专利名称：诊断和/或治疗剂的改进或与其相关的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断和/或治疗活性剂，更具体地说涉及渗入了在体内对位点和/或结构具有亲和性的部分(以增强体内特定部位的诊断造影和/或治疗)的诊断和/或治疗活性剂。本发明特定的目标是用于超声造影的诊断剂，其在下文中称作为导向超声造影剂。
众所周知超声造影包含具潜在价值的诊断工具，例如用于脉管系统的研究中，特别是在心动描记法，以及组织微脉管系统中。已提出利用各种造影剂来增强所获得的声学图象，包括固体微粒悬液，乳化的液滴，气泡和包裹的气体或液体。通常认为低密度造影剂(其容易压缩)就它们所产生的声学反散射而言特别有效，因此相当大的兴趣表现在制备包含气体和产生气体的系统中。
也已知含气体的造影介质在磁共振(MR)造影中有效，例如作为易感性造影剂，其可减少MR信号强度。含氧的造影介质也代表潜在有用的顺磁MR造影剂。
此外，在X光造影领域中观察到气体(如二氧化碳)可用作为阴性口服造影剂或血管内造影剂。
已提出将放射性气体(例如惰性气体的放射性同位素如氙)用于闪烁照相中(例如血液池造影)。
人们认为导向超声造影剂包含(ⅰ)能够与超声波辐射相互作用产生可检测信号的报道物的组分；(ⅱ)在体内与特殊的导向点和/或结构(例如病理学的特定细胞或区域)具有亲和性的一种或多种载体；(ⅲ)一种或多种连接所说的报道物和载体的接头(如果它们不直接相连)。
造影剂所要结合的分子和/或结构在下文中被称为靶。为了在体内所选择的区域/结构获得特定图象，在本区域/结构中必须存在和可利用有效的靶。理想的是仅在所需区域中得以表达，但通常在体内其它位置也有表达，这产生可能的背景问题。靶可以是确定的分子种类(如靶分子)或未知的分子或复合结构(如靶结构)，它们存在于待造影的区域中，且能够特异性地或选择性地结合给定的载体分子。
载体连接在报道物组分上，从而使这些部分结合到待造影的区域/结构上。载体可特异性地结合到所选择的靶上，或者它则仅为选择性地结合，对少量其它分子/结构也具有亲和性，这又产生了可能的背景问题。
仅具有与导向超声造影剂有关的有限的现有技术的例子。例如US-A-5531980涉及这些系统，在这些系统中所说的报道物包含一种空气或气体微泡(其由至少部分呈薄片状的一种或多种形成膜的表面活性剂稳定化)的含水悬液，所说的表面活性剂结合在一种或多种载体(其包含″为特异导向所设计的生物活性物质″)上。据述微泡不直接由表面活性剂物质进行包裹，但却掺入到装有液体的脂质体(其稳定化微泡)内。位于脂质体的薄片状的表面活性剂物质如磷脂将不可避免地呈现一种或多种脂质双层形式，亲脂的尾部″背-对-背″而亲水的头部分别位于内部和外部(参见例如Schneider,M.药物导向″作为药物载体的脂质体10年的研究″，Nyon，瑞士，3-5,1984年10月，Buri,P.和Gumma,A.(Ed),Elsevier,Amsterdam 1984)，这是很有利的。
EP-A-0727225描述了导向的超声造影剂，其中报道物包含一种具有足够水蒸气压力的化学药品，这样在施用对象的体温下它的组分为气体。该化学药品与表面活性剂或白蛋白载体有关，包括作为载体的蛋白质-，肽-或糖-基质的细胞粘着分子配体。在这些造影剂中的报道物组分对应于WO-A-9416739中所描述的相转变胶体系统；现在认识到这样施用相转变胶体可以导致微泡的产生，微泡的生长无法控制，有可能达到引起潜在的危险的栓塞(例如心血栓和脑血栓)的程度(参见例如Schwarz，回波造影的进展[1994(3)],pp48-49)。
WO-A-9320802提出，可利用连接在组织特异性配体(如抗体，肽，外源凝集素等等)上的声象反射单层脂质体增强组织-特异性超声图象。故意挑选没有气体的脂质体，这样没有基于气体的超声造影剂的有利的回波性质。此外本技术的一些参考文献，例如在血纤蛋白，血栓，动脉硬化症区域的导向定向，见出版物Alkanonyuksel,H.等，制药科学杂志(1996)85(5),486-490；J.Am.Coll.Cardiol.(1996)27(2)Suppl A,298A；循环，68科学会议，Anaheim 1995,11,13-16。
也有关于超声造影剂的一些出版物，其顺便谈到可利用单克隆抗体作为载体但没有给出重要的实际细节和/或包含报道物的物质，这些物质可被网状内皮系统吸收，因此可增强器官(肝)图象如-参见，例如WO-A-9300933,WO-A-9401140,WO-A-9408627,WO-A-9428874,US-A-5088499,US-A-5348016和US-A-5469854。通常，这些现有技术的导向造影剂旨在通过利用一种载体牢固结合在一类靶上(以便集中在靶细胞上)来提高在体内特异性位点处的造影作用，例如肿瘤细胞。与利用一种载体高亲和性地结合一类靶的原则相比，本发明部分地基于该发现具有更多良好性质的诊断和/或治疗活性剂可通过多种载体/靶相互作用而获得(例如这些活性剂包括连接了许多不同的载体和/或一种或多种对相同或不同的细胞类型上的靶具有亲和性的载体的活性剂)。按照该方法，充气和产气的诊断和/或治疗活性剂的结合可以通过形成结合对来获得，如，在一种对多种受体具有特异性的载体之间或者在多种对一种或多种类型的靶具有亲和性的载体之间形成多具有或低或高亲和性的结合对。缀合了载体的活性剂与一种或多种靶分子/结构的这种多结合作用可产生有利的导向性质，例如通过增强靶特异性和/或使得在所需靶区域的相互作用区别于低水平的与在体内其它地方表达的靶类似的分子/结构的背景的相互作用。
众所周知利用一种高亲和性地结合在一类靶上的载体。然而，本发明基于该发现充气和产气的诊断和/或治疗活性剂的所需结合可以通过在一类载体和一类靶之间形成低亲和性的多结合对，或者在一种或多种载体和一种或多种类型的靶之间形成具有或低或高亲和性的多结合而实现。这样缀合载体的活性剂与一种或多种靶分子/结构的多结合作用具有有利的导向性质，例如增强靶特异性和/或使得在所需靶区域的相互作用区别于低水平的与在体内其它地方表达的靶类似的分子/结构的背景的相互作用。
这样根据本发明的一个方面，这里提供了一种可导向的诊断和/或治疗的活性剂，例如超声造影剂，其包含一种含水载液的悬液，例如报道物的可注射的载液，其中所说的报道物包含充气或产气的物质，经鉴定在其中的所说活性剂能够形成至少两种类型的结合对，例如缀合了至少两个载体或缀合了一个能够结合至少两个结合位点的载体。
本发明的一个有利的实施方案是基于另外的发现，即与靶粘着的有限性是诊断和/或治疗活性剂的一种非常有用的性质，该性质是利用临时逗留而非固定化结合到靶上产生的。这些活性剂(不是固定地保持在位点的那些试剂)可以助它们与内皮细胞的瞬时相互作用有效地显示沿脉管内皮细胞层延缓流速的形式。在超声造影剂提供的增强的回波性(其与血流量有关)的情况下，这些药剂可集中于血管壁上，这没有解剖学上的特性。因此，它们可增强毛细管系统的造影(包括微脉管系统)，并且利于区分正常和不充分散布的组织(例如在心脏中)，并且也对视觉结构(如Kupffer细胞，血栓，及动脉硬化症损伤)有用或对视觉新生血管和发炎组织区有用。本发明特别适于使发生于位于组织坏死区域中的正常血管中的变化造影。
人们知道结合亲和性依赖于相互作用的数量和强度。因此可选择在报道物单位表面的载体分子的密度以便适当地调整特定活性剂和靶之间的相互作用的程度。
术语多特异性用于描述充气或产气物质的可注射的载液，其中这些物质由一种或多种特异性于一种或多种细胞表面受体的载体组成，并且其还包含特异性于与之结合引起治疗效应的底物或受体系统的另外的元件。这样包括在本发明的范围之内的是多特异性的造影剂，其包含靶载体，如Lanza等所描述的抗纤维蛋白的抗体(循环，(1996)94(12),pp3334)，结合了肽如YRALVDTLK的膜联蛋白V动脉硬化斑，或已知与血纤蛋白凝块有关的结合了下列药物或酶(其具有纤维蛋白溶酶活性)的任何其它载体诸如链激酶，纤溶酶原激活物(tPA)，尿激酶(uPA)或者尿激酶原(scuPA)(它们产生局部治疗抗血栓形成作用)。本发明也扩展至包括具有对肿瘤细胞增加的特异性的载体，其结合了可作为化疗活性剂起作用(能够抑制肿瘤生长)的载体或药物分子。
众所周知，许多(如果不是所有)靶分子不专门在靶位点表达；普遍情况是这些分子在靶细胞或靶结构处超量表达但也在体内其它地方得以低水平表达。在这种情况下，利用携带对靶具有较低亲和性的多样性载体的报道物可具优势，因为报道物倾向于集中在使得可以与报道物形成多结合(因此牢固)的高靶密度的区域(例如充气活性剂掺入了对肿瘤细胞分别超量表达的叶酸受体和谷胱甘肽-S-转移酶受体具有多特异性的载体叶酸和谷胱甘肽)。另一方面，在低靶密度的区域不会提供足以结合靶的与这样低亲和性载体的相互作用。在本发明的这些实施例中，认为低亲和性载体具有与靶分子或结构相互作用的不超过108M-1的连接常数Kn，例如不到107M-1，优选的不到106M-1。本发明的另一个实施方案基于这样的发现充气和产气的诊断和/或治疗活性剂的所需结合可以通过在多种载体和多种靶之间形成低亲和性的多结合对而获得。因此可利用多种载体来增加特异性，那么该报道物将仅仅结合在表达特定靶分子组合的靶细胞或结构上。
选择结合在不同部分(如靶结构的表位)的许多载体以增加结合强度也是有用的。当靶密度低时，其特别有利。
可有利地利用包含两种或多种具有不同特异性(即其结合在不同细胞的不同靶分子上)的载体的产品作为″一般目的″活性剂以检测一定范围的疾病，例如不同形式的癌。这样，例如，利用这些活性剂使得能够检测转移癌，其在靶分子的表达方面经常是不均匀的。
在本发明的上下文中，报道物单位通常仍连接在载体上。在另一类导向方法(有时称预导向)中，单独施用载体(经常为单克隆抗体)；其后，施用偶连了能特异性结合载体分子的组分的报道物(当载体是抗体时，报道物可偶连结合免疫球蛋白的分子如蛋白质A或偶连抗免疫球蛋白的抗体)。该方案的优点是使得有时间消除不与其靶相结合的载体分子，明显减少与报道物-载体缀合物过量存在情况有关的背景问题。在本发明的上下文内，可以设想具有一种特异性载体的预导向作用，其后为偶连了另一个载体以及结合在第一个载体上的组分的报道物单位。
在本发明的上下文内，在某些情况下，尤其在特定区域的血液灌流速率的估价情况下(如在心肌中)，人们感兴趣去测量显示或从该靶上释放出结合在靶上的超声造影剂的速率。该方法可通过尔后施用载体或其它活性剂(它们能够取代或从靶上释放出造影活性剂)以一种控制的方式来完成。
依据本发明有用的载体包括细胞粘着蛋白质的配体以及这些在内皮细胞表面具有对应的配体的细胞粘着蛋白质本身。细胞粘着蛋白质的例子包括整连蛋白，其大多数结合了Arg-Gly-Asp(RGD)氨基酸序列。如果需要，载体可以导向特定细胞粘着蛋白，其主要在活化的内皮细胞(例如发现在或靠近发炎或其它病理反应的位点)上得以表达。其它可利用的载体包括与细胞表面的蛋白聚糖相结合的蛋白质和肽，其中蛋白聚糖是蛋白质和硫化多糖的复合物，并且发现其存在于大多数细胞(包括内皮细胞)上。这样的蛋白聚糖有助于来源于脊椎动物的所有有核细胞形成阴性表面电荷；依据本发明这些电荷也能通过利用与内皮细胞表面发生静电相互作用的正电荷的载体(例如其包含阳离子类脂)而实现。
本发明的另一方面是那些实施例，例如其中一种载体或多种载体连接在报道物上或者以一种方式(其中所说的载体不易暴露给靶或受体)非共价地包含在报道物内。通过实施附加的方法以暴露出载体可以增加组织特异性，例如在施用后将活性剂暴露在外部超声波下以改变包含载体的组分的扩散率。
报道物可以是任何便利的形式，例如任何合适的充气或产气超声造影剂制剂。这些制剂的典型例子包括经下列物质稳定化(如至少部分地胶囊化)的微气泡抗聚结的表面膜(例如明胶，如WO-A-8002365的描述)，产生膜的蛋白质(例如白蛋白如人血清白蛋白，见US-A-4718433,US-A-4774958,US-A-4844882,EP-A-0359246,WO-A-9112823,WO-A-9205806,WO-A-9217213,WO-A-9406477或WO-A-9501187的描述)，聚合物(例如EP-A-0398935描述的合成的可被生物降解的聚合物，EP-A-0458745描述的弹性的界面的合成聚合物膜，EP-A-0441468描述的微粒状的可被生物降解的聚乙醛，EP-A-0458079描述的微粒状的聚氨基酸-多环二酰亚胺的N-二羧酸衍生物，或WO-A-9317718或WO-A-9607434描述的可被生物降解的聚合物)，非聚合的和不可聚合的形成壁的物质(例如见WO-A-9521631的描述)，或者表面活性剂(例如聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物表面活性剂，如Pluronic,WO-A-9506518描述的聚合物表面活性剂，或形成膜的表面活性剂如磷脂，如见WO-A-9211873,WO-A-9217212,WO-A-9222247,WO-A-9428780或WO-A-9503835的描述)。
其它有用的充气造影剂制剂包括充气固体系统，例如微粒(尤其是微粒聚合体)其具有内部包含的气体或其以其它方式缔合的气体(例如吸附在其表面上和/或包含在其空隙，腔或孔内，如见EP-A-0122624,EP-A-0123235,EP-A-0365467,WO-A-9221382,WO-A-9300930,WO-A-9313802,WO-A-9313808或WO-A-9313809的描述)。人们认为这些微粒状造影剂的回波性可直接来源于所包含的/缔合的气体和/或从固体物质中释放(如通过溶解微粒化结构)的气体(例如微泡)。
本文一并参考上述所有涉及充气造影剂制剂的文献公开的内容。
微气泡和其它充气物质(如微粒)优选为初始不超过10μm的平均大小(例如7μm或更小)，这样使得施用后(如通过静脉内注射)它们能自由通过肺部系统。
按照本发明当利用含磷脂组合物(如磷脂稳定化的微气泡的形式)时，有用的磷脂的典型例子包括卵磷脂(即磷脂酰胆碱)，例如天然卵磷脂如蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂以及合成的或半合成的卵磷脂如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰氨基乙醇；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；心磷脂；鞘磷脂；任何上述的氟化类似物；任何上述的混合物和与其它脂质(如胆固醇)的混合物。利用主要含有(例如至少75％)分别带全部净电荷如负电荷分子的磷脂是非常有利的，例如在天然存在的(如大豆或蛋黄衍生的)，半合成的(如部分地或充分氢化)和合成的磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸和/或心磷脂中均为负电荷。
