抑制自由基产生的方法

专利名称：抑制自由基产生的方法
技术领域：
本发明涉及丙酮酸盐或酯在抑制哺乳动物自由基产生中的应用。
背景技术：
丙酮酸盐或酯已经被描述有如下应用阻滞肝脏脂肪沉积(4,158,057)；治疗糖尿病(4,548,790)；抑制体重增加(4,812,479,4,548,937,4,351,835)；增加哺乳动物体蛋白浓度(4,415,576)；治疗心脏病患者增加心脏输出而不伴随着对心脏氧需求的增加(5,294,641)；延长运动耐受(4,315,835)；抑制胆固醇增加(5,134,162)；以及抑制恶性肿瘤迁移的生长和抑制DNA的断裂(申请号S.N.08/194,857,1994年2月14申请)。
已报道丙酮酸盐或酯可以作为自由基的清除剂(De Boer,L.W.V.et al，美国生理学杂志265(心脏和循环生理学34):H1571-H1576,1993。自由基现象在哺乳动物中，自由基已被鉴定为细胞死亡的伴随物。已有数种自由基清除剂被促进以用于中和自由基并防止其对活细胞产生不利影响。实例有维生素C，维生素E,β-胡萝卜素和丙酮酸盐或酯。可用合适的载体如水或食物将这些自由基清除剂口服或非胃肠道地导入到患者体内。丙酮酸盐或酯可通过可食用食物如蛋糕，糖果等提供。
祛脂乙酸是已知的可在肝脏中产生自由基的药物。
发明公开根据本发明，我发现丙酮酸盐或酯不仅可以作为自由基的清除剂，更重要的是丙酮酸盐或酯还可抑制自由基的产生。该特征看来在已知的自由基清除剂中是独一无二的。该已知作用是可测量的，可重复的和可靠的。
根据本发明，一位正在经受或预计将要经受有可能导致自由基产生的身体应激的患者，他在自由基产生事件之前，之中或之后接受了适当剂量的丙酮酸盐或酯好处是患者与可能伴随患者的医学事件的广泛的自由基效应隔离。
产生过量自由基的事件心肌损伤，未参尿病，缺氧，麻醉，外科手术等。用丙酮酸盐治疗可以在这些事件之前，在这些事件之后检测到的其他事件可以在这些事件发生时或之后治疗。
丙酮酸盐或酯是以几种矿物盐如丙酮酸钠和丙酮酸钙提供的。丙酮酸盐或酯还可以以丙酮酸酯提供，例如美国专利5,256,697和5,283,260中具体地丙酮酸基-氨基酸有例如丙酮酸基-甘氨酸，丙酮酸基-丙氨酸，丙酮酸基-亮氨酸，丙酮酸基-缬氨酸，丙酮酸基-异亮氨酸，丙酮酸基-苯基-丙氨酸，丙酮酸基-脯氨酸，丙酮酸基-肌氨酸及其酰胺类。所选择的丙酮酸可以合适水溶液通过非胃肠道途径导入到患者的体内，水溶液中还可含有其它维持生命的成分如寡糖类，脂肪类，矿物质类，维生素类。达到有效抑制自由基产生的丙酮酸的剂量是患者碳水化合物食物的5-25重量百分比。
附图简述

图1到图3是对涉及7组动物的数据的图形图示。
图1是对棕榈酰基辅酶A氧化酶的值，即可与每组H2O2产生蛋白相关的酶产量的图示。
图2对每组过氧化氢酶的图示。
图3是对每组脂褐质类产物的测量的相对荧光强度的图示。
图4是对用于对各组大鼠肝细胞的测量的硝酸双-N-甲基吖啶化学发光的图示。
实施本发明的最佳方式特别开发了一系列测验以用于证明丙酮酸盐或酯抑制自由基产生的作用。祛脂乙酸是已知的可在肝脏中产生自由基的药物。祛脂乙酸使患者的β-过氧化物酶系统产生过氧化物酶体并增加肝脏的细胞器。在过氧化物酶体内有β-氧化活性，该酶学现象的终产物包括自由基的代谢物过氧化氢。患者对自由基的正常防卫称为过氧化氢酶。已有的过氧化氢酶不能中和非正常产生的量的自由基。自由基过剩导致脂膜的破坏(脂过氧化作用)，结果是细胞不正常。
随着丙酮酸盐或酯的添加，自由基的产生减少。丙酮酸盐或酯存在时，过氧化物酶体不增殖，β-氧化作用不增加。
