专利名称：一种新型肿瘤多药抗药性逆转剂的制作方法
技术领域：
本发明属医学肿瘤学临床用药物，尤其是一种新型的肿瘤多药抗药性逆转剂，适用于多药抗药性肿瘤的逆转治疗的场合。
肿瘤病人在经过化学治疗后，往往容易出现多药抗药性，而目前用于MDR逆转研究的逆转剂有异搏定(VER)，环孢霉素A、三苯氧胺等，这些药物与抗癌药物联合用时，虽能部分逆转MDR，但往往具有明显的心血管毒性和神经毒性，限制其在临床上肿瘤治疗中的应用。如异搏定在体内达到逆转MDR浓度(血浆浓度6μmol/L)时将引起严重的心脏毒性和低血压，虽然右旋异搏定比外消旋异搏定的心脏毒性小10倍，但其能明显增强蒽环类等药物的骨髓抑制作用，并且也有明显的心血管毒性反应。口服大剂量三苯氧胺或静脉注射环孢霉素A虽可部分逆转肿瘤MDR，但同时可带来多种毒副作用，如震颤、反射亢进、感觉迟钝、癫痫大发作等神经毒性，心电图出现Q-T间期延长，骨髓抑制时间延长，高胆红素血症，低镁血症等严重毒性反应。因此，一旦肿瘤病人出现多药抗药性，由于没有良好的MDR逆转剂可供临床选用，多药抗性肿瘤的化疗效果极差。
茶多酚(Tea Polyphenol’s，TP)是从茶叶中提纯而得，目前在医学领域用于治疗因化疗、放疗或其它原因引起的血小板减少症(商品名替保)，也用于肿瘤化学预防的基础研究。
本发明提供的肿瘤多药抗药(MDR)逆转剂，为茶叶中提取的茶多酚，将茶多酚作为肿瘤多药抗药性逆转剂，应用于多药抗药性肿瘤的逆转治疗。
本发明提供的MDR逆转剂，一定浓度的茶多酚可增加MDR细胞摄取抗癌药物，使抗药性细胞对原有抗癌药物重新具有敏感性，即具有增强抗癌药物对MDR细胞的杀伤作用。
本发明提供的MDR逆转剂，克服了茶多酚的传统用途，首次提出茶多酚具有逆转肿瘤细胞的MDR作用，将其作为新型的MDR逆转剂，具有意想不到的效果，其优点有属纯天然提取物，无毒性，临床应用安全可靠，病人易于接受，原料丰富，价廉，易于推广应用，具有良好的逆转肿瘤MDR的作用，是一种新型优质的MDR逆转剂。
本发明的目的在于寻找一种克服现有MDR逆转剂存在严重毒付作用、临床应用受到限制等缺点，开发一种临床上应用无毒性、安全可靠的新型MDR逆转剂。
本
发明内容
通过以下实施例作进一步说明。
实施例1茶多酚与异搏定对MDR细胞(K562/DOX和SW1116/DOX)的逆转效果比较。
茶多酚系浙江农业大学提供原料，自行纯化，用RPMI1640培养液稀释成所需浓度，异搏定作对照用MDR逆转剂。对数生长期细胞接种于96孔培养板内，每孔2×104个细胞，先分别加入VER10μmol/L)、茶多酚(15μg/ml)，然后加入抗癌药，浓度范围为0.01～10μmol/ml，培养72hr后，每孔加入1mg/ml MTT 50μl，37℃放置6hr，离心(2000rpm，10min)，倾去上清液，每孔加入100μl酸化异丙醇，待蓝色结晶完全溶解后，用ELISA比色计570nm处比色。求出半数抑制浓度IC50，计算逆转倍数(Rcvcrsal Indcx，RI)。结果如下
表1.VER和TP对SW1116/Dox细胞抗药性的逆转倍数IC50(μg/ml)药物 逆转保数(RI)*Control+VER+TPDOX6.400.0840.18276.235.2EPI3.550.0810.31043.811.5DAU3.700.0640.35157.810.5Vin3.250.0550.07959.141.1Mito 0.890.1000.0788.9 11.4HHT9.180.7350.81012.511.3VP-16 8.100.9101.0308.9 7.9Cyta ＞10.0 ＞10.0 ＞10.0 - -FudR ＞10.0 ＞10.0 ＞10.0 - -*RI＝IC50(-VER)/IC50(+VER)或RI＝IC50(-TP)/IC50(+TP)。