其它可用来制备充气造影剂的例证性脂质包括脂肪酸，硬脂酸，棕榈酸，2-n-十六烷基油脂酯酸，油酸和其它包含脂质结构的酸。当通过形成酰胺键使这些脂质结构偶连在包含一个或多个氨基的氨基酸上时，认为这些脂质结构非常有意义。认为所形成的脂质修饰的氨基酸(例如二棕榈酰赖氨酸，二硬脂酰-2,3-二氨基丙酸)是功能化的间隔元件(其特性为具有缀合一种或多种载体分子的连接位点)连接的有用的前体物。
本发明的另一扩展涉及合成包含一种连接在接头部分(如PEG，聚氨基酸，烷基卤化物等)的脂质报道物的脂肽结构，所说的接头具有适于偶连一种或多种载体分子的作用。极为优选的是包含带正电荷的接头元件(如两个或多个赖氨酸残基)，其通过与带负电荷的膜发生静电作用从而锚定微型气泡中的报道物元件。通过混合和掺杂磷脂充气结构与一种或多种导向脂肽序列可产生多特异性导向。也可通过将多种载体装配在分支的赖氨酸核心结构上，诸如Tam等描述的那些结构(美国国家科学院院报1989,86,9084)或通过以线型序列掺入多种载体来获得多特异性。也可利用包含通过化学合成法(如Lowe，组合化学，化学学会回顾，1995,309-317描述的)合成的组合文库的脂肽或磷脂来获得多特异性。
同样在本发明的范围内是具有一种或多种反应基团(其与位于细胞表面的受体分子进行非特异性的反应)的功能化微泡。包含巯基组分的微泡，例如，可通过二硫化物的交换反应结合到细胞表面上。该共价键的可逆性质意味着可以通过改变氧化还原环境控制气泡流动。同样包含活化酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的膜的活化微泡可以用来修饰在多种细胞表面分子上发现的氨基。
依据本发明有用的含气体的微粒状物质的典型例子包括碳水化合物(例如己糖如葡萄糖，果糖或半乳糖；二糖如蔗糖，乳糖或麦芽糖；戊糖如阿拉伯糖，木糖或核糖；α-,β-和γ-环糊精；多糖如淀粉，羟乙基淀粉，直链淀粉，支链淀粉，糖原，菊粉，出芽短梗霉聚糖，葡聚糖，羧甲基葡聚糖，葡聚糖磷酸，酮葡聚糖，氨乙基葡聚糖，藻酸盐，壳多糖，脱乙酰壳多糖，透明质酸或肝素；以及糖醇，包括糖醇如甘露糖醇或者山梨糖醇)，无机盐(例如氯化钠)，有机盐(如柠檬酸钠，乙酸钠或酒石酸钠)，X-射线造影剂(例如任何市售的羧酸和非离子的酰胺造影剂，其通常至少含有一个在3-和/或5-位上具有取代基，如羧基，甲氨酰，N-烷基甲氨酰，N-羟基烷甲氨酰，酰氨基，N-烷酰氨基或烷氨基甲基的2,4,6-三碘代苯基，如在甲泛影酸，泛影酸，碘拉酸，碘克沙酸，碘十六烷醇，碘戊醇，碘帕醇，碘二黄醇，碘丙胺，甲泛葡胺，碘肥胺，泛影碘肥胺，泛影乙酰氨基三碘苯甲酸盐和泛影葡甲胺中)，以及多肽和蛋白质(例如明胶或白蛋白如人类血清白蛋白)。
任何生物亲和的气体可存在于根据本发明的造影剂的报道物中，本文使用的术语″气体″包括在正常人体温度37℃下基本上或完全为气体(包括蒸气)形式的任何物质(包括混合物)。因此这些气体包括例如，空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；惰性气体如氦，氩，氙或氪；氟化硫如六氟化硫，十氟化二硫或五氟化三氟甲基硫；六氟化硒；卤代或非卤代的硅烷如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量的碳氢化合物(例如包含多达7个碳原子的)，例如烷(如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷或戊烷)，环烷(如环丙烷，环丁烷或环戊烷)，烯(如乙烯，丙烯，丙二烯或丁烯)，或炔(如乙炔或丙炔)；醚(如二甲醚)；酮；酯；低分子量卤代碳氢化合物(例如包含多达7个碳原子的)；或任何上述的混合物。有利的是在卤代气体中的至少-些卤原子为氟原子；这样，生物相容的卤代碳氢化合物气体例如可选自下列，溴氯二氟甲烷，氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，溴三氟甲烷，氯三氟甲烷，氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，氯三氟乙烯，氟乙烯，乙基氟化物，1,1-二氟乙烷，以及全氟碳，例如全氟烷烃，如全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷(例如全氟-正-丁烷，或与其它异构体的混合物，如全氟-异-丁烷)，全氟戊烷，全氟己烷及全氟壬烷；全氟烯烃，如全氟丙烯，全氟丁烯(例如，全氟丁-2-二烯)和全氟丁二烯；全氟炔烃如全氟丁-2-炔烃；及全氟环烷如全氟环丁烷，全氟甲基环丁烷，全氟二甲基环丁烷，全氟三甲基环丁烷，全氟环戊烷，全氟甲基环戊烷，全氟二甲基环戊烷，全氟环己烷，全氟甲基环己烷，以及全氟环壬烷。其它卤代气体包括氯代甲烷，氟化(例如全氟化)酮如全氟丙酮，和氟化(例如全氟化)醚如全氟二乙醚。由于认识到在血流内包含这些气体的微泡的高稳定性，因此尤为优选利用全氟化的气体，例如六氟化硫和全氟碳，如全氟丙烷，全氟丁烷和全氟戊烷。
报道物可通过任何便利的方法进行制备，例如通过制备充气或产气的制剂。代表性例子包括通过将表面活性剂与气体相接触并在含水载液存在下将其混合从而制备微气泡悬液的方法(如WO9115244所述)；或通过在气体存在下使形成膜的物质的溶液或弥散物雾化以获得中空的微囊(如EP512693A1所述)的方法；或通过双重乳化方法制备固体微球体的方法(如US5648095所述)；或通过喷雾干燥法形成中空的微裳的方法(如EP681843A2所述)；或通过在气体存在下振荡包含脂质的水溶液来制备充气脂质体(如US5469854所述)。
适用于使所需载体连接在报道物上的方法包括利用报道物和载体表面上的反应基团用合适的接头对预先形成报道物进行表面修饰化。在该方法的任何步骤将报道物物质与含载体的物质相混合在生理上特别有利。这样的方法将使载体掺入或连接在道报道物上。可选择的方法步骤可通过在分离后洗涤充气微粒以除去未结合在报道物上的过量载体，例如通过浮选法。优选的方面是利用掺入了官能团(诸如巯基，马来酰亚胺生物素等)的脂肽结构，其中所说的官能团可以在充气活性剂形成之前与其它报道分子预混合(如果需要)。利用下面列出的接头试剂可使载体分子相连接。
通过共价或非共价方法可使报道物单位连接在所需载体上，该方法通常包括位于报道物和/或载体上的一个或多个官能团的相互作用。为达到本目的所采用的化学反应官能团的例子包括氨基，羟基，硫氢基，羧基，和羰基，以及糖基，邻位二醇基，硫醚基，2-氨基醇基，2-氨基硫基，胍基，咪唑基和酚基。
因此利用连接剂(包含能与这些官能团反应的组分)可产生报道物和载体之间的共价连接。可与硫氢基反应的反应性部分的例子包括X-CH2CO-(其中X=Br,Cl或I)类型的，α-卤代乙酰基化合物，它们对硫氢基具有特殊的反应性，但其也可用来修饰咪唑基，硫醚基，酚基及氨基(如Gurd,F.R.N酶学方法(1967)11,532所述)。对于硫氢基，也考虑选择N-马来酰亚胺的衍生物，但其在一定的条件之下在连接氨基上也有用。如Kitagawa,T.等在化学药物信息(1981)29,1130中所述，N-马来酰亚胺可掺入到使报道物与载体缀合的连接系统中，或如Kovacic,P.等美国化学学会(1959)81,1887所描述的可用作稳定化小泡的聚交连剂。如Traut,R.等在生物化学(1973)12,3266所描述的，反应剂如2-亚氨基硫醇盐(其可通过转化氨基而引入硫醇基)在通过形成二硫键进行连接时可作为硫基反应剂。由于可通过在载体与报道物间的二硫化物交换来进行连接，因此这些引入反应性二硫化物键至载体或报道物的反应剂是很有用的，这些反应剂的例子包括Ellman试剂(DTNB),4,4’-二硫二吡啶，甲基-3-N-2-吡啶基二硫化物(见Kimura,T.等(1982)122,271)。
能与氨基反应的反应性组分的例子包括烷化和酰化试剂。代表性烷化试剂包括ⅰ)α-卤代乙酰基化合物，其在缺少反应性巯基的情况下对氨基具有特异性，其类型为X-CH2CO-(其中X=Br,Cl或I)，如Wong,Y-H.H.生物化学(1979)24,5337所描述的；ⅱ)N-马来酰亚胺衍生物，其可通过加入环羰基进行Michael类型反应或酰化作用而与氨基反应(如Smyth,D.G.等美国化学学会杂志(1960)82,4600和生物化学杂志(1964)91,589所描述的；ⅲ)芳基卤化物，如反应性硝基芳香卤化物；ⅳ)烷基卤化物，如McKenzie,J.A.等在蛋白化学杂志(1988)7,581中所描述的；
ⅴ)能与氨基形成希夫碱的醛和酮，所形成的加成产物通常通过还原反应而被稳定化从而形成稳定的胺；ⅵ)环氧化物衍生物，如表氯醇和bisoxiranes，其能与氨基，硫氢或酚羟基进行反应；ⅶ)含氯的S-三嗪衍生物，其极易与亲核试剂(如氨基，硫基及羟基)反应；ⅷ)基于上述详述的S-三嗪化合物的氮丙啶，例如Ross,W.C.癌研究进展(1954)2,1所描述的，其通过开环与亲核试剂如氨基进行反应；ⅸ)方形酸二乙酯，如Tietze,L.F.Chem.Ber.(1991)124,1215中所述；以及ⅹ)α-卤烷基基醚，其与通常的烷基卤化物相比是更具反应性的烷化剂(由于醚氧原子所造成的活化)，例如Benneche,T.等药物化学杂志(1993)28,463所描述的。
与氨基反应的酰化剂的代表包括ⅰ)异氰酸盐和异硫氰酸盐，特别是芳香族衍生物，其分别形成稳定的脲及硫脲衍生物，并已曾用于蛋白质交联，如Schick,A.F.等生物化学杂志(1961)236,2477所述；ⅱ)磺酰基氯化物，其可将荧光报道物基团导入至连接物中，已由Herzig,D.J.等生物聚合物(1964)2,349描述；ⅲ)酸性卤化物；ⅳ)活性酯，如硝基苯酯或N-羟基琥珀酰酯；ⅴ)酸性酸酐，如混合的，对称的或N-羧基酸酐；ⅵ)其它形成酰胺键有用的试剂，如Bodansky,M.等肽合成原理(1984)Springer-Verlag所述；ⅶ)酰基叠氮化物，例如其中叠氮化物基是通过利用亚硝酸钠由预先形成的酰肼衍生物产生的，例如Wetz,K.等分析生物化学(1974)58,347所述；
ⅷ)连接在聚合物上的吖内酯(如双丙烯酰胺)，例如Rasmussen,J.K.反应聚合物(1991)16,199中所述；以及ⅸ)亚氨基酯，其与氨基反应形成稳定的脒，例如Hunter,M.J.和Ludwig,M.L.美国化学学会杂志(1962)84,3491中所述。
羰基(如醛官能团)在一定pH下可与弱蛋白质碱进行反应，这样亲核蛋白质侧链官能团被质子化。弱碱包括1,2-氨基硫醇，如位于N-末端半胱氨酸残余物中的那些，它们与醛基选择地形成稳定的5员噻唑烷环，如Ratner,S.等美国化学学会杂志(1937)59,200中所述。也可利用其他的弱碱基如苯基腙，见Heitzman,H.等美国国家科学院院报(1974)71,3537。
醛和酮也可以与苯胺类反应形成希夫碱，该碱可以通过还原氨基化而被有利地稳定化。烷氧氨基部分易与酮和醛类进行反应而产生稳定的烷氧基胺，如Webb,R.等在生物轭合物化学(1990)1,96中所述。
能与羧基反应的反应部分的例子包括重氮化合物(如重氮基乙酸乙酯和重氮基乙酰胺)，它们具有高特异性产生酯基的反应力，例如Herriot R.等在蛋白化学进展(1947)3,169中所描述的。也可采用羧酸修饰的试剂如碳化二亚胺，其通过形成O-酰基脲接着形成酰胺键而进行反应；连接反应可通过添加胺促进或导致直接的载体-受体偶联。有用的水溶碳化二亚胺包括1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺(CMC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)，例如Zot,H.G.和Puett,D.在生物化学杂志(1989)264,15552中所描述的。其他有用的羧酸修饰的试剂包括isoxazolium衍生物如Woodwards试剂K；氯仿盐，如p-X硝基苯氯仿盐；羰二咪唑，如1,1′-羰二咪唑；和N-烷氧羰基二氢喹啉，如N-(乙氧羰基)-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉。
其它有用的反应部分包括邻二酮如P-亚苯基二乙二醛(其可用来与胍基反应，如Wagner等在核酸研究(1978)5,4065中所描述的)；以及重氮盐(其可进行亲电子取代反应，如Ishizaka,K.和Ishizaka T.在免疫学杂志(1960)85,163中所描述的。在酸性溶液中，通过用亚硝酸钠处理芳基二胺易于制备双重氮化合物。将报道物和/或载体中的官能团(如果需要)在反应前转化成其它官能团(例如为了赋予另外的反应性或选择性)是有利的。对于该目的有用的方法的例子包括利用试剂(如二羧酸酸酐)将胺类转变成羧酸；利用试剂(如N-乙酰高半胱氨酸硫酮，S-乙酰氢硫基琥珀酸酸酐，2-亚氨基thiolane或含的巯基琥珀酢基衍生物)将胺转变成硫醇；利用试剂(如α-卤代醋酸盐)将硫醇转变成羧酸；利用试剂(如乙胺或2-溴乙胺)将硫醇转变成胺类；利用试剂(如碳化二亚胺接着利用二胺)将羧酸转变成胺类；利用试剂(如甲苯磺酰氯化物接着用硫代乙酸盐进行转酯并用乙酸钠其使水解成巯基)将醇转变成硫醇基。
酶作为无长度的交联剂可使载体与报道物相连接；这样，例如，转葡糖苷酶，过氧化物酶以及黄嘌呤氧化酶已经用于产生交联产物。通过形成酰胺键，反向蛋白酶解也可用于交联。
例如，通过多赖氨酰官能团化的报道物和多谷氨酰基官能团化的载体之间的静电相互作用，或通过以稳定金属复合物形式的螯合作用或通过高亲和性的结合作用(如亲和素/生物素结合)可形成载体报道物的非共价连接。通过电荷相互作用，非共价涂布在带负电荷膜表面的聚赖氨酸也增加微泡对细胞的非特异性亲和性。
此外，可将载体连接在已知结合磷脂的蛋白质或肽序列上。在许多实例中，磷脂单一分子可连接在蛋白质(如移位酶)上，而其它蛋白质可连接在主要由磷脂头基组成的表面上，这样这些蛋白质可用于载体连接到磷脂小球上；这样的蛋白质的一个例子是β2-糖蛋白I(Chonn,A.Semple,S.C.和Cullis,P.R.，生物化学杂志(1995)270,25845-25849)。已描述了磷脂酰丝氨酸结合蛋白，如Igarashi,K.等生物化学杂志270(49)29075-29078；会联蛋白是一类磷脂结合蛋白，其中许多特异性地将亲和素基结合到磷脂酰丝氨酸上(综述见Raynal,P和H.B.Pollard.会联蛋白估价多功能钙-和磷脂-结合蛋白的基因家族的生物学作用中的问题，生物化学和生物物理学报，1197:63-93。因此，具有这样的磷脂酰丝氨酸-结合蛋白的载体的缀合物可以用于将载体连接到类似性丝氨酸-包裹的微泡上。若已知结合蛋白的氨基酸序列，则可合成或分离磷脂结合部分，并且用于与载体缀合，这样避免了位于分子其它地方的生物活性。
通过对微球体结合分子的分子文库进行直接筛选，获得特异性结合到小球表面(或″膜″)上的分子也是可能的。例如，显示小肽的噬菌体文库可用于这样的选择。将小球和噬菌体显示文库简单混合，并且洗脱结合在飘浮小球上的噬菌体，从而进行选择。若需要，可在″生理条件″下(例如在血液中)进行选择，以除去与血液组分交叉反应的肽。这种类型的选择方法的优点是仅仅选择了不发生小球去稳定作用的结合分子(由于仅仅连接了完整飘浮小球的结合分子将升至顶端)。也可在选择过程期间加入某种″力″(例如压力)以确保不选择去稳定作用的结合部分。此外可在剪切条件下进行选择，例如首先让噬菌体与小球进行反应，然后在流动的条件下让小球经过涂布了抗噬菌体抗体的表面。用该方法可选择出可以抵抗体内剪切条件的结合体是可能的。将本方法所鉴别的结合部分连接(经肽合成的化学方法，或在DNA-水平上的载体分子重组)到载体上，以构成用以使任何载体分子连接到小球上的适用工具。