在对比试验中，维生素E表现出其已知的清除自由基的作用，但不表现出产生自由基的作用。实施例将大约重210克的32只雄性Sprague-Dawley大鼠分为7组并用流体食物饲喂22-26天。这7组分别是安慰剂(PL)-没有处理祛脂乙酸(CL)-仅用祛脂乙酸处理祛脂乙酸+丙酮酸盐或酯(CPLY)-用祛脂乙酸处理接受了丙酮酸盐或酯的动物祛脂乙酸+维生素E(CLE)-用祛脂乙酸处理接受了维生素E的动物祛脂乙酸+丙酮酸盐或酯+维生素(CLEPY)-用祛脂乙酸处理接受了丙酮酸盐或酯和维生素E的动物维生素E(E)-动物接受维生素E-无祛脂乙酸丙酮酸盐或酯(PY)-动物接受丙酮酸盐或酯-无祛脂乙酸丙酮酸盐或酯以丙酮酸钠(20g/l)和丙酮酸钙(17.9g/l)加入到膳食中。丙酮酸盐或酯的剂量是这些接受丙酮酸盐或酯的大鼠的膳食的能量含量的10％。通过向不含丙酮酸盐或酯的膳食中添加多聚葡萄糖(Polycose),(Ross Laboratories,Columbus Ohio)使所有的膳食能量相同。通过向不含丙酮酸盐或酯的膳食中添加柠檬酸钠和碳酸钙使膳食中的钠和钙的含量相同。
所有膳食的最后组成是糖47％蛋白质18％脂肪 35％能量含量 0.0042MJ/ml通过量热法分析使所有的膳食的能量相同。在将动物分成组进行实验之前，为了用流体膳食驯化动物，将所有的动物用流体膳食饲喂3天，平均摄取量是60ml/天。加入的祛脂乙酸在膳食中终浓度是0.018g/l，预计的剂量为0.5g/kg初始体重。加入到膳食中的维生素E的量为终浓度2ml/l，相应的剂量为30 IU(20mg/kg初始体重)。
应用了改良的搭配技术以确保各组之间的能量摄入相等。在第二天，用在给定天最少摄入组(速率限制组)的摄入量饲喂其它组的动物，并且在接下来的用速率限制组的摄入饲喂动物。在大多数情况下，速率限制组是CLPY-祛脂乙酸+丙酮酸盐或酯。用平均膳食摄入饲喂所有组的动物22-26天(饲喂期)。在饲喂期间，各组之间祛脂乙酸(表Ⅰ)和维生素E(表Ⅱ)的总摄入是相同的。
表Ⅰ-祛脂乙酸摄入

各组之间p=NS维生素E摄入相同。
表Ⅱ-维生素E摄取

各组之间p=NS饲喂22天后，从每组动物中选出一只禁食过夜16小时的动物。将从每组中选出的动物通过断头无痛苦处死(没有麻醉)。接下来的4天，每天从每一组中选出一只动物，禁食，无痛苦处死。从每只处死的大鼠获取肝脏后立即进行生物化学分析，并准备作光学和电镜分析。从颈残根获取血液并于-20℃冻存用于以后的分析。生物化学分析将部分肝脏在蔗糖缓冲液中匀浆并分析棕榈酰基辅酶A氧化酶和过氧化氢酶的活性以及脂褐质类的产物。统计分析通过双尾t检验评价两组之间的差异。P＞0.05，认为差异显著。每组的动物数据以平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。形态评价将大鼠肝脏切片加工以进行常规的光学显微镜组织学分析和超微电子显微镜评价。
如表Ⅲ所示，相对应于安慰剂，仅用祛脂乙酸饲喂的动物肝脏体积增大42％。当在祛脂乙酸膳食中加入丙酮酸盐或酯时(CLPY&CLEPY)祛脂乙酸的作用减弱，即肝脏体积增加14％，只有单独使用祛脂乙酸时的1/3。祛脂乙酸加维生素E加重了肝脏体积，使其增加了46％，而维生素E单独使用肝脏重量减少11％。
表Ⅲ肝脏参数

