H1—A)的流程方法请参阅附图1。活性组成T-4的逆相液相层析谱及完全纯化的H1-A纯度请参阅附图2、3。
菌丝体培养及鉴定生产“活性指标成份”方法如下所述。
将冬虫夏草菌株编号(CS-1)接种于含下列成份的液相培养基中葡萄糖 2％胨 0.5％麦芽抽出物 2％土豆-葡萄糖肉汤培养液24g/l于26±1.0℃下静置培养(培养期30天)，收集其菌丝体，于45—50℃烘干。所获干重物研碎后以20倍体积之甲醇抽取24小时，粗抽出物检压浓缩(VCH-CS-1-MX)，VGH-CS-1-MX采逆相式高效液相层析分析，证实含有H1-A活性指标成份(见图4所示)。
总结项一内容涵盖自半人工冬虫夏草与液相菌丝培养中获取及鉴定“活性组成”与“活性成份”的方法。
2.“活性组成”与“活性成份(H1-A)”a.“活性组成”指由甲醇抽出后至纯化出活性成份(H1-A)的分离流程中，各层析的成分中离体活性表现最强者，包括F-2、C-11、T-4。
b.“活性成份”指H1-A(光谱资料与构造及氢核磁共振(1H-NMR)谱参阅附图5，6所示)。另外，为了确认上述“活性组成”的应用潜力，避免其为一明显有毒或致突变物质，于F-2分划阶段曾进行小白鼠急毒性试验及埃姆斯试验(Ames Test)，均显示无明显毒性及致突变性。
3.本发明申请案所采行的检测方式有二(离体与活体检测方式各一)。其一为利用离体抑制活化的人类肾膈细胞为模式，测定冬虫夏草“活性组成”或“活性成份”处理下，对受第一介白质及第六介白质所导致的活化受抑制的程度为活性指标，肾膈细胞活化程度，则以同位素标示之3H-胸苷转化成DNA之效率为依据(参阅附表1—1至1—5)。
4.急性毒性测试以含及不含2％CS-F2饲料喂食ICR鼷鼠各6只5天之后，将之牺牲，其结果如附表2所示，以IgA免疫复合体诱发IgA肾炎的对照组会引起肝肿大现象(平均肝重/体重比值为7.12±0.12)喂食2％F-2后会明显改善肝肿现象(平均肝重/体重比值为6.75±0.09)，其余肝功能则两组均在正常范围内(参阅附表2所示)。
5.活体动物模式则采分别自腹腔注射鼷鼠抗原(R36A)与尾静脉注射抗体(α-R36A-IgAmAb)方式，使产生类IgA肾炎症候，动物有血尿与蛋白尿现象，病理学检查亦可显示IgA肾炎病变。冬虫夏草“活性组成”(如F-2)则以0.5％与1％比例混合于饲料中，以测试其改善前述症侯及病理表现的效果(参阅附表3—1至3—4所示)，亦支持冬虫夏草有效“活性组成”确有改善实验性“IgA肾炎”的效果。
综上所述，本发明从冬虫夏草中分离的“活性组成”F-2，在体外可抑制活化之肾膈细胞增生，以阻断往后造成肾伤害之步骤的进行，在体内可阻止IgA肾炎恶化，并改善血尿/蛋白尿，且F2并不会产生急性毒性，甚至可改善因IgA免疫复合体所诱发之肝肿大现象，计算从F2中所纯化出来的活性天然物H1-A成份之GI50(50％增殖抑制)为40微莫耳(μM)，由此推算即大约H1-A40毫克，在治疗人类IgA肾炎即有疗效，且本发明的此种冬虫夏草活性组成及分离方法并未见诸任何公开刊物上，符合发明专利申请的三性要求。
以上所述者乃是本发明以特定分离方法提取出特殊结构活性成份之一较佳具体的实施例，若依本发明的构思所作的改变，其功能作用仍未超出说明书与图示所包括的精神时，均应在本发明的保护范围内。