包含或偶连了肽或脂肽接头(其含有能居中插入膜的元件)的载体也可以使用。Leenhouts,J.M.等Febs Letters(1995)370(3),189-192描述了一个实例。对某些应用，也可利用由已知膜插入锚/信号所组成的非生物活性分子作为载体，其例子为Na,K-ATP酶，α-亚单位的H1疏水节段(Xie,Y.和Morimoto,T.生物化学杂志(1995)270(20),11985-11991所描述的)。锚基团也可以是脂肪酸或胆固醇。
利用亲和素或链霉抗生物素蛋白也可产生连接，这些物质具有四个与生物素高亲和性的结合位点。如果载体和报道物两者均被生物素酰化，则可利用亲和素使载体缀合在报道物上。例子参见Bayer,E.A.和Wilchek,M.生物化学分析方法(1980)26,1。这一方法也可扩展至包括报道物与报道物的连接，该方法增强小泡之间的联系，并随之增加潜在的回波性。
利用双特异性免疫球蛋白的双官能团性质可形成非共价偶联。这些分子可特异地结合两个抗原，而连接它们。例如，可利用双特异的IgG或化学合成的双特异F2(ab)′2片段作为连接剂。已报道了异双官能团的双特异性的抗体可连接两个不同的抗原，例如Bode,C.等生物化学杂志(1989)264,944和Staerz,U.D等美国国家科学院院报(1986)83,1453中所描述的。同样，任何包含两个或多个抗原决定簇的报道物和/或载体(例如Chen,Aa等美国病理学杂志(1988)130,216所描述的)可通过抗体分子交叉连接，并形成交连的且具有增加的回波性的多泡集合体。
如果需要，按照本发明可利用所谓无长度的连接剂(其可直接使两个反应化学基形成共价连接而无须介入另外的键，如在酰胺键形成时利用碳化二亚胺或酶或酶促方法)，例如引起非共价受体-载体连接的生物素/亲和素系统和引起疏水或静电作用的试剂。
然而，最常见的是连接剂包括由间隔元件连接的两个或多个反应部分(如上述)。间隔子的存在可使双官能团的接头在分子内或两个不同分子之间与特异性缀合物进行反应，在这两个组分之间形成键，并在报道物载体的连接中引入外部的接头来源的物质。在连接剂中的反应部分可相同(同双官能团试剂)或不同(异双官能团试剂或几个不同的反应部分的存在的试剂，异多官能团剂)，这样提供了试剂的多样性，可使任何化学物种之间(分子内或分子间)形成共价结合。
由连接剂引入的外部物质的性质对终产物的导向能力与总稳定性具有重要意义。这要求引入不稳定的键，如其包含间隔臂(其可被生物降解或化学性质敏感或其掺入了酶促切割位点)。此外该间隔子可包含聚合组分，例如充当表面活性剂并增强小泡稳定性。该间隔子也可含有反应性部分，例如象上述增强表面交联作用的部分，或它含有示踪元件，如荧光探针，旋转标记或放射性材料。
间隔元件典型地由脂肪族链构成，这些链可有效地隔离连接物中的反应部分，其间距为5和30。它们也可包括大分子结构，如聚(乙二醇)，这种聚合结构(此后称为PEG)是简单的天然聚酯，这些结构在生物技术和生物药物应用中引起人们的重视(参见例如MiltonHarris,J.编″聚(乙二醇)化学生物技术和生物药物应用″Plenum出版社(1992)。PEG在大多数溶剂中(包括水中)可溶，并且在含水的环境中每个乙二醇片段与两个或三个水分子结合而高度水化；这可阻止在PEG-修饰表面的其它聚合物或蛋白质的吸附。已知PEG无毒不会损害活性蛋白质或细胞，而共价连接的PEG为非免疫原性和非抗原性的。此外，PEG易于修饰和结合其它分子而对它们的化学性质只有小的影响。由PEG和其共聚物，包括嵌段共聚物如PEG-聚氨基甲酸乙酯和PEG-聚丙烯的许多用途可明显看到它们有利的溶解性和生物性质。
按照本发明所利用的PEG间隔子的合适分子量为，例如，120道尔顿和20千道尔顿之间。
网状内皮系统(RES)的细胞摄取微粒的主要机理是血液中的血浆蛋白质的调理作用；这些标记的外源微粒，然后其被RES吸收。按照本发明所利用的PEG间隔元件的生物性质可以用于以一种与PEGylate脂所观察到的相似方式增加造影剂循环时间(参见如Klibanov,A.L.等FEBS letters(1990)268,235-237和Blume,G.和Cevc,G.生物化学生物物理学学报(1990)1029,91-97)。
其它潜在有用的可以对载体进行的蛋白质修饰包括用神经氨酸苷酶、内糖基化酶或过碘酸盐进行的部分或完全去糖基化，因为去糖基化常常导致由肝、脾、巨噬细胞等较少的摄取，而蛋白质的新糖基化常常导致由肝和巨噬细胞增加的摄取；由蛋白酶解切割制备截短的形式(导致降低的大小和循环中缩短的半衰期)；阳离子化等，如以下文献中所述Kumagi等，生物化学杂志(1987)262,15214-15219；Triguero等，美国国家科学院院报(1989)86,4761-4765；Pardridge等，药物实验治疗杂志(1989)251,821-826，以及Pardridge和Boado,Pebs Lett.(1991)288,30-32。
利用结合在PEG间隔末端的抗体可增加兴趣区域的连接效力，(参见例如Maruyama,K.等生物化学生物物理学学报(1995)1234,74-80和Hansen,C.B.等生物化学生物物理学学报(1995)1239,133-144)。
在一些例子中，认为包括PEG组分使之作为缀合(其为与一个载体或多个载体或直接与报道物的缀合)中的稳定物是很有利的，其中PEG不充当间隔子。
其它间隔元件的代表包括结构型多糖类，如聚半乳糖醛酸，糖胺聚糖，肝素，纤维素及海洋多糖类如藻酸盐，脱乙酰壳多糖和角叉菜胶；储存型多糖类如淀粉，糖原，葡聚糖以及氨基葡聚糖；多聚氨基酸和其甲基和乙基酯(在赖氨酸，谷氨酸以及天冬氨酸的同和共聚物中)；和多肽，低聚糖和低核苷酸，它们可含可不含酶切割位点。
一般来说，间隔元件含有可切除的基团如，邻二醇，偶氮砜，酯，硫酯或二硫键基团。包含下式的可生物降解的亚甲基二酯或二酰胺(如下式所示)的间隔元件也可使用-(Z)m.Y.X.C(R1R2).X.Y.(Z)n-[其中X和Z选自-O-,-S-，和-NR-(其中R是氢或有机基团)；Y是羰基，硫羰基，砜基，磷酰基或类似的酸形成基团m和n各自是0或1；R1和R2都是氢，有机基团或-X.Y.(Z)m-基，或一起形成二价的有机基]；如在WO-A-9217436中所讨论的，这样的基团在酯酶的存在下易于被生物降解，例如在体内，但在缺少这些酶的情况下保持稳定。因此可将它们与治疗剂连接而使其慢慢释放。
由于聚(N-(2-羟乙基)异丁烯酰胺与细胞和组织相互作用的程度低，因此其可作为有用的间隔材料(参见例如Volfova,I.Rihova,B.和V.R.和Vetvicka,P.生物作用复合聚合物(1992)7,175-190)。对主要由密切相关2-羟丙基的衍生物所组成的类似聚合物的研究表明，其被单核吞噬细胞系统变成细胞内含物至相当低的程度(参见Goddard,P.Williamson,I.,Bron,J.,Hutchkinson,L.E.,Nicholls,J.和Petrak,K.生物作用复合聚合物(1991)6,424.)。
其它潜在有用的聚合间隔物质包括ⅰ)异丁烯酸甲酯与甲基丙烯酸的共聚物；其具腐蚀性(参见Lee,P.I.药理学研究(1993)10,980)，且该羧化物取代基与天然聚合物相比造成更高的溶胀度；
ⅱ)具有可被生物降解的聚酯的聚甲基丙烯酸酯的嵌段共聚物(参见例如San Roman,J.和Guillen-Garcia,P.生物材料(1991)12,236241 Biomaterials中)；ⅲ)氰基丙烯酸盐，如2-氰基丙烯酸的酯的聚合物，这些可被生物降解，并且以小颗粒的形式用于选择性药物传送(参见Forestier,F.,Gerrier,P.,Chaumard,C.,Quero,A.M.,Couvreur,P.和Labarre,C.抗菌化学治疗杂志(1992)30,173-179)；ⅳ)聚乙烯醇，其为水溶性，并且一般认为是生物相容的(参见例如Langer,R.调控释放杂志(1991)16,53-60)；ⅴ)马来酐与乙烯基甲基醚的共聚物，已有说明其具有生物腐蚀性(参见Finne,U.,Hannus,M.和Urtti，药理学杂志(1992)78.237-241)；ⅵ)聚乙烯吡咯烷酮(例如用分子量不到约25,000的)，其可经肾迅速过滤(参见Hespe,W.,Meier,A.M.和Blankwater,Y.M.Arzeim.-Forsch.药物研究(1977)27,1158 1162)；ⅶ)短-链脂肪族羟基氧酸的聚合物和共聚物，如乙醇酸，乳酸，丁酸，颉草酸及己酸(参见例如Carli,F.Chim.Ind.(米兰)(1993)75,494-9)，包括掺合芳香族羟基酸以增加它们降解速率的共聚物(参见Imasaki,K.,Yoshida,M.,Fukuzaki,H.,Asano,M.,Kumakura,M.,Mashimo,T.,Yamanaka,H.和Nagai.T.药理学杂志(1992)81,3138)；ⅷ)由乙二醇和对苯二甲酸单位交替组成的聚酯，例如DacronR，其不能被降解但具高度生物相容性；ⅸ)包括脂肪族羟基酸聚合物的可被生物降解片断的嵌段共聚物(参见例如Younes,H.,Nataf,P.R.,Cohn,D.,Appelbaum,Y.J.,Pizov,G.和Uretzky,G.生物材料人造细胞人造器官(1988)16,705-719，例如在与聚氨基甲酸乙酯的结合中(参见Kobayashi,H.,Hyon,S.H.和Ikada,Y.“水溶和可被生物降解的聚合物前体″-生物药物材料研究(1991)25,1481 1494)；
ⅹ)聚氨基甲酸乙酯，已知其在移植中具有很好的耐受性，并且其能与柔性的的“软”片段相结合，例如包括聚(四亚甲基乙二醇)，聚(丙二醇)或聚(乙二醇)和芳香族″硬″片段，例如包括4,4-亚甲基二(亚苯基异氰酸盐)(参见例如Ratner,B.D.,Johnston,A.B.合Lenk,T.J。生物药物材料研究应用药物材料(1987)21,59-90；Sa Da Costa,V.等细胞界面科学杂志(1981)80,445-452和Affrossman,S.等临床材料(1991)8,2531；ⅹⅰ)聚(1,4-二氧六环-2-酮类)，由于其可水解性的酯键可认为是可被生物降解的酯(参见例如Song,C.X.,Cui,X.M.和Schindler,A.Meb.Biol.Eng.Comput.(1993)31,S147-150)，并且这些包含增强它们的吸收性的乙交酯单位(参见Bezwada,R.S.,Shalaby,S.W.和Newman,H.D.J.农业的和合成的聚合物生物降解力和利用(1990)(Glass,J.E.和Swift,G.编辑)，167-174-ACS专题研讨系列，#433，华盛顿D.C.，美国-美国化学学会；ⅹⅱ)聚酐如具有双(4-羧基-苯氧基)丙烷的癸二酸(辛二酸)共聚物，在兔研究(参见Brem,H.,Kader,A.,Epstein,J.I.,Tamargo,R.J.,Domb,A.,Langer,R.和Leong,K.W.癌治疗研讨会(1989)5,55-65)和大鼠研究(参见Tamargo,R.J.,Epstein,J.I.,Reinhard,C.S.,Chasin,M.和Brem,H.生物药物杂志(1989)23,253 266)中已阐明该共聚物在脑中可用于药物的控释且没有明显毒性作用；ⅹⅲ)包含邻-酯基的可被生物降解的聚合物，其可在体内控制药物释放(参见Maa,Y.F.和Heller,J.控制药物释放(1990)14,2128)；以及ⅹⅳ)聚膦嗪，其为交互的磷和氮原子所组成的无机聚合物(参见Crommen,J.H.,Vandorpe,J.和Schacht,E.H.控制药物释放(1993)24,167-180)下表列出了可进行蛋白修饰(其可用于制备按照本发明的可导向的造影剂)的连接剂。异二官能团连接剂
备注(1)=可碘化的；(2)=荧光剂同双官能团的连接剂
生物素酰化试剂
备注DPPE=二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺；LC=长链蛋白修饰剂
一般来说，按照本发明所利用的连接剂将引起载体与报道物或者报道物与报道物的某种程度特异性的连接，并且也可利用它们以连接一种或多种治疗活性剂。
按照本发明所利用的超声成像形式包括二维和三维影像技术如B-模式影像(例如利用由下列情况产生的信号膜的变时振幅发射的超声波脉冲的基本频率，其亚谐函数或高谐函数或者发射的脉冲产生的总频率或不同频率，并且优选由基本频率或其第二谐函数产生的这些谐函数及影像)，彩色Doppler影像和Doppler振幅影像，以及后两者与上述任何的形式(技术)相组合的形式。出乎意料是，当按照本发明利用时，发现来自导向单层微球体的第二谐函数信号非常好。为了减少运动的影响，借助于合适的同步化技术(例如匣门控制受试者的ECG或呼吸运动)可收集组织的连续影像例如心脏或肾。改变伴随固定化或受阻的微泡的共振频率或频率吸收作用的方法对检测造影剂也有用。
本发明提供了向所需位点产物的治疗药物的传输(其结合了载体-介导的导向作用)的工具。″治疗剂″或″药物″是指一种在活体人类或非人的动物中对特定疾病具有有益作用的活性剂。例如，在WO-A-9428873和WO-A-9507072中已提出了药物和超声造影剂的Whilst组合，这些产品缺乏对特定位点具有亲和性的载体，因此在药物释放之前或期间，显示了在所需位点比较低的特异性保持力。
可将按照本发明所利用的治疗化合物包裹在微泡的壁内或附着在或掺入到包裹的壁上。这样，治疗化合物通过如共价或离子键可与壁的一部分相连接，或者使其物理混合至包裹物质中(尤其是如果药物具有与膜材料类似的极性或溶解性)，以阻止它在体内发生作用之前从产品中渗漏。施用后仅仅通过与血液的温接触即可启动药物的释放，或者在其它内部或外部的影响(例如通过酶催化的或利用超声波的分解方法)下而发生。在超声造影剂方面，众所周知利用外部超声波破坏充气微粒的现象，例如WO-A-9325241描述的；释放的速率可改变这取决于治疗应用的类型，及所利用的来自转换器的超声波能量的具体量。
利用合适的连接剂(例如本文描述的)，可使疗活性与包裹膜表面进行共价连接。这样，例如，可先制备磷脂或脂肽的衍生物(药物通过可被生物降解或可选择性切割的连接物可结合在该衍生物上)，接着将材料掺入至微泡中。此外，不需要释放活性药物处理的脂化药物分子可直接掺入到膜中。通过增加超声波束的强度可释放活性的脂化药物。