PL=用安慰剂饲喂的动物CL=补充有祛脂乙酸的膳食CPLY=补充有祛脂乙酸+丙酮酸盐或酯的膳食CLE=补充有祛脂乙酸+维生素E的膳食CLEPY=补充有祛脂乙酸+丙酮酸盐或酯+维生素E的膳食E=补充有维生素E的膳食PY=补充有丙酮酸盐或酯的膳食祛脂乙酸显著增加了肝脏的蛋白质含量(从1130g到2124g)而丙酮酸盐或酯几乎完全使其正常化(从1130g到1480g)。有趣的是，在祛脂乙酸膳食中添加维生素E对祛脂乙酸诱导的肝脏大小和蛋白质变化无影响(比较2140g和2124g)。类似地，向祛脂乙酸和丙酮酸盐或酯组中加入维生素E结果无显著变化(比较1298g和1480g)，这表明维生素E的加入没有有效地增强丙酮酸盐或酯的正常化作用。β-氧化作用图1示肝过氧化物酶体β-氧化作用活性(nmol/min/mg蛋白质)。祛脂乙酸诱导过氧化物酶体酶系统活性增加5倍，表明有显著的自由基的产生。丙酮酸盐或酯使祛脂乙酸诱导的β-氧化作用的增加减少75％，表明基本上抑制了自由基的产生。维生素E没有抑制祛脂乙酸对酶系统的作用。维生素E(CLEPY)没有增加丙酮酸盐或酯(CLPY)的正常化作用。
注释在图1,2,3中，下标字母a,b,c指a=p＜0.05 vs.PLb=p＜0.05 vs.CLc=p＜0.05 vs.CLE过氧化氢酶活性图2祛脂乙酸使过氧化氢酶的活性几乎增加3倍，表明自由基的产生。添加维生素E(CLE)没有显著减少过氧化氢酶的活性。作了祛脂乙酸外还饲喂丙酮酸盐或酯的动物(CLPY和CLEPY)使活性增加一半左右或更少一些，表明对自由基产生的抑制。脂褐质类产物图3示脂褐质类产物的相对荧光强度。祛脂乙酸的诱导使脂褐质类产物增加3倍。向祛脂乙酸膳食中加入丙酮酸盐或酯或维生素E几乎完全抑制了脂褐质类产物的增加。因此，维生素E有效地清除了可以引起脂褐质类产物的自由基。而丙酮酸盐或酯抑制自由基的存在，部分是通过抑制其产生以及部分通过清除已产生的自由基。图3的意义在于如果身体含有自由基，脂褐质类产物是存在的并且是可测量的。结论这些实施例表明丙酮酸盐或酯对抑制自由基产生的有效性。祛脂乙酸饲喂的大鼠可长期产生自由基。祛脂乙酸饲喂引起肝脏增大伴随着肝蛋白含量增加。通过电子显微镜评价过氧化物酶体的增殖，发现作为过氧化物酶体增殖和过氧化氢产生的一个指标，过氧化物酶体β-氧化作用活性增加5倍。自身产生的可对过氧化氢解毒的肝过氧化氢酶活性增加2-3倍。在祛脂乙酸饲喂的动物中，脂褐质类产物即自由基诱导的脂质过氧化作用的终产物增加了3倍。这些结果表明，自由基的产生和过氧化氢的产生与以前的研究是一致的。
本发明进行的大鼠测验报道了丙酮酸盐或酯抑制自由基的产生。祛脂乙酸饲喂显示了长期的自由基的产生祛脂乙酸饲喂诱导肝脏增大并伴随着肝蛋白含量的增加，通过电子显微镜的评价发现其诱导过氧化物酶体的增殖，以及诱导作为过氧化物酶体增殖和过氧化氢产生的标记的过氧化物酶体β-氧化活性增加5倍。可解毒过氧化氢的总肝过氧化氢酶增加2-3倍。在祛脂乙酸饲喂的动物中，脂褐质类产物即自由基诱导的脂质过氧化作用的终产物增加了3倍。这些结果表明，过氧化氢的产生和毒性的自由基代谢作用与以前的研究是一致的。
相反，给祛脂乙酸饲喂动物补充维生素E对肝脏大小，蛋白含量，过氧化物酶体增殖或β-氧化作用活性没有影响.这些结果表明尽管补充有维生素E祛脂乙酸的自由基产生持续不减弱。但是，正如所期望的，抗氧化剂的确减弱了自由基对脂质过氧化的作用；即维生素E看来是有效的自由基清除剂。
该数据表明丙酮酸盐或酯对自由基产生及其随后的脂质过氧化作用有可重复的作用。作为已知的自由基产生的抑制剂，看来丙酮酸盐或酯在对自由基的代谢作用的控制中可提供满意的作用。维生素E不影响自由基的产生。
