专利名称：针对人表皮肿瘤细胞多药抗药性基因的反义核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对人表皮肿瘤多药抗药性基因的反义寡聚核苷酸的设计、筛选和化学修饰及其在逆转人肿瘤多药抗药性中的应用和抗肿瘤中的应用。
背景技术：
多药抗药性(Multidrug Resistance，即MDR)是制肿瘤细胞在接触抗癌药物产生耐药的同时，对其他结构和作用机理不同的药物也产生交叉耐药性。肿瘤患者在化疗过程中往往会表现出对这种多药抗药性。多药抗药性已成为肿瘤化疗失败的主要原因。肿瘤细胞多药抗药性的形成原因很复杂，但其产生的主要机理是由于mdr1基因的过量表达所致。Mdr1基因编码一种分子量170kDa的P-糖蛋白(P-glycoprotein)，该蛋白位于细胞膜上，是一种能量依赖型药物输出泵，能将化疗药物从癌细胞中泵出而导致化疗失败。多药抗药性现象构成临床化疗的一大障碍。为了克服这种多药抗药性，很多研究集中在它的逆转剂上，如钙离子通道阻断剂，调钙蛋白抑制剂、甾类和免疫抑制剂等药物来破坏或干扰P-糖蛋白的功能，从而达到增强化疗效果的目的。然而，这些药物由于其抑制多药抗药性的能力有限，加上其毒副作用较高而无法推广应用。近年来随着反义技术的兴起，利用反义核酸来针对这一现象中的关键蛋白——P-糖蛋白进行调控为克服这一难题带来了希望。反义核酸作为药物是基于通过互补序列能特异性地与靶mRNA或单链DNA结合而调控靶基因的表达，即所谓的反义策略。这是一类在基因水平调控的理想治疗药物(Cooney M，Czemuszewiez G，Postel E，H，et al，Science，241，456-459，1988)。然而反义核酸在实际的临床应用中还存在许多亟待解决的问题如反义核酸在体内和胞内的稳定性、反义核酸与靶序列结合的稳定性、细胞通透性和毒副作用等(Diasio R，B，Zhang R，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，7(3)，239-243，1997)。
编码的mdr1基因有一个由4017个碱基组成的开放阅读框架，从理论上分析，可作为调控对象的位点很多，但实际上不可能对所有位点加以考察。从已经报导的工作来看。较有效的调控区域大多集中在翻译起始区(Liu C，Qureshi，A，Ding X，J，et al.J.Clinical Science，91，93-99，1996)，也有以成环区作为调控靶点。而Ho(Ho S，P，Britton D，H，O，Stone B，A，et al.Nucleic Acid Res.24，1901～1912，1996)等认为选择mRNA上易接近位点作为反义核酸的靶点较为有效，并用RNaseH酶切寡聚核苷酸库与mdr1基因mRNA形成的杂交链，对mRNA上的易接近位点进行定位。根据这些报导，我们合成了对应于翻译起始区和成环区和ATP结合位点的9段寡聚核苷酸，并考察了它们的抑制效果。
本发明在培养细胞中筛选出对mdr1基因特异的反义核酸，设计其结合于mdr1基因的翻译起始区和成环区和ATP结合位点，显示出对mdr1基因表达的P-糖蛋白的抑制，目前研究显示，其可抑制肿瘤生长。
发明内容
本发明所阐述的反义寡聚核苷酸药物，其寡聚核苷酸的碱基排列顺序与人肿瘤多药抗药性基因的一段序列互补，这些反义寡聚核苷酸药物在细胞内特异地与人肿瘤多药抗药性基因的翻译起始区、成环区、ATP结合部位杂交，从而阻止多药抗药性基因编码P-糖蛋白表达，达到逆转肿瘤细胞多药抗药性目的。
本发明设计了一系列可以结合于mdr1基因的不同区域的反义核酸分子，在培养细胞中筛选对mdr1基因表达特异性抑制的反义核酸，培养细胞采用具有很强多药抗药性的人表皮癌细胞KB-A-1细胞，设阴性对照AMDR00一个，阳性对照AMDR01(Anna，A，F，Dimitri，S，S，et al Biochemical Pharmacology，60，83-90，2000)、AMDR02(陈良安，刘又宁，中华医学杂志，80，219-221，2000)两个，所有进行筛选的反义核酸长度为15～20个核苷酸碱基，筛选结果表明，其中九个反义核酸均有不同程度的抑制KB-A-1细胞的生长的特征，将它们分别定名为AMDR10、AMDR11、AMDR12、AMDR13、AMDR14、AMDR15、AMDR16、AMDR17、AMDR18、，其中AMDR12具有最高的抑制KB-A-1细胞的生长的活性。
具有抑制人表皮癌细胞KB-A-1生长活性的AMDR系列反义核酸碱基组成和序列如下所示AMDR105`-CAAGATCCATCCCGACC-3`17mer