适用于该组合物的典型给药系统包括任何已知的包含巯基的治疗药物或其活性类似物，其中所说的巯基在氧化条件下产生双硫键从而偶连在含巯基的微泡上。与一种载体或多种载体结合的药物/载体修饰的微泡可积累在靶组织上。然后施用还原剂(例如还原的谷胱甘肽)使得在靶细胞附近的导向微泡释放药物分子，从而增加了药物的局部浓度，并提高治疗作用。如果需要，也可制备没有治疗剂的产品。在利用前，可将药物连接在或涂布在微泡上。这样，例如，可将治疗剂添加至在含水基质中的微泡悬液内，并振荡使治疗剂附着或粘附在微泡上。
其它给药系统包括结合导向载体的载体修饰的并掺入了脂肽结构(其包含聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸链)的磷脂膜。应用于治疗/反义技术上特别强调受体-介导的药物传送，微泡载体以DNA或RNA经过与聚阳离子的静电相互作用得以浓缩。该方法具有优点，即用于导向送递的一种载体或多种载体不直接附着在聚赖氨酸载体组分上。因为脂质链的存在，聚赖氨酸链在微泡膜上也锚定得更牢固。同样认为利用超声波以增加送递效能是有用的。
此外，首先用药物或载体分子修饰自由的聚赖氨酸链，然后其缩合在导向微泡的阴性表面上。
按照本发明的有用药物的典型例子(不限于这些)包括抗肿瘤活性剂，例如长春花新碱，长春花碱，长春碱酰胺，马利兰，苯丁酸氮芥，螺旋铂氨，顺式铂氨，炭铂氨，氨甲蝶呤，亚德里亚霉素，丝裂霉素，博莱霉素，阿拉伯糖基胞嘧啶，阿拉伯糖基腺嘌呤，巯基嘌呤，对氯苯邻氯苯二氯乙烷，丙卡巴肼，更生霉素(放线菌素D)，道诺红菌素，阿霉素，盐酸盐，紫杉醇，邹霉菌素，氨鲁米特，雌二醇氮芥，氟硝丁酰胺，leuprolide，甲地孕酮醋酸盐，三苯氧胺，睾内酯，腈环氧雄烷，安吖啶(m-AMSA)，天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)，依托泊甙，干扰素a-2a和2b，血液制品，如血卟啉或上述的衍生物；生物效应修饰剂，如胞壁酰肽；杀真菌剂，例如酮康唑，制霉菌素，灰黄霉素，氟胞嘧啶，双氯苯咪唑或两性霉素B；激素或激素类似物，如生长激素，黑素细胞刺激素，雌二醇，倍氯米松，二丙酸盐，倍他米松，可的松乙酸盐，地塞米松，氟尼缩松，氢化可的松，甲基强的松龙，对氟米松乙酸盐，强的松龙，强的松，氟羟强的松龙或氟氢可的松乙酸盐；维生素，如维生素B12或维生素A；酶，如碱性磷酸酶或锰超氧化物岐化酶；抗过敏剂，例如amelexanox；组织抑制因子，例如下游调节组织因子表达的单克隆抗体与其Fab片段，合成肽，非肽及化合物；血小板抑制因子如，GPⅠa,GPⅠb和GPⅡb-Ⅲa,ADP受体，凝血酶受体，冯维勒布兰德氏因子，前列腺素，阿斯匹林，氯苄噻啶，clopigogrel及reopro；凝聚蛋白靶抑制剂，例如FⅡa FⅤa,FⅦa,FⅧA,FⅨa，组织因子，糖原，水蛭素，hirulog,argatroban,DEGR-rFⅦa及膜联蛋白；血纤蛋白形成的抑制剂血纤蛋白溶酶的促进剂，如t-PA，尿激酶，纤溶酶，链激酶，rt-纤溶酶原激活物及r葡萄球菌激酶；抗血管生成因子，如甲羟孕酮，戊聚糖聚硫酸盐，苏拉明，红豆杉醇，酞胺哌啶酮，血管生成素，干扰素-α，金属蛋白酶抑制剂，血小板因子4，促生长素抑制素，血小板反应蛋白；循环药物，如普萘洛尔；代谢增效剂，如谷胱甘肽；抗结核药，如p-对氨基水杨酸，异烟肼，卷曲霉素硫酸盐，环性素，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，吡嗪酰胺，利福平或链霉素硫酸盐；抗病毒物，如无环鸟苷，金刚胺，叠氮胸腺嘧啶核甙，病毒唑或腺嘌呤阿糖苷；血管扩张剂，例如硫氮酮，硝苯吡啶，异搏定，赤藓糖醇四硝酸酯，异山梨醇二硝酸盐，硝化甘油或季戊四醇四硝酸酯；抗生素如4,4’-二氨二苯砜，氯霉素，新霉素，氯氨苄头孢菌素，羟氨苄头孢菌素，先锋霉素Ⅳ号，头孢环己烯，红霉素，氯林肯霉素，林可霉素，羟氨苄青霉素，氨苄青霉素，氨苄青霉素碳酯，羧苄青霉素，双氯青霉素，环青霉素，π氯青霉素，缩酮氨苄青霉素，甲氧苯青霉素，萘夫青霉素，青霉素，多粘菌素或四环素；消炎药如二氟苯水杨酸，异丁苯丙酸，吲哚美辛，甲氯芬那盐，mefenamic酸，萘普生，苯丁唑酮，吡氧噻嗪，四苯酰吡咯乙酸，阿斯匹林或水杨酸盐；抗原生动物剂，如氯喹，甲硝哒唑，奎宁或泛影锑酸盐；抗风湿剂，如青霉胺；麻醉剂如鸦片樟脑酊；鸦片剂，如可待因，吗啡或鸦片；强心甙，如脱乙酰基毛花洋地黄甙C，毛地黄毒苷，地高辛，洋地黄甙或洋地黄；神经肌肉的阻滞剂，如atracuriummesylate，三乙碘化拉加明，己芴溴铵，碘二甲箭毒，溴化双哌雄双酯，琥珀酰胆硷氯化物，筒箭毒氯化物或维库溴铵；镇静剂如异戊巴比妥，异戊巴比妥钠，阿颇巴比妥，5,5-乙基仲丁基巴比妥钠，三氯乙醛水合物，乙氯基戊烯炔醇，烃己蚁胺，氟安定盐酸盐，苯乙哌啶酮，甲氧异丙嗪盐酸盐，甲普里隆，咪达唑仑盐酸盐，三聚乙醛，戊巴比妥，西可巴比妥钠，仲丁烯丙巴比妥，temazepam或三唑仑；局部麻醉剂，如丁哌卡因，氯普鲁卡因，依替卡因，利多卡因，卡波卡因，普鲁卡因或四卡因；全身麻醉剂，如氟哌利多，甲苄咪酯，具有氟哌利多的芬太尼柠檬酸盐，氯胺酮盐酸盐，美索比妥钠或硫喷妥钠以及药学上可接受的盐(例如酸性盐如盐酸盐或溴酸盐，或碱性如钠盐，钙盐或镁盐)或者其衍生物(例如醋酸盐)。其它治疗剂的例子包括遗传物质，例如核酸，RNA，以及天然或合成来源的DNA，包括重组RNA和DNA。编码一定蛋白的DNA可用于治疗许多不同类型的疾病。例如，肿瘤坏死因子或白介素-2的基因可用来治疗晚期癌；胸苷激酶基因可用来治疗卵巢癌或脑癌；白介素-2基因可用来治疗神经细胞瘤，恶性黑素瘤或肾癌；并且白介素-4基因可用来治疗癌。
通过疏水相互作用与微泡壁相连接的药物的亲脂衍生物在作为微泡的一部分时或从微泡释放后(例如通过利用超声波)具有治疗作用。如果药物不具有所需的物理性质，掺入亲脂基以使药物锚定在膜上。掺入亲脂基优选应该以不影响分子在体内的作用的方法进行，或者该亲脂基可被切割而释放活性药物。可用各种化学方法掺入亲脂基，这取决于在药物分子中使用的官能团。利用药物分子中的能与适当官能团化的亲脂化合物进行反应的官能团可形成共价偶联。亲脂组分的例子包括分支和不分支的烷基链，环化合物，芳香族残基，及稠合芳香族和非芳香族的环系统。在一些实例中，亲脂组分将由适当官能团化的类固醇组成，如胆固醇和相关化合物。特别适合于进行衍生化作用的官能团的例子包括亲核基如氨基，羟基和巯基。适于任何含巯基(如甲巯丙脯酸)药物的亲脂衍化作用的方法包括直接烷化作用(例如在碱性条件下与烷基卤化物反应)和巯基酯形成(其通过与活化羧酸反应)。任何具有羧酸官能团的药物(如氨酰心安和苯丁酸氮芥)的衍生化作用的典型例子包括通过分别连接胺和乙醇的酰胺和酯的形成反应，使得具有所需物理性质。优选的方面使通过形成一个可降解的酯键而使治疗化合物连接在胆固醇上。
本发明优选的应用涉及血管生成(即通过由现有脉管出现分支而形成新的血管)。该过程的首要刺激可能是在组织中对细胞供给的营养和氧不充分(低氧)。细胞作出的反应使分泌血管生成因子，这些因子有许多；一个例子是血管内皮细胞生长因子。这些因子启动蛋白酶的分泌，这些蛋白酶分解基底膜的蛋白质，并启动限制这些潜在有害酶的作用的抑制剂的分泌。接合的损失和来自血管生成因子的受体的信号的组合影响造成内皮细胞移动，增殖，并重排，最后在新脉管周围合成基底膜。
当肿瘤生长至毫米大小时，为保持它们的生长速率它们必须开始血管生成。由于血管生成伴有内皮细胞和他们的环境的特征变化，该过程是治疗干涉的有用的靶。伴随血管生成的转换对诊断也十分有用，优选的例子是恶性疾病，但在发炎和各种炎症相关的疾病中该概念也具有很大用途。这些因子也涉及心肌的梗塞部分的血管再形成，如果在短时间内放松狭窄其将发生。
下表中给出了与血管生成有关的一些已知受体/靶。利用本文描述的导向原则，血管生成可由大多数在医药中利用的影像程式进行检测。增强造影的超声波具有另外的优点，其中造影基质是被限定在血管内部的微球体。即使在许多细胞类型上发现了靶抗原，微球体将附着在特定的内皮细胞上。
根据本发明所谓的前药也能用于活性剂中。可对这些药物进行衍生化作用以改变它们的物理化学性质，并使其适于包含进报道物内；认为这样衍生化的药物是前药，它们通常是失活的直到衍生化基团被切割掉重新生成活性药物形式。
通过含有前药激活酶的充气微泡对病理区域导向作用，人们可以作出酶的导向影像，并使得可以看到何时微泡适当地导向至病理区域并同时从非靶区域消失。按该方法，人们可确定将前药注射至个体患者体内的最佳时间。
在前药仅仅在一些外部刺激之后才活化的系统中，另一种可替方案是将前药，前药激活酶以及载体掺入到相同的微泡中。例如，这样刺激可能是上述的肿瘤特异性的蛋白酶，或是在所需的导向完成后的通过外部超声波的气泡裂解。
一般来说，按照本发明容易将治疗传送至有病或坏死的区域，包括心脏与脉管系统，以及肝，脾和肾和其它区域如淋巴系统，体腔或胃肠系统。
根据本发明的产品可用于体内或体外的导向治疗传送。在下文中，产品在体外系统中有用，例如在用于诊断不同疾病的或鉴定血液或组织样品中的不同组分的试剂盒中。在本发明中，可利用与那些在体外使一定血液组分或细胞附着在聚合物微粒上(例如单球体的磁性微粒)以使它们与样品分离的类似技术，利用本发明活性剂的报道物单位的低密度通过浮选和重复洗涤以实现充气物质的分离。
按照本发明用于产生多特异性的导向造影剂的有用载体包括下列ⅰ)抗体，其可用作为许多靶的载体，并且其具有有利的性质例如十分高的特异性，高亲和性(如果需要)，根据需要修饰亲和性的可能性等。抗体是否具生物活性取决于特定的载体/靶的结合。可使用常规和基因工程抗体，后者可通使得可以工程使抗体特合特殊需要，例如就亲和性和特异性而言。人抗体的利用对避免抗载体分子的可能的免疫反应可能是优选的。另一类有用的抗体包括所谓的双特异性抗体，即如在一个抗体分子中具有两种不同的靶分子的特异性的抗体。这些抗体可以例如促进小泡簇的形成，并且也可以用于各种治疗目的，例如向靶携带有毒部分。双特异性抗体的各方面见McGuinness,B.T.国家生物技术(1996)14,1149-1154；George,A.J.等免疫学杂志(1994)152,1802-1811；Bonardi等癌研究(1993)53,3015-3021；和French,R.R..等癌研究(1991)51,2353-2361。
ⅱ)细胞粘着分子，它们的受体，细胞因子，生长因子，肽激素及其片段。这些载体依赖于与靶分子受体的正常生物蛋白质-蛋白质的相互作用，因此在许多情况下在靶结合上时将产生生物效应，并且是生物活性的；这对载体(其导向蛋白多糖)相对而言没有意义。
ⅲ)细胞粘着分子，细胞因子，生长因子和肽激素的非肽兴奋剂/拮抗剂或非生物活性的受体粘合剂。该类别可以包括这些非生物活性载体，它们既非兴奋剂也非拮抗剂，但是具有有价值的导向能力。
ⅳ)通过Watson-Crick或其它碱基-配对类型与DNA或RNA结合的低核苷酸和修饰的低核苷酸。由于细胞破坏的结果是DNA通常仅在细胞外空间存在，那么这样的低核苷酸(其通常是非生物活性的)在例如向坏死区域的导向中可以是有用的，所说的区域与许多不同的病理状态有关。低核苷酸也可与特异性DNA-或RNA-结合蛋白相结合，例如转录因子(其经常在肿瘤细胞或活化免疫细胞或活化内皮细胞中得以高度超量表达。组合文库可以用来选择这些特异性结合可能的靶分子(从蛋白质到咖啡因)的低核苷酸，因此其可用作为导向的载体。
ⅴ)DNA-结合药物可以与低核苷酸表现相同，但是其若被细胞摄取则具有生物活性/或毒副作用。
ⅵ)各种小分子，包括已知结合到各种生物受体上的生物活性化合物。这些载体或它们的靶可以用于产生与相同的靶结合的非生物活性化合物。
ⅶ)通过功能性选择(在体外，来自体内或体内)与待造影的区域/结构相结合的分子，无须了解确切的分子靶即可由组合文库选择载体分子。
ⅷ)各种小分子，包括已知结合到各种生物受体上的生物活性化合物。这些载体或它们的靶可以用于产生与相同的靶结合的非生物活性化合物。
ⅸ)结合氨基葡糖聚糖侧链(如乙酰肝素硫酸盐)，包括大分子的氨基葡糖聚糖-结合部分的蛋白质或肽，因为与氨基葡糖醛酮聚糖测链结合不引起生物反应。在红细胞上没有发现蛋白多糖，由此除去不需要的在这些细胞上的吸附。
如下列出了有利于导向超声造影的其它肽载体和其脂肽动脉硬化噬斑的结合肽如YRALVDTLK,YAKFRETLEDTRDRMY和RALVDTEFKVKQEAGAK；血栓结合蛋白如NDGDFEEIPEEYLQ和GPRG，血小板结合蛋白如PLYKKIIKKLLES；缩胆囊素，促α-黑素细胞激素，热稳定肠毒素1，血管活性肠肽，以及来源于第三重链互补决定区的合成α-M2肽和其用于肿瘤导向的类似物。
根据包含这些载体的本发明，下表列出了各种可以由特定类型的载体导向的受体和可导向的超声造影剂使用的相应的区域。蛋白质和肽载体-抗体<
参考文献a)Heider,K.H.,M.Sproll,S.Susani,E.Patzelt,P.Beaumier,E.Ostermann,H.Ahorn，和G.R.Adolf.1996.″作为鳞状细胞癌免疫治疗的候选物″的CD44v6特异性的高亲和性的单克隆抗体的特征。癌免疫学免疫治疗43:245-253。b)I.Roitt,J.Brostoff，和D.Male.1985.免疫学，伦敦Gower医学出版，P.4.7c)Stromblad,S.，和D.A.Cheresh.1996.″整联蛋白，血管生成和脉管细胞残存者″。化学生物学和生物学3:881-885。蛋白质和肽载体-细胞粘着分子等
包含细胞因子/生长因子/肽激素和其片段的载体
各种蛋白质和肽载体
包含细胞因子/生长因子/肽激素/细胞粘着分子的非肽兴奋剂/拮抗剂的载体
包含抗血管生成因子的载体
包含血管生成因子的载体
不同于所识别的血管生成因子(已知其对血管生成有关的受体具有亲和性)的载体分子
与血管生成有关的受体/靶
>低核苷酸载体<
修饰的低核苷酸载体
核苷和核苷酸载体
包含DNA-结合药物的受体
包含蛋白酶底物的受体
包含蛋白酶抑制剂的受体
来自组合文库的载体
碳水化合物载体
脂载体
小分子载体
以上表格的参考文献A．Auerbach,W.和R.Auerbach.1994.″血管生成抑制作用回顾″。药物治疗。63:265-311。
B．Barinaga,M.1997.″导向肿瘤血管的设计的治疗法″。科学275(Jan.24):482-484。
C．Folkman,J.,P.B.Weisz,M.M.Joulli:,W.W.Li和W.R.Ewing.1989，″用合成的肝素代用品控制血管生成″。科学243:1490-1493。
D．Fox,S.B.和A.L.Harris.1997.″肿瘤血管生成的产生者在预测和抗-血管生成治疗中的临床应用″。研究新药物15(1):15-28。
E．Gastl,G.,T.Hermann,M.Steurer,J.Zmija,E.Gunsilius,C.Unger和A.Kraft.May 1997.″作为肿瘤治疗的靶的血管生成″。肿瘤学54(3):177-184。
F．Griffioen,A.W.,M.J.H.Coenen,C.A.Damen,S.M.M.Hellwig,D.H.J.Vanweering,W.Vooys,G.H.Blijham和G.Groenewegen.1997年8月1日。nCD44牵涉到肿瘤血管生成；人内皮细胞上的一种活化抗原″。血液90(3):1150-1159。