表1-1冬虫夏草之甲醇抽出物的分划F-2在离体对活化的人类肾膈细胞的抑制作用050微克/微升100微克/毫升F-2(n＝3) 051.0±6.3％*94.0±11.3％对照组(n＝3)00 0*抑制百分比对照组为不加冬虫夏草的区别表1-2冬虫夏草之甲醇抽出物的分划C-11在离体对活化的人类肾膈细胞的抑制作用050微克/微升 100微克/毫升C-11 (n＝3) 088.4±11.6％*90.4±11.8％F-2 (n＝3) 023.9±2.3％*84.4±10.5％对照组(n＝3) 00 0*抑制百分比对照组为不加冬虫夏草的区别表1-3冬虫夏草之甲醇抽出物的成分T-4在离体对活化的人类肾膈细胞的抑制作用050微克/微升100微克/毫升C-11(n＝3) 069.0±9.7％*99.0±10.5％T-4(n＝3) 085.0±5.0％98.0±0.7％对照组(n＝3) 00 0*抑制百分比对照组为不加冬虫夏草的区别表1-4冬虫夏草之甲醇抽出物的成分H1-A在离体对活化的人类肾膈细胞的抑制作用010微克/毫升 20毫克/毫升 40微克/毫升50毫克/毫升T-4 (n＝3) 042.2±9.9％*66.3±18.5％71.5±2.5％97.9±3.5％H1-A (n＝3) 023.0±9.6％ 51.2±11.9％66.3±6.8％82.7±11.5％对照组(n＝3) 000 0*抑制百分比对照组为不加冬虫夏草的区别表1-5冬虫夏草之甲醇抽出物的成分H1-A及阳性对照(Lovastatin)在离体对活化的人类肾膈细胞的抑制作用20微莫耳 50微莫耳 75微莫耳 1000微莫耳H1-A (n＝3)30.8±4.9％61.6±7.5％69.5±5.6％83.2±3.5％Lovastatin(n＝3)19.8±2.0％37.1±4.3％60.9±3.8％73.0±4.0％对照组(n＝3) 0 0 0 0
表2
<p>表3-1饲以正常饲料及分别以0.5％与1％比例的F-2混合于饲料对IgA肾炎鼷鼠的组织病理学影响No.1No.2No.3No.4No.5No.6Total(1号) (2号) (3号) (4号) (5号) (6号) (总合)1％F-2 (n＝6)2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 12+*0.5％F-2 (n＝6)4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 3+ 22+对照组(n＝6) 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 24+等级0，1+，2+，3+，4+(5级)H&E染色；1％F-2，v.s.对照组P＜0.05喂食1％F-2组有显著的组织病理学上的改善表3-2饲以正常饲料及分别以0.5％与1％比例的F-2混合于饲料对IgA肾炎鼷鼠的肾脏免疫病理学结果IgA免疫复合体沉积No.1 No.2 No.3No.4 No.5No.6Total(1号) (2号)(3号)(4号)(5号) (6号) (总合)1％F-2(n＝6) 0 1+ 1+ 01+ 1+ 4+*0.5％F-2 (n＝6) 1+1+ 1+ 1+ 1 1+ 6+对照组(n＝6) 2+2+ 2+ 2+ 2+ 1+ 11+等级1，1+，2+，3+(4级)1％F-2，v.s.对照组P＜0.05喂食1％F-2组有显著减少肾膈部的IgA免疫复合体沉积表3-3饲以正常饲料及分别以0.5％与1％比例的F-2混合于饲料对IgA肾炎鼷鼠的肾脏免疫荧光检查结果第三补体沉积No.1 No.2No.3No.4No.5No.6Total(1号)(2号)(3号) (4号) (5号) (6号) (总合)1％F-2 (n＝6)1+ 01+ 0 1+ 0 3+*0.5％F-2 (n＝6)2+ 1+ 2+ 0 3+ 1+ 9+对照组 (n＝6)2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 14+等级0，1+，2+，3+(4级)1％F-2，v.s.