AMDR115`-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3` 18merAMDR125`-TCCTCCATTGCGGTCCCCTT-3`20merAMDR135`-ATCCCGACCTCGCGCTCCTT-3`20merAMDR145`-AAAGAATACAGTGAG-3` 15merAMDR155`-GCATCAGCTGGACTGTTGTG-3`20merAMDR165`-GGATCTTGGGGTTGCGAACC-3`20merAMDR175`-GGAGGATCTTGGGGTTGCGA-3`20merAMDR185`-GCAGGAGGATCTTGGGGTTC-3`20mer设立阳性对照两个，是AMDR01和AMDR02，其序列如下所示AMDR015`-ATCCATCCCGACCTC-3`15merAMDR025`-CCATCCCGACCTCGCGCTCC-3` 20mer设立阴性对照一个，是MDR00，其序列如下所示AMDR005`-AAGGGGACCGCAATGGAGGA-3` 20mer以上所设计的反义核酸攻击的目标是人体肿瘤细胞多药抗药性基因-mdr1基因，这些反义核酸可以和mdr1基因特异结合，阻止mdr1基因大量表达P-糖蛋白，从而使P-糖蛋白的药物泵作用难以发挥。
本发明所筛选出的反义核酸片段对抑制人表皮肿瘤细胞多药抗药性基因-mdr1的表达有明显的作用，能够发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。可以将本发明的反义核酸与药用载体结合，用于动物(包括哺乳动物和人)。所用的药用载体可为磷酸盐缓冲液(pH7.4)以及其它常用的载体和缓冲液。
本发明设计了一系列可以结合于mdr1基因的不同区域的反义核酸分子，经细胞培养筛选出具有特异性抑制人表皮肿瘤细胞多药抗药性基因-mdr1的表达的反义核酸片段。能够发展为具有临床应用价值的抗肿瘤药物。所用的药用载体可为磷酸盐缓冲液(pH7.4)以及其它常用的载体和缓冲液。
图1是不同作用靶点的反义核酸对KB-A-1细胞多药抗药性的抑制
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明进一步描述。所举之例并不限制本发明保护范围。
实施例1MTT法筛选抑制具有多药抗药性的人表皮肿瘤细胞的生长的反义核酸。
选用人表皮肿瘤多药抗药性细胞KB-A-1作为筛选实验用细胞株。将实验分为空白无处理组、阴性对照组、阳性对照组、反义核酸处理组。将对数生长期的KB-A-1细胞104个/ml接种于96孔培养板中，每孔0.1ml，用含10％小牛血清和1μg/ml阿霉素的DMEM培养液在37℃，5％CO2及饱和湿度下培养至接近长满时，换成无血清培养液，分别加入1.0μM的各组反义核酸和20μg/ml的脂质体，处理24小时，然后换成正常培养基继续培养三天，用MTT法测定细胞生长程度。以空白组数值为100％，作细胞生长抑制图(如图1所示)。
图1中浅色柱体代表针对mdr1基因的阳性对照反义核酸结果，黑色柱体代表阴性对照反义核酸结果，其余白色柱体代表AMDR系列反义核酸结果，可以看出，所设计的反义核酸对KB-A-1细胞生长均有一定程度的抑制作用，其中AMDR12抑制程度最高。
实施例2含反义核酸的药物组合物作为动物体内给药的反义核酸或药物组合物的组成如下反义核酸 3mg/ml一水合磷酸一氢钠 1.73mg/ml七水合磷酸二氢钠 14.33mg/ml氯化钠 4.4mg/ml注射水 适量也可以用反义核酸 3mg/ml氯化钠 4.4mg/ml注射水 适量本发明的反义核酸就采用上面两种配方。
权利要求
1.一种反义寡聚核苷酸，其特征在于可特异性结合人肿瘤多药抗药性基因的不同区域，所述反义寡聚核苷酸序列选自1)位于翻译起始区5`-CAAGATCCATCCCGACC-3`2)位于翻译起始区5`-GTCCCCTTCAAGATCCAT-3`3)位于翻译起始区5`-TCCTCCATTGCGGTCCCCTT-3`4)位于翻译起始区5`-ATCCCGACCTCGCGCTCCTT-3`5)位于成环区5`-AAAGAATACAGTGAG-3`6)位于ATP结合位点5`-GCATCAGCTGGACTGTTGTG-3`7)位于ATP结合位点5`-GGATCTTGGGGTTGCGAACC-3`8)位于ATP结合位点5`-GGAGGATCTTGGGGTTGCGA-3`9)位于ATP结合位点5`-GCAGGAGGATCTTGGGGTTC-3`
2.如权利要求书1所述的反义寡聚核苷酸用于抑制肿瘤细胞多药抗性。
3.如权利要求书1所述的反义寡聚核苷酸用于抗肿瘤反义核酸药物。
全文摘要
本发明涉及设计、筛选系列特异的反义核酸，其碱基排列顺序与人表皮肿瘤细胞的多药抗药性基因(mdr1基因)的一段序列互补。这些寡核苷酸在细胞内能特异地与多药抗药性基因的一段结合，从而阻止多药抗药性基因编码的P－糖蛋白的表达，达到逆转肿瘤细胞的多药抗药性。
文档编号C07H21/00GK1544454SQ200310108809
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月24日 优先权日2003年11月24日
发明者魏东芝, 任宇红, 钱江潮 申请人:华东理工大学