G．Hlatky,L.,P.Hahnfeldt和C.N.Coleman.1996.″Vacular内皮生长因子环境控制和在血管生成中的作用″。英国癌症杂志74(Suppl.ⅩⅩⅦ):S151-S156。
H．Maragoudakis,M.E.,E.Pipili-Synethos,E.Sakkoula,D.Panagiotopoulos,N.Craniti和J.M.Matsoukas.1996.″TRAP-诱导的血管生成被三肽Phe-Pro-Arg(一种凝血酶来源的肽类似物)的抑制″。肽科学通讯3:227-232。
I．Nguyen,M.1997.″血管生成因子作为肿瘤标记″。研究的新药物15(1):29-37。
J．One,M.,H.Izumi,S.Yoshida,D.Gtot,S.Jimi,N.Kawahara,T.Shone,S.Ushiro,M.Ryuto,K.Kohno,Y.Sate和M.Kuwano.1996.″血管生成作为肿瘤治疗的新的靶″。癌化疗药物。38(增刊):S78-S82。
K．Passe,T.J.,D.A.Bluemke和S.S.Siegelman.June 1997.″肿瘤血管生成对造影的指导″。放射学203(3):593-600。
L．Saclarides,T.J.February 1997.″结肠直肠癌中的血管生成″。北美外科临床77(1):253。
M．Sage,E.H.May 1997.″八个片段调节血管生成的胞外蛋白质的生物活性片段″。细胞生物学动向7(5):182-186。
N．Sagi-Assif,O.,A.Traister,B.Z.Katz,R.Anavi,M.Eskenazy和I.P.Witz.1996.″TNFa和抗-Fas抗体调节Ly-GE.1的肿瘤细胞表达在血管生成和Ly-GE.1之间的一种可能的联系″，免疫学通讯54:207-213。
O．Strawn,L.M.,G.McMahon,H.App,R.Schreck,W.R.Kuchler,M.P.Longhi,T.H.Hui,C.Tang,A.Levitzki,A.Gatit,I.Chen,G.Keri,L.Orfi,W.Risau,I.Flamme,A.Ullirch,K.P.Hirth和L.K.Shawyer.1996.″Flk-1作为肿瘤生长抑制的靶″。癌症研究56:3340-3545。
P．Stromblad,S.和D.A.Cheresh.December 1996.″细胞粘附和血管生成″。细胞生物学动向6(12):462-468。
Q．Stromblad,S.和D.A.Cheresh.November 1996.″整联蛋白，血管生成和血管细胞存活″化学和生物学3(11):881-885。
R．Volpert,O.,D.Jackson,N.Bouck,and D.I.H.Linter.September 1996.″类胰岛素生长因子Ⅱ/甘露糖6-磷酸受体对增殖素诱导的血管生成是所需的″。内分泌学137(9):3871-3876。
S．Yoshida,O.M.,T.Shone,H.Izumi,T.Ishibashi,H.Suzuki和M.Kuwano.1997.″白介素-8，血管内皮生长因子，生长因子和碱性成纤维细胞生长因子牵涉到肿瘤坏死因子α-依赖性血管生成″。分子细胞生物学。17:4015-4023。
T．Zimrin,A.B.,M.S.Pepper,G.A.McMahon,F.Nguyen,R.Montesano和T.Maciag.1996.″An Antsense Oligonucleotideto the Notch配体锯齿状加强成纤维细胞生长因子-诱导的血管生成的一种反义寡核苷酸(体外)″。生物化学杂志。271(Dec.20):32499-3502。
U．Albini,A.,R.Soldi,D.Giunciuglio,E.Giraudo,R.Benelli,R.Prime,D.Noonan,M.Salio,G.Camussi,W.Rockl和F.Bussolino.1996.″HIV-1 Tat蛋白质诱导的血管生成由血管内皮细胞上的Flk-1/KDR受体介导″。天然药物2(12(12月)):1371-1374。
V．Ferrara,N.1996.″血管内皮细胞生长因子的生物学″，血管生成的分子，细胞和临床方面，编者.M.E.Maragoudakis.纽约Plenum出版社。
X．Jackson,R.L.,S.J.busch和A.J.Cardin.1991.″糖胺聚糖分子性质，蛋白质相互作用和在加工中的作用″生理学回顾71(2):481-435。
Y．Kinsella,M.G.,C.K.Tsoi,H.T.Jarvelainen和T.N.Wight.1997，″在牛主动脉内皮细胞迁移期间二聚糖的选择性表达和加工-内源性碱性成纤维细胞生长因子的作用″。生物活性杂志272:318-325。
Z．Folkman,J.1996。肿瘤血管生成和组织因子。天然药物2,167-8ZA．Pelf,M.,S.LeJeune,P.A.Scott,S.Fox,K.Smith,R.Leek,A.Moghaddam,R.Whitehouse,R.Bicknell和A:L.Harris.1997。血管生成因子，血管内皮细胞生长因子，酸性和碱性成纤维细胞生长因子，肿瘤生长因子β-1，血小板来源的内皮细胞生长因子，胎盘生长因子和多效因子在人原发性乳房癌中的表达和其与血管生成的相关性。癌症研究。57,963-9。
ZB．Carmeliet,P.,L.Moons,M.Dewerchin,N.Mackman,T.Luther,G.Breier,V.Ploplis,M.Miiller,A.Nagy,E.Plow,R.Gerard,T.Edgington,W.Risau,D.Collen.1997.Ann,N.Y.Acad.Sci.811,191-206。
ZC．Van Hinsbergh,P.Koolwijk,R.Haanemaijer.1997.″纤维蛋白和纤溶酶原活化剂在修复相关血管生成中的作用用人内皮细胞碱性的体外研究″EXS 79,391-411。
Passe,T.J.,D.A.Bluemke和S.S.Siegelman.1997。放射学203:593-600。
下列非限制性实施例用于说明多受体特异性的概念。导致多载体掺入的载体、间隔和报道物以及缀合技术的其它组合也被认为与本发明有关。如WO-A-9607434所述，利用显微观察，确认产品微粒性质。利用宽带转导物进行超声透射测量，以说明产物悬液给出与标准相比增强的声束衰减作用。利用产物的流动细胞计数分析来确认抗体对其的连接情况。导向的活性剂特异性结合表达靶的细胞的能力可通过显微观察和/或利用包含固定化细胞的流腔室进行研究，例如利用一群表达靶结构的细胞和另一群不表达靶的细胞。放射性，荧光的或酶-标记的链霉抗生物素蛋白亲/和素均可用来分析生物素连接情况。实施例1-掺入了脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))的多特异性含气体的DSPS微泡的制备和生物学评价本实施例涉及含有若干以线型序列方式排列的多肽载体的导向微泡的制备。
a)包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的合成。
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc-Ile-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到150mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TPl022柱)对40mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到16mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV260和荧光，Ex280,Em350；-产物保留时间=19.44分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2198，实测值为2199。
b)含气体并掺入了多特异性脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))的DSPS微泡的制备。
称量DSPS(Avanti,4.5mg)和从a)中合成的脂肽(0.5mg)，分别放入2个小瓶，每个小瓶加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)。小瓶在加帽混合器(capmixer)中振荡45秒，转动微泡过夜。以去离子水洗涤气泡几次，并用库尔特计数器(大小1-3微米(87％),3-5微米(11.5％))和声学衰减(频率max att:3.5MHz)进行分析。在120mmHg条件下稳定微泡。用MALDI质谱分析确认掺合进DSPS的微泡，过程如下将大约0.05-0.1mL的微泡悬液转换到一个清洁的小瓶中，加入0.05-0.1ml甲醇。悬液用超声波处理30秒，用MALDI质谱分析。阳性方式给出脂肽的实测值M+H为2200，预测值为2198。
c)含气体并掺入了多特异性脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))的DSPS微泡的体外研究在流动条件下与内皮细胞结合将人内皮细胞系ECV340(得自一正常的脐带(ATCCCRL-1998))培养在260ml的Nunc培养烧瓶中(chutney153732)，培养基为RPMI1640(BioWhittaker)(其中加入了200mM L-谷酰胺，青霉素/链霉素(10.000U/mL和10.000mcg/mL)和10％胎牛血清(HycloneLotno.AFE5183))。以1∶5-1∶7的割裂比(split ratia)对细胞进行继代培养，直到铺满。将直径为22mm(BDH，产品号406/0189/40)的盖玻片消毒后，放置在12个孔的培养平板(Costar)的底上，然后在顶部加入培养在0.5ml含有血清的完全培养基中的细胞。当细胞铺满时，将盖玻片放到定制的流室中。所说的室由雕刻在玻璃板上的沟组成，带有细胞的盖玻片放在玻璃板上时，让细胞面对沟，形成一个流通道。在37摄氏度下将b)部分中制备的超声微泡从贮液槽穿过流室，再使用蠕动泵回到贮液槽。调整流速以便模拟生理状态下有关的剪切速率。将流室放置在显微镜下，可以直接观察到显微镜和细胞之间的相互作用。将安装在显微镜上面的照相机与彩色视频打印机和显示器连接。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的控制气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。
d)狗的体内实验第1)种情况将22kg的杂种狗以戊巴比妥麻醉，并进行机械通风。使用中线胸骨切开术打开胸部，除去前面的心包膜，同时在心脏和ATLHDI-3000超声波扫描器的P5-3转导物之间插入一个30mM有散热片的聚硅氧烷橡皮间隔区。通过延迟的EGC触发，将扫描器设置为在每一次心脏收缩结束后扫描一次间歇的短轴图象。注入2mL净体积的微泡(由b)中制备)作为迅速的静脉内大丸剂。3秒钟后，可以看到右心室图象含有造影物质，再过3秒后，左心室也被填充，同时可观察到使左心室的较远部分的图像模糊不清的短暂的弱化作用的影子。当弱化作用影子衰减时，可以看到心肌层明亮度实质上的增加，在左心室的心脏远侧的部分也是这样。
在最初的大丸剂通过之后，将超声波扫描器设置为连续、高读框速率高输出功率图象，此过程能造成超声对照剂气泡在成像组织区域破坏。几秒之后，调整扫描器使其回到初始设置。然后心肌层变暗，并逐渐到达基线值。向新的位置移动图象薄片使对比效应重现，移动薄片回到初始的位置，再一次使组织明亮接近基线。
第2)种情况[对比]
使用与上面相同的成像方法，注射2mL净体积的微泡(与上面b)相同的方式制备(只是制剂中不含脂肽))。心肌回声提高程度远不如第1)情况中观察到的强烈，并且持续时间变短。在左心室减弱期的完成阶段，也观察到心肌对照效应几乎完全消失，没有观察到在第1情况中的左心室较远部分上心肌回声的增加。实施例2-掺入了RGDC-Mal-PEG2000-DSPE和脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))的多特异性含气体的DSPS的微泡本实施例涉及由多肽载体组成的导向微泡的制备。
a)3-马来酰亚胺基丙酰基酰氨基-PEG2000-酰基二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的合成(PE-PEG-MALI)将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)(37.40mg,0.005mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺基-PEG2000-马来酰亚胺、NHS-PEG-MAL(100mg,0.25mmol)和三乙胺(35μl,0.25mmol)溶解于氯仿/甲醇(3∶1)溶液中，室温下搅拌24小时。减压蒸发溶剂之后，剩余物用急骤层析法(氯仿/甲醇，8∶2)纯化。产物为一种白蜡，重92mg(66％)，并用NMR和maldi-MS检验其结构。
b)RGDC的合成使用ABI 433A自动肽合成仪(0.25mmol水平，Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂，(Novabiochem))合成RGDC肽。所有氨基酸使用HBTU预先活化。从树脂中除去粗制的肽，同时在含有5％EDT、5％苯酚和5％水的TFA中去保护。蒸发过量的切割溶液后，沉淀出肽，将肽与二乙醚一起磨碎几次，然后风干。用制备型HPLC纯化粗制的肽，将含有纯化产物的碎片合并，冷冻干燥。使用分析型HPLC和MALDIMS完成最后的鉴定。
c)被磷脂酰丝氨酸包裹而且掺入了RGDC-PEG3400-DSPE和脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))的含气体的多特异性微泡的制备。
称量DSPS(Avanti,5.0mg)，从实施例1a)中制备的脂肽(0.5mg)和由a)部分制备的PE-PEG-MAL(0.5mg)，放入洁净的小瓶中，并加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超声处理混合液3-5分钟，温热至80℃5分钟，然后用4.5微米滤膜过滤。将混合液冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，把微泡离心(1000rpm)3分钟。用1mL PBS(含有1mg肽RGDC,pH调节到8)交换清液(infranatant)。缀合反应进行2小时。在PBS中洗涤气泡，然后用水冲洗，直到未反应的RGDC从清液除去干净为止，用MALDI-MS检测。用库尔特计数器(98％在1和7微米之间)进一步分析微泡。