表2.VER和TP对K562/Dox细胞抗药性的逆转倍数IC50(μg/ml)药物 逆转倍数(RI)*Control+VER+TPDOX4.65 0.0630.09773.847.9DAU3.25 0.0800.09040.636.1EPI5.73 0.0730.19078.530.2Vin5.50 0.0450.059122.2 93.2Mito 2.40 0.0510.08247.129.3HHT0.2120.0370.2005.7 1.1VP-16 0.2290.0630.1003.6 2.3Cyta 10.0 8.09010.0 1.2 1.0FudR ＞10.0 ＞10.0 ＞10.0 - -*RI＝IC50(-VER)/IC50(+VER)或RI＝IC50(-TP)/IC50(+TP)。
以上实施例说明，茶多酚对MDR细胞的抗药性具有明显的逆转作用。用SW1116/DOX细胞研究逆转效果表明，茶多酚对阿霉素(DOX)、表阿霉素(EPI)、柔红霉素(DAU)、长春新碱(VIN)四种抗癌药的逆转效果较VER稍差，而对高三尖杉酯碱(HHT)、米托蒽醌(Mito)的逆转能力差不多，对其他药物，茶多酚和VER均无逆转效果。用K562/DOX细胞研究表明，茶多酚对DOX、EPI、DAU、VIN、Mito的逆转效果稍低于VER，但对HHT、鬼臼乙叉甙(VP16)无明显的逆转作用，对非MDR类药物如阿糖胞苷(Cyta)、氟脲嘧啶核苷(FudR)也未观察到逆转效果。说明茶多酚与VER逆转多药抗药性的特征颇为相似。
实施例2茶多酚对K562细胞和K562/DOX细胞摄取药物的影响。
将细胞(1×106/ml)先与茶多酚作用15分钟，然后分别与DOX、EPI、或DAU(10μg/ml)37℃温育90分钟，用PBS溶液洗2次。细胞内DOX、EPI或DAU用0.3M HCI-50％乙醇0.2ml提取1hr，9000×g离心20秒，取0.1ml上清液与1ml双蒸水混合，用荧光分光光度仪测定药物含量，激发波长为490nm，发射波长为590nm。每个标本均做3个复管。结果如下表3 TP对K562和K562/DOX细胞摄取阿霉素的影响细胞内阿霉素浓度(μg/ml)TP浓度(μg/ml) K562K562/DOX01.743±0.1311.043±0.01211.760±0.1211.128±0.03651.818±0.1361.230±0.083101.901±0.0791.346±0.219151.838±0.1011.640±0.137201.995±0.0571.890±0.055302.043±0.0891.722±0.155表4 TP对K562和K562/DOX细胞摄取表阿霉素的影响细胞内表阿霉素浓度(μg/ml)TP浓度(μg/m1) K562 K562/DOX02.185±0.2051.315±0.05312.443±0.0851.394±0.06252.598±0.1661.419±0.016102.140±0.3221.385±0.067152.320±0.0041.491±0.055202.135±0.2301.514±0.027302.464±0.1501.981±0.323表5 TP对K562和K562/DOX细胞摄取柔红霉素的影响细胞内柔红霉素浓度(μg/ml)TP浓度(μg/ml)K562K562/DOX05.233±0.3942.452±0.41315.391±0.1732.832±0.15555.193±0.2972.825±0.093105.067±0.3342.880±0.109155.663±0.2042.891±0.096205.467±0.2873.436±0.093305.500±0.1724.646±0.184表6 TP对K562和K562/DOX细胞摄取不同浓度阿霉素的影响K562 K562/DOXDOX(μg/ml) -TP +TP -TP +TP10.654±0.037 0.600±0.1190.278±0.020 0.532±0.06251.012±0.045 1.100±0.0450.596±0.170 0.886±0.088102.076±0.011 2.016±0.4581.056±0.147 1.754±0.025203.928±0.045 3.778±0.1162.286±0.144 3.482±0.059405.330±0.173 5.354±0.0424.102±0.908 5.128±0.102TP浓度为30μg/ml。
