专利名称：一种治疗血管系统疾病的新药的制作方法
技术领域：
本发明为一种药物，特别是治疗血管系统疾病的药物。
血管收缩性肽(Endothelin，缩写为ET)，是1988年由柳泽等人从猪动脉内皮细胞的培养上清液中分离鉴定出的由21个氨基酸组成的肽(柳泽等，nature 332，P411-412)。之后，从对ET编码的遗传因子研究中发现了与ET结构类似的肽，分别命名为ET1、ET2、ET3。组成ET1、ET2、ET3的氨基酸均为L型。(井上等，Proc.Natl Acad.Sci.USA.86.2863-2867)。这些ET类的结构如下 -Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OHA1 A2 A3 A4 A5A6ET1SerSerSer leuMet PheET2SerSerSer TrpLeu PheET3ThrPheThr TyrLys Tyr上述的ET类物质在生物体内具有强烈的血管收缩和升压作用，推测它们为循环系统调节的内在因子，可引起高血压、心、脑血液循环疾病(如心肌梗塞)、肾病(如急性肾功能不全)，以及与血管收缩有关的疾病(J.Med.Chem.，35，1493(1992))。此外，由于ET类物质对支气管平滑肌有收缩作用，推测与哮喘也有关。
迄今为止，虽然有对ET类与受体结合有抑制作用的各种肽的报导，但非肽类化合物只有蒽醌衍生物(日本专利，特开昭3-47163号)和脱镁叶绿甲酯酸衍生物(日本专利，特开昭5-331063号)。乌宋酸自1963年从乌索酸氧化得到以后(Bull.calcutta School Trop.Med.，11，20(1963))，虽然进行了许多研究，但对ET与受体结合的抑制作用未见报导。
本发明的目的是提供一种能抑制ET与受体结合的活性物质。
为达到上述目的，本发明通过在受测物质存在下检测放射性标记的ET与动脉株化细胞膜受体结合后的残余量来衡量受测物质抑制ET与受体结合的程度，并作为活性筛选指标，测试每一步分离出的各个馏分的活性，以此来指导有效成分的分离和纯化。经过追踪分离获得的乌宋酸，具有显著地抑制ET与受体结合的活性，从而完成了本发明。
本发明提出一种通式如下的乌宋酸类 式中R1和R2可以是H或OH，但其中之一必须是H；或R1和R2一起共同为下列基团＝O，＝NOH，＝N-NH2， 式中R3和R4可以是H，或者卤原子；R3和R4也可结合形成碳碳双键。
乌宋酸类药理学允许的盐，也属于本发明的范围。
通式(I)所表示的化合物的一种—乌宋酸(I′) 是三帖化合物，从中国药用植物中用一般的方法可以分离纯化得到。根据已知的方法，也可以从乌索酸氧化得到乌宋酸(khim.Farm.Zh.20 172-178，1986)。式(I)中R1和R2共同为下式＝O，＝NOH，＝N-NH2， 所表示的化合物，可以通过从R1和R2为＝O所表示的化合物与羟胺、肼、乙二醇等反应得到。
R3和R4为卤素取代的化合物，可以从R3和R4结合形成双键的化合物经囟化及氢卤化反应得到。R3和R4为H的化合物可通过氢化方法得到。
本发明所说的乌宋酸类药理学允许的盐，是指与无机离子、有机基团、氨基酸等形成的盐。无机离子是指碱金属类，如锂、钠、钾等；以及碱土金属类，如镁、钙等；其它金属，如铝、锌、铁等也包含在本发明中。有机基团是指氨类，如氨基、伯胺基、仲胺基、叔铵基；含氮类(脂肪族、芳香族)是指甲胺基、二甲胺基、三甲铵基、乙胺基、二乙胺基、三乙铵基、丙胺基、二丙胺基、异丙胺基、二异丙胺基、丁胺基、二丁胺基、异丁胺基、特丁胺基、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、四氢吡咯、哌啶、吗啉、吡咯、吡啶、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
本发明是关于将乌宋酸类及其药理学允许的盐类作为有效成份制成ET受体抑制剂，用于哺乳动物(如人、狗、猫、兔、鼠等)由于ET引起的各种疾病，如高血压、冠心病、心肌病、动脉硬化、心肌梗塞、大脑动脉收缩、大脑缺血、大动脉收缩引起的云状皮下出血、哮喘、急性肾功能不全等的治疗和预防，作为血管扩张剂使用。
本发明的ET与受体结合的抑制剂，经口服或不经口服均可以。剂型可以是片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂、乳化剂、悬浊剂、注射剂等。这些剂型，分别加适当的担体、成形剂、其它必要的添加剂，按规定的方法制成。