d)体外结合测定。
在流动条件下，使用在实施例1．c)中所描述的体外测定方法，把微泡结合到内皮细胞上。细胞上微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。在最小流速条件下，不携带载体的控制气泡不附着到与其它细胞分离的内皮细胞上。实施例3-被DSPS、硫醇化的抗-CD62-Mal-PEG2000-PE和硫醇化的抗-ICAM-1-Mal-PEG2000-PE包裹的多特异性含气体的微泡的制备本实施例涉及含有多抗体载体的超声导向微泡的制备。
a)被DSPS和PE-PEG2000-MAL包裹的含气体的微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)和PE-PEG-MAL(0.5mg，由a)部分制备)，放入一个洁净的小瓶，加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟，然后用4.5微米滤膜过滤。将样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，用蒸馏水冲洗微泡三次。
b)抗-CD62和抗-ICAM-1抗体的硫醇化将抗-CD62和抗-ICAM-1抗体各0.3mg溶解在PBS缓冲液中(pH7,0.5mL)，加入Traut试剂，在室温下搅拌1小时。使用NAP-5柱(Pharmacia)从修饰后的蛋白质上分离过量的反应试剂。
c)硫醇化的抗-CD62、抗-ICAM-1抗体和被DSPS和PE-PEG2000-MAL包裹的含气体的微泡的缀合将0.5mL混合的硫醇化的抗体(从b)中制备)加入到一份微泡(从a)中制备)中，在转动台上进行缀合反应30分钟。然后离心5分钟(2000rpm)去除清液。将微泡用水再洗涤三次。
PEG间隔区的长度也可以变化，包括较长的例如PEG3400和PEG3500或较短的例如PEG600或PEG800链。也可以考虑加入第三抗体，例如硫醇化的抗-CD34。实施例4-由多熔素和融合肽(融合肽含有PS结合成分和纤连蛋白肽序列NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I,R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH.)非共价涂布的导向多特异性含气体的DSPS的微泡a)PS结合/纤连蛋白片段融合肽(NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I,R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH.)的合成使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc-Ile-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到302mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对25mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为20-40％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到16mg纯物质(分析型HPLC；梯度，20-50％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV214和260；-产物保留时间=12.4分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2856，实测值为2866。
b)由多熔素和PS结合/纤连蛋白片段融合肽(NH2F.N.F.R.L.K.A.G.O.K.I,R.F.G.G.G.G.W.O.P.P.R.A.I.OH)非共价涂布的DSPS微泡的制备称量DSPS(Avanti,5.0mg)，多聚-L-赖氨酸(Sigma,0.2mg)和肽(0.2mg，从上面a)中制备)，放入一个洁净的小瓶。向小瓶中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。温热至80℃5分钟。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，将微泡离心(1000rpm)3分钟。然后用水、PBS和水充分冲洗，用MALDI-MS检测最后溶液中多聚赖氨酸和肽的浓度。直到最后溶液中检测不到多肽物质为止。加入乙腈(0.5mL)，用超声波破坏微泡，用MALDI质谱分析所得溶液中的多聚赖氨酸和PS结合/纤连蛋白融合肽。结果如下
可以用其它间隔区如PEG2000或者多聚丙氨酸(-AAA-)替代PS结合/纤连蛋白融合肽(-GGG-)内的间隔区元件。也可以考虑使用预定靶间隔区，以便使DSPS结合/纤连蛋白片段融合肽通过纤连蛋白肽的结合先与细胞联系。加入PS微泡，然后与PS结合肽结合。实施例5-被磷脂酰丝氨酸和生物素-PEG3400-丙氨酰-胆固醇包裹的而且被链霉抗生物素蛋白/生物素基-内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)和生物素基-纤维蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能团化的多特异性含气体的微泡本实施例涉及导向超声微泡的制备，其中链霉抗生物素蛋白为生物素酰化的报道物和载体之间的接头a)生物素-PEG3400-β-丙氨酸胆固醇的合成向胆甾醇基-β-丙氨酸盐酸盐(15mg,0.03mmol)的3mL氯仿/湿甲醇溶液中加入三乙胺(42mL,0.03mmol)。混合液在室温下搅拌10分钟，滴加生物素-PEG3400-NHS(100mg,0.03mmol)的1,4-二氧六环溶液(1mL)。在室温下搅拌3小时后，混合物蒸干后，残余物用急骤层析法纯化，得到白色晶体，产量为102mg(89％)。用MALDI-MS和NMR检验其结构。
b)生物素化的内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)的合成使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc-Trp(Boc)-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到75mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对20mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为30-80％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到2mg纯物质(分析型HPLC；梯度，30-80％B(其中B=0.1％TFA/乙腈，A=0.01％TFA/水)；柱-vydac218TP54检测-UV214nm；-产物保留时间=12.6分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为1077-，实测值为1077。
c)生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的合成，使用与上面b)部分中所描述的相同的方法合成和纯化此肽，使用HPLC和MALDIMS鉴定纯化产物。
d)被磷脂酰丝氨酸和生物素-PEG3400-β-丙氨酰-胆固醇包裹的充气多特异性微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)和生物素-PEG3400-β-丙氨酰-胆固醇(0.5mg，由a)部分制备)，放入一个洁净的小瓶中，加入0.8mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热过程中振荡小瓶)。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，转动微泡过夜。将气泡悬液以去离子水洗涤几次，用库尔特计数器和声学衰减进行分析。
e)荧光素标记的链霉抗生物素蛋白和生物素基肽(从b)和c)中制备)的缀合。
向从b)中制备的微泡中加入与荧光素缀合的链霉抗生物素蛋白(0.2mg，溶解于PBS(1mL)中)。室温下，将气泡放置在转动台上3小时。用水充分冲洗并用荧光显微镜分析后，将微泡在1mLPBS(含有生物素基-内皮素-1肽0.5mg)和生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(分别从b)和c)中制备)中温育2小时。充分洗涤微泡以便除去未缀合的肽。实施例6-用于制备带有生物素基-内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)及生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的混合物的链霉抗生物素蛋白‘夹层’的被磷脂酰丝氨酸和生物素化脂肽包裹的多特异性充气微泡a)脂肽二棕榈基-细胞溶素基-色氨酰基-细胞溶素基--细胞溶素基-细胞溶素基(生物素基)-甘氨酸的合成使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc--Ile-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶合之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到150mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对粗提物(40mg等分试样)进行纯化，所用梯度70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到16mg纯化的物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)柱-vydac218TP54检测-UV260和荧光，Ex280,Em350产物保留时间=22分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为1487，实测值，为1471。
b)掺入了a)部分中的生物素化脂肽序列的含气体的DSPS微泡的制备。
称量DSPS(Avanti,4.5mg)和从a)中制备的脂肽(0.5mg)，分别放入2个小瓶，每个小瓶加入0.8mL 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，转动微泡过夜。将气泡以去离子水洗涤一段时间，用库尔特计数器和声学衰减进行分析。如实施例1b)所述，用MALDI质谱分析确认其已掺入DSPS微泡中。
c)被磷脂酰丝氨酸和生物素基脂肽包裹的而且被链霉抗生物素蛋白(streptavidin)/生物素基-内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)和生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能团化的多特异性含气体的微泡的制备。
用实施例5e)中所描述的相似的方法处理从b)中制备的微泡。实施例7-用于制备带有生物素基-内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH)及生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的混合物的链霉抗生物素蛋白‘夹层’的被磷脂酰丝氨酸和生物素-DPPE包裹的多特异性充气微泡a)包含生物素的微泡的制备。
将磷脂酰丝氨酸(Avanti,5mg)和生物素-DPPE(0.6mg,Pierce)的混合物放入一洁净的小瓶中，加入1mL5％丙二醇-甘油水溶液。将这种分散体温热至80℃5分钟，然后冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，离心后，去除清液，用水充分冲洗形成的微泡。
b)被磷脂酰丝氨酸和生物素-DPPE包裹的充气微泡与链霉抗生物素蛋白及与生物素基-内皮素-1肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-ILe-Trp.OH)和生物素基-纤维蛋白-抗聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的混合物的缀合按照实施例5e)中详细描述的方法进行。实施例8-由磷脂酰丝氨酸、链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG-DSPE及生物素酰人内皮IgG抗体和生物素酰运铁蛋白的混合物包裹的多特异性充气微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成使用琥珀酸酸酐将NH2-PEG3400-DSPE羟基化，例如通过Nayar,R和Schroit,A.J.所描述的相同的方法(见“生物化学”(1985)24,5967-71)。
b)被磷脂酰丝氨酸和succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备向磷脂酰丝氨酸(90-99.9mol％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入1mL5％丙二醇-甘油水溶液。将这种分散体在不超过80℃的情况下加热5分钟，然后冷却至室温。将0.8mL分散体转移到1mL的小瓶中，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，然后将样品放到转动台上。离心后，用水交换清液，重复冲洗。
c)将链霉抗生物素蛋白偶合到被磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡上使用水溶性碳二亚胺通过标准结合方法将链霉抗生物素蛋白共价结合到膜中的Succ-PEG3400-DSPE上。在反应期间，将样品放置在转动台上。离心后，用水置换清液，重复冲洗。通过与下列物质结合来分析附着的链霉抗生物素蛋白的官能度，所说的物质例如荧光标记的生物素、生物素酰化的抗体(用荧光标记的二抗检测)或生物素酰化的和荧光性-或放射性-标记的寡核苷酸。用荧光显微术或者闪烁计数进行分析。