表7 TP对K562和K562/DOX细胞摄取不同浓度表阿霉素的影响K562 K562/DOXEPI(μg/ml)-TP+TP -TP +TP10.812±0.226 0.804±0.0460.362±0.014 0.628±0.07451.762±0.240 1.522±0.0140.800±0.074 1.186±0.002102.332±0.214 2.518±0.0881.394±0.088 1.914±0.150205.378±0.432 4.914±0.7943.532±0.090 4.834±0.292406.208±0.881 6.118±0.6764.390±0.150 5.956±0.186TP浓度为30μg/ml。
表8 TP对K562和K562/DOX细胞摄取不同浓度柔红霉素的影响K562 K562/DOXDAU(μg/ml) -TP +TP -TP+TP10.949±0.125 0.961±0.1630.279±0.028 0.497±0.09852.143±0.011 2.257±0.0720.785±0.048 1.270±0.086103.785±0.327 3.938±0.2092.091±0.238 3.762±0.224204.250±0.156 4.448±0.0333.041±0.271 4.703±0.24O406.153±0.104 6.010±0.2935.654±0.514 5.843±0.351TP浓度为30μg/ml。
以上实施例反映了不同浓度茶多酚对蒽环类药物(DOX、EPI、DAU)在K562细胞及其抗药株K562/DOX细胞内药物积聚的影响。在没有茶多酚存在时，两种细胞对药物积聚能力的大小依次为DAU＞EPI＞DOX。不同浓度茶多酚对K562细胞摄取DOX、EPI、DAU无明显影响。然而，随着茶多酚浓度的增加，K562/DOX细胞对DOX、EPI、DAU的摄取明显提高，当茶多酚达到30μg/ml时，K562/DOX细胞对浓度为10μg/ml的DOX、EPI、DAU的摄取率分别提高65.1％、50.6％和89.5％。
当抗癌药物浓度递增时，K562、K562/DOX细胞对药物的摄取逐渐增加，两种细胞内的药物积聚水平差距逐渐缩小。30μg/ml的茶多酚对K562/DOX细胞摄取不同浓度DOX、EPI、DAU的影响程度是有差别的，以DOX、EP1、DAU的药物浓度为1μg/ml时的影响最大，摄取率分别增加91.3％、73.5％和78.1％，但当DOX、EPI、DAU的浓度高达40μg/ml时，其摄取率仅分别增加25.0％、35.7％和3.3％。
实施例3茶多酚对K562和K562/DOX细胞外排药物的影响。
将细胞(1×106/ml)先与茶多酚作用15分钟，然后分别与DOX、EPI、或DAU(10μg/ml)37℃温育90分钟，用PBS溶液洗2次。再加入30μg/ml茶多酚后，分别观察0、30、60、90、120分钟细胞内药物的外排情况。外排后细胞内DOX、EPI或DAU用0.3M HCI-50％乙醇0.2ml提取1hr，9000×g离心20秒，取0.1ml上清液与1ml双蒸水混合，用荧光分光光度仪测定药物含量，激发波长为490nm，发射波长为590nm。每个标本均做3个复管。结果如下表9 TP对K562和K562/DOX细胞外排柔红霉素的影响K562K562/DOX外排时间(min) -TP +TP -TP +TP0 4.074±0.370 4.074±0.3703.289±0.171 3.289±0.171303.839±0.195 4.234±0.0773.029±0.041 2.754±0.408604.093±0.272 4.268±0.3852.902±0.408 2.902±0.357904.087±0.074 4.072±0.5782.990±0.449 3.038±0.363120 3.951±0.359 4.043±0.4102.431±0.357 2.660±0.143TP浓度为30μg/ml.