在膳食中补充丙酮酸盐或酯抑制了祛脂乙酸诱导的过氧化物酶体的增殖和自由基的产生。丙酮酸盐或酯的补充还抑制了自由基诱导的脂质过氧化作用并增强了一氧化氮的代谢作用。可替代的测验结果可通过硝酸双-N-甲基吖啶化学发光检测过氧化物(O20-)(Caraceni,P.et al.，美国生理学杂志。266,G799-G808,1994)。过氧化物本身是自由基并且已知是可以作为其它自由基前体的过氧化氢的前体。
例如过氧化物---过氧化氢---羟基自由基O20-H2O2OH-过氧化物和羟基都是已知的有害的自由基。丙酮酸盐或酯是已知的羟基自由基清除剂。本文报道丙酮酸盐或酯还抑制过氧化物的产生，从而降低了不需要的羟基自由基的增殖。
在报道的实验中，从成年Sprague-Dawley大鼠回收肝细胞并在合适的溶液中于1,200G离心10分钟。细胞存活率为90-97％。将细胞包埋在0.5mm直径的琼脂糖凝胶珠中。
将所有的琼脂糖凝胶珠于37℃在KHB灌注1小时(标准的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液)。之后将肝细胞分成3组1．对照-用含5mM葡萄糖的KHB溶液灌注。
2．丙酮酸盐或酯(Ⅰ)-除了含1.0mM的丙酮酸盐或酯外与对照相同。
3．丙酮酸盐或酯(5)-除了含5.0mM的丙酮酸盐或酯外与对照相同。(1),(2),(3)组于95％体积的氮气和5％体积二氧化碳的缺氧条件下缺氧耐受2小时。
缺氧2小时后，用含氧空气替换氮气(再氧化)，而将细胞用KHB溶液灌注。
图5示3组过氧化物的产生，其中过氧化物的产生以用nA表示的所测定的硝酸双-N-甲基吖啶化学发光表示。在2小时的缺氧中，所有组的硝酸双-N-甲基吖啶化学发光都停止了，表明没有过氧化物的产生。在缺氧时即缺少氧气时，没有过氧化物的产生是预料之中的。于150分钟时重新氧化(图5)并且对照组(实心园)产生大于200nA的硝酸双-N-甲基吖啶化学发光。在150-270分钟的再氧化阶段，两个丙酮酸盐或酯组(空心园和实心三角)的硝酸双-N-甲基吖啶化学发光显著的低。有6个对照标本，6个5mM丙酮酸盐或酯标本和5个1mM丙酮酸盐或酯标本。这些结果表明丙酮酸盐或酯抑制过氧化物(O20-)的形成并且从而抑制了自由基的产生。
权利要求
1．一种在哺乳动物中抑制自由基的产生以及同时清除内部产生的自由基的方法，包括向所说的哺乳动物导入治疗有效量的丙酮酸盐或酯。
2．权利要求1的方法，其中所说丙酮酸盐或酯被口服饲喂给该哺乳动物。
3．权利要求1或3的方法，其中所说丙酮酸盐或酯占该哺乳动物每天能量摄入的5-20重量百分比。
4．权利要求4的方法，其中所说丙酮酸盐或酯是丙酮酸钠或丙酮酸钙或丙酮酸的酯或其混合物。
5．权利要求1的方法，其中所说丙酮酸盐或酯通过非胃肠道途径导入到哺乳动物中。
6．权利要求6的方法，其中丙酮酸盐或酯是在水溶液中丙酮酸的一个或多个酯。
7．权利要求1的方法，其中丙酮酸盐或酯被于通常导致过剩的自由基产生的事件之前连续导入到哺乳动物中。
8．权利要求1的方法，其中丙酮酸盐或酯被于通常导致过剩的自由基产生的事件之后连续导入到哺乳动物中。
全文摘要
在哺乳动物中一些事件可诱导与细胞死亡相关的自由基的产生。有此类医学事件的动物被施与剂量为其摄入总糖量5—20重量百分比量的丙酮酸盐或其酯。可在医学事件前、医学事件后中以及医学事件后给动物施与丙酮酸盐或酯药剂。另外,除了已知的丙酮酸盐或酯清除自由基的特性之外,本公开描述了意想不到的将丙酮酸盐或酯作为自由基产生的抑制剂的效果。
文档编号A61K31/221GK1209742SQ95198020
公开日1999年3月3日 申请日期1995年12月11日 优先权日1994年8月8日
发明者罗纳德T·斯坦科 申请人:罗纳德T·斯坦科