d)被磷脂酰丝氨酸和链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE(被生物素酰人运铁蛋白和人内皮IgG抗体非共价地官能团化)包裹的多特异性充气微泡的制备将c)中制备的微泡在含有人运铁蛋白和人内皮IgG抗体(用Bayeretal.,Meth.Enzymol.,62,308中所描述的方法生物素酰化)的溶液中温育。用上面描述的方法冲洗被载体涂布的微泡。实施例9-被磷脂酰丝氨酸/链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG-DSPE、寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG、生物素-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT包裹的多特异性充气微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成如实施例8a)中的描述进行。
b)被磷脂酰丝氨酸/链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备如实施例8b)中的描述进行。
c)链霉抗生物素蛋白与被磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的偶合如实施例8c)中的描述进行。
d)被磷脂酰丝氨酸/链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE、寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG、生物素-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT包裹的多特异性充气微泡的制备将c)中制备的微泡在含有生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG与生物素-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT的混合溶液中温育。用上面描述的方法冲洗被寡核苷酸涂布的微泡。例如可以使用荧光标记的附着于气泡上的寡核苷酸，或者通过将附着寡核苷酸与标记的(荧光或放射性)互补寡核苷酸杂交来检测寡核苷酸与气泡的结合。例如通过将气泡与含有附着寡核苷酸互补序列的-DNA杂交来分析携带寡核苷酸的微泡的官能度。
其它有用的实例包括使用与核糖体DNA(其中每个单倍体基因组有许多个拷贝)互补的寡核苷酸和与致癌基因(例如其中的ras，每个单倍体基因组有一个拷贝)互补的寡核苷酸。实施例10-被磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺(与纤连蛋白和运铁蛋白共价地官能团化)包裹的多特异性充气微泡a)称量DSPS(Avanti,4.5mg)和DSPE(Avanti,1.0mg)，放入一个洁净的小瓶，加入1mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟。然后用4.5微米的滤膜过滤。将样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，以蒸馏水洗涤气泡两次，然后将其悬浮于pH9的0.1M硼酸纳缓冲液中b)纤连蛋白/运铁蛋白的修饰。
将纤连蛋白(0.5mg)和运铁蛋白(1.3mg)混合在PBS中，加入含有溶解在DMSO中的NSH-氢化荧光素。将混合液在室温下搅拌1小时，然后在Superdex200柱上纯化蛋白。将磷酸缓冲液(pH7.5)中的被荧光素-标记的蛋白质混合物冷冻干燥。
c)微泡的修饰，将b)中冷冻干燥的产物重新溶解于0.5mL水中，向荧光素标记的纤连蛋白/运铁蛋白混合物中加入0.1mmol的交联剂SDB(Pierce)。将溶液在冰中温育2小时，并在NAP-5柱上装料，用PBS洗脱。向此溶液中加入从a)中制备的微泡悬液1mL，放在转动台上，在室温下温育2小时。通过将微泡浮于缓冲液上，用水替换缓冲液的方法去除未反应的物质，这一过程重复3次。实施例11-与寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和内皮素-1肽生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-.OH缀合的在聚合物壁上掺合了抗生物素蛋白的多特异性中空聚合物颗粒的制备本实施例涉及含有多个载体(为导向/治疗的应用而附着到非表面活性剂上)的聚合超声造影剂的制备。
a)在聚合物壁上掺合了抗生物素蛋白的聚合物颗粒的制备通过一种涉及水包油乳化剂冷冻干燥的方法来制备含有抗生物素蛋白的P73的中空聚合物微粒(如专利WO96/07434中描述的)，具体过程如下将0.25g可被生物降解的P73聚合物[聚(亚乙基-双(16-羟基棕榈酸)共(己二酸))溶解于5mL的60℃的莰烯中，制得一种油性溶液。向0.2mL所说的油性溶液中加入2mg的抗生物素蛋白。将0.4g聚合物α-(16-十六烷酰基(hexadecanoyl)氧十六烷)-w-甲氧基聚氧化乙烯酯溶解于60℃的20mL水中，制得一种水溶性溶液。将所说的油性溶液(0.2mL)和水溶性溶液(0.8mL)混合，放在振动混合器(Capmix)上振荡15秒，形成水包油乳化剂。将乳化剂放在干冰和甲醇中冷冻，然后在200mTorr的压力下干燥24小时，除去过量的溶剂。通过加入1.0mL水使粉沫成为中空颗粒的悬液。通过显微观察、库尔特粒度分布、声学弱化作用、以及对外部压力的抗性作用来鉴定最后得到的超声造影剂。
b)生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-.OH的制备如实施例5b)中描述进行。
c)掺合有抗生物素蛋白的聚合物颗粒的缀合。
将a)中制备的颗粒离心，用1mL含有上文b)中制备的0.2mg生物素-GGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTT和0.2mg生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-.OH)的PBS缓冲液(pH7.5)替换上清液，温育24小时后，用PBS和水充分冲洗颗粒。实施例12生物素对充气白蛋白微球(GAM)的官能团化，以便进行多特异性导向a)生物素酰白蛋白微球的制备使用GAM(6×108个颗粒/mL)的5mg/mL白蛋白的均相悬液，所有的操作均在室温下进行。将两个10ml的等分试样离心(170×g,5分钟)，以促进微球的漂浮，小心地吸去8ml位于下面的清液，用等量的空气饱和的磷酸缓冲盐溶液替换，旋转15-20分钟，使微球重新悬浮。重复两次，直到游离的与非微球结合的白蛋白的量可以忽略不计。向其中的一个等分试样中加入50μl的NHS-生物素(用DMSO溶解，10Mm)，最终浓度为50μm；向另一个等分试样(对照)中加入50μM的DMSO。将含有样品的试管旋转1小时，然后向每一个试管中加入20μM50％的戊二醛水溶液，使微球交联。再旋转1小时后，将试管垂直放置过夜，使微球漂浮。第二天，用含有1mg/mL人血清白蛋白(PBS/HAS)的磷酸缓冲盐溶液冲洗悬液两次，最后离心后，重新悬浮于PBS/HAS中。
为了鉴定结合微球的生物素的存在，向两种悬液中加入与辣根过氧化物酶(strep-HRP)缀合的链霉抗生物素蛋白，旋转试管1小时，使其反应。然后冲洗微球三次，重新悬浮于100mM的柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH5，含有0.1mg/m苯二胺二盐酸盐和0.01％过氧化氢)中，旋转10分钟。出现黄绿色表明酶的存在。获得的结果如下
这证明GAM已被生物素酰化。
b)多特异性含气体的微粒采用与实施例5)、6)和7)相似的方法，使用生物素酰化的微球制备多特异性的导向产物。实施例13-由肝素硫酸酯结合肽/纤连蛋白肽/RGD肽荧光素官能团化的多特异性含气体的DSPS微泡
a)含有RGD序列和荧光素报道基团二棕榈酰基-Lys-Lys-Lys-Lys[次乙基-Arg-Gly-Asp-Lys(荧光素)]Gly.OH的脂肽的合成
使用市售的氨基酸和聚合物如实施例1的描述合成脂肽。从位于含有5％水、5％苯酚和5％EDT的TFA中的树脂上切割脂肽2小时。真空蒸发后，沉淀出粗提物，并用二乙基醚研碎。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对40mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为60-100％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到10mg纯物质(分析型HPLC；梯度，60-100％B(其中B=0.1％TFA/乙腈，A=0.01％TFA/水)；柱-vydac218TP54检测-UV260；-产物保留时间=20-22分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为1922，实测值为1920。
b)包含肝素硫酸酯结合序列和纤连蛋白肽的脂肽的合成如实施例1a)的描述进行合成和纯化。
c)由肝素硫酸酯结合肽、纤连蛋白肽、次乙基-RGD和荧光素官能团化的多特异性含气体的DSPS微泡的合成。
称量DSPS(Avanti,4.5mg)和a)中合成的脂肽(0.5mg,0.2mmol)和b)中合成的脂肽(0.5mg)，分别放入2个小瓶中，向每个小瓶加入1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，转动微泡过夜。以去离子水洗涤气泡几次，并通过MALDI质谱如实施例1b)的描述进行分析。显微分析后，看到微泡的大小范围为1-5微米。此外，这些微泡是有荧光的。实施例14．由CD71 FITC-标记的抗运铁蛋白受体抗体共价修饰的并掺入对内皮细胞具有亲和性的脂肽的多特异性含气体的DSPS微泡本实施例涉及多重载体导向超声试剂的制备。
a)内皮细胞结合脂肽2-n-十六烷基硬脂酰基-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2的合成。
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Rink酰胺树脂起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成如下的脂肽。
所有氨基酸与2-n-十六烷基硬脂酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％EDT和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到150mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对40mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为90-00％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经50分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到10mg纯物质(分析型HPLC；梯度，90-100％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV214nm，产物保留时间=23分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2369，实测值为2373。
b)掺入内皮细胞结合脂肽和PE-PEG200-MAL的含气体的DSPS微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)和a)中合成的脂肽(0.5mg,0.2mmol)以及实施例2的PE-PEG200-马来酰亚胺(0.5mg)，放入一个洁净的小瓶中，同时向小瓶中加入1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟，然后经4.5微米的滤膜过滤。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，并以去离子水洗涤气泡几次。
c)FITC-标记的抗运铁蛋白受体抗体的硫醇盐化室温下，用Traut试剂(0.9mg,Pierce)修饰0.7ml FITC标记的CD71抗运铁蛋白受体Ab(100mg/mL)的PBS溶液1小时。在NAP-5柱(Pharmacia)上将过量的试剂从修饰的蛋白质中除去。
d)将硫醇化的FITC-标记的抗运铁蛋白受体抗体缀合到掺入了内皮细胞结合脂肽和DSPE-PEG2000-MAL的含气体的DSPS微泡上向b)步骤制备的微泡中加入上面c)步骤制备的0.5mL蛋白质组分(总共2mL)的等分试样，使缀合反应在转台上处理10分钟。在1000rpm下离心3分钟后，除去蛋白质溶液，然后分别用1mL和0.5mL蛋白质溶液的等分试样重复进行缀合反应两次。用蒸馏水冲洗气泡四次，用流式细胞术和显微术分析样品中抗体的存在。可以观察到荧光群体＞92％。
阴性对照的DSPS微泡(左边曲线)与缀合了CD71 FITC-标记的抗运铁蛋白抗体(被填充的曲线，右边)的流式细胞术的比较，表明群体荧光为92％。
使用实施例1b)中所描述的方法，通过MALDI质谱，证实脂肽掺合进微泡。实施例15用于导向超声造影的由运铁蛋白/抗生物素蛋白涂布的多特异性含气体的微泡的制备本实施例涉及用于导向超声/治疗的含有多种蛋白质载体的微泡的制备。
a)巯基官能团化的脂分子二棕榈酰-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH的合成
使用1mmol氨基酸药筒，在0.25mmol水平上从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成具有以上结构的脂。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU偶联化学方法预先活化。使用含有5％EDT、和5％H2O的TFA将侧链保护基脱保护，同时从树脂上除去肽，进行2小时后得到250mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对40mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为90-100％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经50分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到24mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中B=0.1％TFA/乙腈，A=0.01％TFA/水)；柱-vydac218TP54检测-UV214nm-产物保留时间=23分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为1096，实测值为1099。