表10 TP对K562和K562/DOX细胞外排阿霉素的影响K562 K562/DOX外排时间(min) -TP +TP -TP +TP0 2.428±0.284 2.428±0.2841.636±0.158 1.636±0.158302.363±0.186 2.456±0.0851.063±0.046 1.005±0.122602.500±0.125 2.264±0.0881.046±0.093 0.969±0.124902.265±0.194 2.180±0.1650.949±0.053 0.870±0.0311201.898±0.300 1.932±0.1900.844±0.048 0.860±0.034TP浓度为30μg/ml。
表11 TP对K562和K562/DOX细胞外排表阿霉素的影响K562 K562/DOX外排时间(min) -TP +TP -TP +TP0 2.178±0.134 2.178±0.1341.624±0.096 1.624±0.096302.018±0.300 2.064±0.1281.216±0.204 1.160±0.058601.882±0.146 1.996±0.1301.018±0.054 1.064±0.098901.812±0.100 1.914±0.2000.944±0.102 0.958±0.0361201.820±0.146 1.856±0.1660.890±0.100 1.024±0.190TP浓度为30μg/ml。
从以上实施例可知，随着排外时间的延长，K562和K562/DOX细胞内药物积聚逐渐减少，尤以K562/DOX细胞的药物外排更明显。茶多酚虽能不同程度地减少K562、K562/DOX细胞外排DOX、EPI和DAU，但并不显著。
实施例4茶多酚和VER对病人白血病细胞体外摄取柔红霉素的影响。
研究方法同实施例2，结果如下表12.VER和TP对病人白血病细胞摄取柔红霉素的影响细胞内柔红霉素浓度(μg/ml) 摄取率(％)组别Control VER TP VER VTPPgp 1.315±0.266 1.493±0.236 1.442±0.260 9.6±7.67.1±7.1(-)Pgp 1.002±0.226 1.275±0.236 1.197±0.267 28.5±25.0 21.9±22.8(+～+++)
表13.病人白血病细胞的Pgp表达及对柔红霉素的摄取情况细胞内柔红霉素浓度(g/ml) 摄取率(％)No 诊断 PgpControl VER TP VERTP1AML+++ 0.5841.0420.80478.4 37.72AML+++ 0.8161.0321.07626.5 31.73ALL++ 1.0021.6701.13466.7 13.24AML++ 1.2341.6201.46931.3 19.05ALL++ 1.2151.3371.42510.0 17.36ALL+1.1401.5381.19434.9 4.87ALL+1.3831.5511.54912.1 12.08AML+0.8640.8821.5800.182.99AML+0.9531.2880.95934.4 6.310 ALL+0.9070.9960.9533.25.111 AML+0.9241.0711.02615.9 11.012 AML-1.1851.5001.2759.77.613 AML-1.5951.6871.6565.83.814 AML-1.2461.3881.3249.84.915 ALL-1.7141.8001.8085.05.516 ALL-1.7331.8641.7637.61.817 ALL-1.2361.3581.5429.924.818 AML-1.0051.2911.10028.6 9.519 AML-1.3631.3561.3541.61.420 ALL-1.1031.1951.1548.34.6本实施例研究了20例治疗复发或难治性白血病病人外周血或骨髓标本，平均年龄为16.4岁，最小年龄3.5岁，最大年龄54岁，男性15例，女性5例，其中急性粒细胞性白血病(AML)11例，急性淋巴细胞性白血病9例。经免疫组化染色表明Pgp阳性(+～+++)11例，Pgp阴性9例。VER和茶多酚可不同程度地提高Pgp阳性的白血病细胞对柔红霉素的摄取能力，摄取率分别提高28.5％和21.9％。而对Pgp阴性的白血病细胞的摄取率影响不明显。从表13还可发现，以Pgp强阳性的白血病细胞摄取柔红霉素的能力最差。VER和茶多酚对摄取率的影响基本一致，但有的病例以VER的作用为好，也有少数病例以茶多酚的作用为好。