对照组P＜0.05喂食1％F-2组有显著减少肾膈部的第三补体沉积表3-4饲以正常饲料及分别以0.5％与1％比例的F-2混合于饲料对IgA肾炎鼷鼠的尿检查结果血尿 及/或 蛋白尿 (＞+/3+)对照组(n＝6)0.5％F-2(n＝6) 1％F-2(n＝6)第5天2/6(33.2％) 2/6(33.2％) 2/6(33.3％)第6天2/6(33.3％) 2/6(33.2％) 2/6(33.3％)第7天3/6(50.0％) 1/6(16.6％)*1/6(16.6％)**P＜0.05到第七天，喂食0.5％及1％F-2组的鼷鼠有显著减少血尿及蛋白尿
权利要求
1.一种冬虫夏草活性组成的分离方法，其特征在于采冬虫夏草(子座部份)于45—50℃暗处烘干，粉碎后以20倍甲醇(w/v)浸泡24小时，抽出液经减压浓缩，粗抽出物以硅胶柱层析法分离，收集正己烷/乙酸乙酯比例1∶1(v/v)至净乙酸乙酯范围之可冲提部分(F—2层)放于大规模的分离程中，亦可将甲醇抽出物(或F—2层)进行较细分别的正己烷-己酸乙酯混合液冲提，以乙酸乙酯渐增方式行之，收取比例为1∶2(v/v)的洗提部分(C—11)，F—2与C—11层均具较明显的“可抑制人类肾膈细胞活化”生物活性，此二组“活性组成”均可于4℃保存至少三个月而仍保有上述活性；欲自“活性组成”中获取“活性成份”时，可将C—11层用制备硅胶薄层层析法再除去一些杂质，其展开液用正己烷/乙酸乙酯(1∶1v/v)，且展开二次，回收Rf＝0.5—0.7范围(T—4区带)，利于后续的半制备级逆相式高效液相层析再对T—4层进行纯化，其中逆相式层析洗提液为甲醇，管柱固定相为C18(8×250-mm，5-μm)型，洗提液流速为2ml/min，紫外光检测器波长设定于254nm，“活性指标成份(H1—A)”即可被完全纯化者。
2.如权利要求1项所述的一种冬虫夏草活性组成的分离方法，其特征在于，将冬虫夏草菌株编号(CS—1)接种于葡萄糖 2％胨 0.5％麦芽抽出物 2％土豆葡萄糖肉汤培养液24g/l成份的液相培养基中，于26±1.0℃下静置培养(培养期30天)，收集其菌丝体，于45—50℃烘干，所获干重物研碎后以20倍体积的甲醇抽取24小时，粗抽出物减压浓缩(VGH—CS—1—MX)，VGH—CS—1—MX采逆相式高效液相层析分析出含有H1—A活性指标成份的“活性组成”与“活性成份”的方法者。
3.如权利要求1项所述的一种冬虫夏草活性组成的分离方法，其特征在于，从冬虫夏草中分离出的“活性组成”F—2，从F—2中所纯化的活性天然物H1—A成份的GI50(50％增殖抑制)为40微莫耳(μM)，H1—A疗剂量约为40毫克。
4.如权利要求1项所述的一种冬虫夏草活性组成的分离方法，其特征在于，活性成份的结构为
全文摘要
一种冬虫夏草活性组份及分离方法，其主要系以包括(一)活性组分中特定之活性成分之结构、(二)获取此活性组份及特定活性成分之分离方法；并说明如何以该分离出之“活性组分”中特定“活性成分(H1-A)”，应用于改善“被诱发IgA肾炎之鼷鼠的肾病变及临床症状”，以抑制人类活化的肾隔细胞。
文档编号A61P13/12GK1115671SQ9410821
公开日1996年1月31日 申请日期1994年7月25日 优先权日1994年7月25日
发明者林清渊, 肖明熙, 王次男 申请人:林清渊