式(I)所表示的乌宋酸类每天的给药量，根据患者的病情、体重、该衍生物的种类、给药方法等不同而有所不同。例如对于非口服给药，即皮下、静脉、肌肉注射和直肠内用药，大约0.01--20mg/公斤体重·日，最好是0.1--10mg/公斤体重·日。如口服，大约0.1--100mg/公斤体重·日，最好是1-10mg/公斤体重·日。
与对ET与受体结合有抑制作用的各种肽相比，非肽小分子化合物，即本发明的乌宋酸类，经口服给药不分解，且从自然界中容易得到，这是本发明的优点所在。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细说明。
实施例1.乌宋酸的分离采自中国四川省的丁座草(Xylanche himalaica)全草干燥粉碎后，在室温下用95％乙醇提取，所得提取液在60℃下减压浓缩。提取物30g用乙酸乙酯溶解，溶解物(7.93g)用1000g硅胶柱层析分离，洗脱剂为正己烷/异丙醇/96∶4，得活性部分3.44克，Rf＝0.42(正己烷∶异丙醇＝10∶1)。
活性部分继续用180g硅胶柱层析，洗脱液从正己烷∶异丙醇/97∶3开始到90∶10进行梯度洗脱分离，得活性部分3.19g，Rf＝0.38(正己烷∶异丙醇/90∶10)。
这部分继续用150g硅胶分离，用正己烷∶乙酸乙酯/80∶20--0∶100梯度洗脱，得活性部分257mg，Rf＝0.49(正己烷∶乙酸乙酯＝75∶25)。
继续用25g硅胶分离，用CH2Cl2MeOH/99∶1洗脱，得活性部分101mg，Rf＝0.69，(CH2Cl2MeoH＝95∶5)。
最后用HPLC(岛津LC-6A型，分离柱Merck Hibar RT250-25 Lichrosorb Si60，7μm，检测波长254nm，流速9.9ml/min，炉温20℃，洗脱液为正己烷∶异丙醇/95∶5)分离，得乌宋酸单体16.7mg，Rf＝0.69(CH2Cl2MeOH/95∶5)。
实施例2.活性试验(1)ET受体标准品从老鼠胎儿胸部大动脉得到的株化细胞A10(Bmax20.3PM，ATCCCRL 1476)作为测定用的受体细胞膜标准品。根据测定规程，A10细胞悬浊液5ml加入38ml稀释液(CaCl2，BSA，含有Bacitracin50mMDoris缓冲液，PH7.4)，作为受体的稀释标准液。
(2)125I-ET结合试验取放射性标记的125I-ET ET1(81.4TBq/mmol)8.5KBq，加入受体稀释标准液175μl和样品25μl。加入1×10-6M的ET1，测定非特异的结合量。反应在250μl Doris缓中液中于室温下进行2小时。反应后，用纤维滤纸在玻璃漏斗上急速过滤，用50mM Doris缓冲液(pH7.4)洗三次，漏斗上留下的放射性物质用γ-射线测定仪测定。测定结果，乌宋酸对ET1与受体结合的50％抑制浓度(IC50)约为5μg/ml。
权利要求
1.一种治疗血管系统疾病的药物，其特征是有效成分是乌宋酸类，结构式为 式中R1和R2可以是H或OH，但其中之一必须是H；R1和R2也可以一起共同为下列基团＝O，＝NOH，＝N-NH2， R3和R4可以是H，或者囟原子；R3和R4也可以结合形成碳碳双键。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征是乌宋酸类与碱金属，如锂、钠、钾等形成的盐。
3.根据权利要求1所述的药物，其特征是乌宋酸类与碱土金属，如镁、钙等形成的盐。
4.根据权利要求1所述的药物，其特征是乌宋酸类与氨类有机基团，如氨基、伯胺基、仲胺基、叔铵基形成的盐。
5.根据权利要求1所述的药物，其特征是乌宋酸类与铝、锌、铁等形成的盐。
6.根据权利要求1所述的药物，其特征是乌宋酸类与甲胺基、二甲胺基、三甲铵基、乙胺基、二乙胺基、三乙铵基、丙胺基、二丙胺基、异丙胺基、二异丙胺基、丁胺基、二丁胺基、异丁胺基、特丁胺基、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇铵、四氢吡咯、哌啶、吗啉、吡咯、吡啶、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等形成的盐。
全文摘要
本发明公开了一种结构通式为所表示的乌宋酸类及其药理学允许的盐的药物(式中R
文档编号A61P9/10GK1114564SQ9511123
公开日1996年1月10日 申请日期1995年1月27日 优先权日1994年3月24日
发明者丁立生, 德田昌彦, 川边纪雄, 户上泰彦 申请人:中国科学院成都生物研究所, 东丽株式会社