实施例5茶多酚对DOX治疗SW1116/DOX移植癌的影响。
将SW1116/DOX细胞以5×106/0.2ml接种在14只NC种裸鼠的右侧季肋部皮下，当肿瘤直径为0.5～0.8cm时，随机分成DOX组和DOX+TP组，每组7只裸鼠，DOX组用阿霉素10μg/Kg腹腔注射，DOX+TP组注射DOX 10μg/Kg同时加用TP20μg/Kg腹腔注射，并于治疗前、第一疗程(4周为一疗程)结束后分别测定肿瘤的长径和短径，计算并比较两组裸鼠的肿瘤面积大小。
表14.TP与DOX联合治疗对SW1116/DOX移植癌的影响肿瘤大小(X±S，mm2)实验分组治疗前 第一疗程DOX 25.4±9.251.6±26.3DOX+TP29.4±5.938.3±9.6DOX+茶多酚组1只裸鼠因明显消瘦、腹泻于治疗第8天时死亡，DOX组7只裸鼠无死亡。DOX组裸鼠SW1116/DOX移植癌在治疗过程中增大显著，有的移植瘤增大特别明显，而DOX+TP组移植瘤虽有增大趋势，但不如DOX组明显，且肿瘤大小也较一致。说明茶多酚能增强DOX对多药抗药性肿瘤的化疗效果。
实施例6茶多酚联合抗癌药治疗抗药性白血病病人的个例报告。
病例一，男性，44岁，工人，确诊急性单核细胞性白血病12个月，经HOAP方案和小剂量Ara-c诱导缓解，HA方案巩固治疗6次，4月后复发，分离外周血白血病细胞经免疫组化染色呈强阳性，外周血白细胞为1800/mm3，骨髓像为原幼粒细胞41％，早幼粒2.5％，经DA方案+茶多酚(0.6tid×10天)治疗二个疗程后，复查骨髓像为原幼粒细胞4％，早幼粒2.5％，外周血白细胞为2400/m3，但治疗后来检测Pgp的表达情况。
病例二，女性，30岁，工人，诊断为急性早幼粒细胞性白血病18个月，经维甲酸(20mg)诱导缓解后，继用HA方案巩固治疗4次，10个月后复发，骨髓像示白血病细胞73％，外周血细胞为600/mm3，分离外周血白血病细胞检测Pgp(+)，RT-PCR检测mdr1mRNA为阳性，经DA方案治疗无效后，采用HOAP+茶多酚(0.6tid×10天)治疗二个疗程，骨髓像示白血病细胞降为2％，RT-PCR结果示mdr1 mRNA(-)，外周血白细胞上升为7800/mm3。
尽管目前试验病例数太少，但可提示我们，茶多酚对临床肿瘤，尤其是血液系统肿瘤的多药抗药性可能有一定的逆转作用，而且无明显的毒副作用，临床应用安全可靠，病人易于接受。
权利要求
1.一种新型肿瘤多药抗药性(MDR)逆转剂，为茶叶中提取的茶多酚(Tea Polyphenols，TP)，其特征在于将茶多酚作为肿瘤多药抗药性逆转剂，应用于多药抗药性肿瘤的化学治疗。
全文摘要
一种新型肿瘤多药抗药性(Multidrugresistance，MDR)逆转剂，拓展了茶多酚(TeaPolyphenols，TP)在医学领域的新用途。首次提出将茶多酚作为肿瘤多药抗药性逆转剂，用于肿瘤化学治疗后产生的抗药性逆转治疗(使抗药细胞对原有抗癌药物重新具有敏感性)，能明显增强抗癌药物的杀灭肿瘤细胞作用，产生意想不到的效果，该MDR逆转剂具有无毒性、安全可靠等特点，几乎具有现有逆转剂如异搏定等(毒性作用太大、病人无法耐受)的同等逆转效果，是一种易于推广应用的新型MDR逆转剂。
文档编号A61K31/05GK1133710SQ9510393
公开日1996年10月23日 申请日期1995年4月18日 优先权日1995年4月18日
发明者郑树, 吴金民, 潘宏铭, 胡汛 申请人:浙江医科大学