b)含气体并且掺入了包含巯基的脂结构的DSPS微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)和上面a)步骤中合成的脂结构(0.5mg)，放入一个洁净的小瓶中，加入0.8mL含有1.4％丙二醇/2.4％甘油的水溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)，然后用40微米的滤膜热过滤。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒，将微泡放在转台上过夜。以去离子水洗涤气泡几次，用Ellmans试剂分析巯基的掺合。
c)用荧光素-NHS和磺基-SMPB修饰运铁蛋白和抗生物素蛋白向溶于PBS(1mL)中的运铁蛋白(2mg,Holo，人类，Alpha治疗公司)和抗生物素蛋白(2mg,Sigma)的混合液中加入0.5mL含有1mg磺基-SMPB(Pierce)和0.5mg荧光素-NHS(Pieree)的DMSO溶液。在室温下搅拌混合液45分钟，然后以PBS为洗脱液，将混合液通过葡聚糖凝胶200柱。收集蛋白质组分，使用前贮藏在4℃下。
d)微泡与修饰后的运铁蛋白/抗生物素蛋白的缀合向步骤b)制备的含有巯基的微泡中加入1mL修饰的运铁蛋白/抗生物素蛋白的溶液。将溶液的pH调整到9后，在室温下，缀合反应进行2小时。用去离子水充分冲洗微泡，然后用库尔特计数器(81％在1到7微米之间)和荧光显微术(可以观察到高度的荧光微泡)分析微泡。实施例16用于导向超声造影的含气体的官能团化的微泡的制备本实施例涉及具有用于非特异性导向的表面反应基团(主要用二硫化物交换反应实现将其结合到多种细胞靶上)的微泡的制备。
称量DSPS(Avanti,5.0mg)和实施例15a)步骤中合成的含有硫醇的脂结构(1.0mg)，放入一个洁净的小瓶，加入0.8mL含有1.4％丙二醇/2.4％甘油的水溶液。混合液在NHS80℃温热5分钟(在温热期间振荡小瓶)，然后用40微米的滤膜热过滤。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)。小瓶在加帽混合器(capmixer)中振荡45秒，将微泡放在转台上过夜。以去离子水洗涤气泡几次，用Ellmans试剂分析硫醇的掺合。实施例17包含用于内皮细胞导向的脂肽和含有甲巯丙脯酸的分子的多特异性含气体的DSPS微泡本实施例涉及用于导向及治疗应用的超声试剂的制备。
a)甲巯丙脯酸官能团化的脂肽的合成
在0.125mmol水平上，从Fmoc保护的Rink酰胺MBHA树脂(Novabiochem)起始，使用手动氮气气泡装置合成具有以上结构的物质。所有氨基酸从Novabiochem购买，棕榈酸从Fluka购买。使用标准TBTU/HOBt/DIEA程序进行偶联。使用DIC预先活化，通过赖氨酸侧链，将溴乙酸偶联为一个对称的酸酐。使用DBU作为基质，将溶于DMF的甲巯丙脯酸(Sigma)引入到固相上。使用含有5％EDT、5％H2O和5％乙甲基硫化物的TFA，同时进行从树脂上除去肽和侧链保护基的脱保护，进行2小时。使用制备型液相色谱(Vydac218TP1022柱)对粗提物的10mg等分试样进行纯化，所用梯度为70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经60分钟，流速为10mL/分钟。冷冻干燥后，得到2mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经过20分钟；流速为1mL/分钟；柱-vydac218TP54检测UV214nm；保留时间=26分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；M+H的实测值与预测值都为1265。
b)对内皮细胞具有亲和性的脂肽二棕榈酰基-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH2的合成
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Rink酰胺树脂(NoVabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成所说的脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU偶联化学方法预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、和5％H2O的TFA从树脂上同时除去侧链保护基上和肽，进行2小时后得到160mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对35mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到20mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV214和260nm-产物保留时间=16分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2050，实测值为2055。
c)含有用于内皮细胞导向的脂肽和用于药物传递的含甲巯丙脯酸的分子的含气体的DSPS微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)、a)步骤中合成的产物(0.5mg)和b)步骤中合成的产物(0.5mg)，放入小瓶中，向每个小瓶加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(headspace)。小瓶先在加帽混合器(cap mixer)中振荡45秒，然后转动1小时，再用去离子水充分洗涤。直到最后的洗涤溶液中用MALDI质谱检测不到开始的物质为止。用MALDI质谱分析确认a)和b)中合成的产物掺合进微泡的程度(方法如实施例b)中所描述的)。
d)包含用于内皮细胞导向的脂肽和用于治疗应用的含甲巯丙脯酸的分子的含气体的DSPS微泡的体外研究使用实施例1c)中所描述的体外测定方法，检查在流动条件下细胞的结合。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。
实施例18填充了包含对细胞膜具有亲和性的螺旋肽和肽抗生素多粘菌素B硫酸酯的脂肽的多特异性含气体的DSPS微泡的制备本实施例涉及包含具有导向和治疗应用的多肽载体的导向微泡的制备。
a)包含对细胞膜具有亲和性的螺旋肽的脂肽十六烷基硬脂酰-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2的合成如实施例14的描述。
b)多特异性含气体的微泡的制备称量DSPS(Avanti,5.0mg)、a)步骤合成的脂肽(0.3mg)和多粘菌素B硫酸酯(Sigma,0.5mg)，放入一个洁净的小瓶，加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理3-5分钟，温热至80℃5分钟，然后用4.5微米的滤膜过滤。混合液冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)。小瓶在加帽混合器(cap mixer)中振荡45秒，微泡在1000rpm下离心3分钟。用水洗涤微泡，直到用MALDI质谱检测不到清液中的多粘菌素B硫酸酯或脂肽为止。显微观察表明，气泡群体大小的分布正如所需的，在1-8微米之间。向洗涤后的气泡(大约0.2mL)中加入甲醇(0.5mL)，将混合液进行声波浴处理2分钟。用MALDI质谱分析最后得到的澄清溶液，发现其含有脂肽和多粘菌素B硫酸酯(预测值1203，实测值1207)。实施例19掺入了包含IL-1受体结合序列的脂肽并由含药物氨甲蝶呤的分支结构修饰的DSPS的多特异性含气体的微泡的制备本实施例涉及含有用于导向/治疗/药物释放应用的多载体的导向微泡的制备。
a)含有白介素-1受体结合肽的脂肽(二棕榈酰基-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala.OH)的合成
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc-Ala-Wang树脂(Novabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕榈酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％H2O、5％苯甲醚、5％苯酚和5％EDT的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到150mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对30mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为90-100％B(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到4mg纯物质(分析型HPLC；梯度，90-100％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV214nm；产物保留时间=23分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2083，实测值为2088。
b)含有巯基部分的分支氨甲蝶呤核心结构的合成
在0.1mmol水平上从Fmoc-Cyt(Trt)Tentagel树脂起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成氨甲蝶呤结构。使用含有5％EDT和5％H2O的TFA同时进行从树脂上除去肽和保护基的脱保护，进行2小时后得到160mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对30mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为10-30％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到9mg纯物质(分析型HPLC；梯度，5-50％B(其中B=0.1％TFA/乙腈，A=0.01％TFA/水)；柱-vydac 218TP54检测-UV214nm；产物保留时间=9.5分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为1523，实测值为1523。
c)-多特异性含气体的微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)、硫醇(含有实施例15a)中合成的脂肽)(0.5mg)和上面a)步骤中合成的脂肽(0.2mg)，放入一个洁净的小瓶，加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理3-5分钟，温热至80℃5分钟，然后用4.5微米的滤膜过滤。混合液冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)。小瓶在加帽混合器(cap mixer)中振荡45秒，将微泡在1000rpm下离心3分钟，接着弃去清液。
d)将氨甲蝶呤的分支结构缀合到硫醇化的微泡上将上面b)中制备的氨甲蝶呤(0.5mg)溶于pH为8的PBS溶液中。然后将溶液加入到含有c)步骤制备的微泡的硫醇中，使二硫键的形成进行16小时。然后用PBS和水充分冲洗，用显微术和MALDI质谱进行分析。
也应该考虑到这样的相关过程，即将氨甲蝶呤结构连接到微泡上的二硫键在体内可能会被还原，释放自由药物分子。这一过程与肿瘤特异性载体结合形成一个药物传递系统。在生理条件下，有关的还原剂(例如谷胱甘肽)可以用于引起药物的释放。实施例20)由复合到质粒pBR322的荧光标记DNA片段上的多聚-L-赖氨酸涂布的微泡的制备本实施例涉及用于基因疗法/反义应用的微泡的制备。本实施例设想通过将脂结构修饰的载体掺入到微泡膜(如实施例1中所描述的)中来实现特异性导向。
a)含气体的DSPS微泡的制备称量DSPS(Avanti,4.5mg)，放入一个洁净的小瓶，加入1.0mL含有1.4％丙二醇/2.4％甘油的溶液。混合液用超声波处理2分钟，然后温热至80℃5分钟。接着立即用4微米的滤膜热过滤。样品冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在加帽混合器中振荡45秒。以去离子水洗涤气泡一次，弃去清液。然后将微泡悬浮于0.5mL水中。
b)制备多聚-L-赖氨酸/DNA复合体并填充DSPS微泡向含有1mg多聚-L-赖氨酸(70-150 kD)的洁净的小瓶中加入0.1mL荧光素标记的溶于TE缓冲液(10mM tris-HCl pH8)中的质粒pBR322(Biorad)的消化液。向溶液中加入水，使其总体积达到0.6mL，调整pH到8。反应进行1小时，然后向a)步骤中制备的微泡悬液中加入0.05ml多熔素-DNA。1小时后，用显微镜观察表明气泡有荧光，确证了DNA的存在。实施例21)含有包含dabsylated-动脉粥样硬化血小板结合序列和RGDS的分支核心肽的多特异性充气微泡的制备本实施例涉及在表面具有硫醇基团(此硫醇基团是用于修饰含有硫醇的并用于导向/药物传递和药物释放的载体)的微泡的制备。
a)分支肽Dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-leu-Lys-Lys(NH2-Arg-Gly-Cys.OH的合成
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel树脂起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成所说的肽。所有氨基酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到160mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对30mg粗提物的等分试样进行纯化，所用梯度为10-60％B(A=0.1％TFA/水，B=乙腈)，经40分钟，流速为9mL/分钟。冷冻干燥后，得到2.5mg纯物质(分析型HPLC；梯度，10-50％B(其中B=MeOH,A=0.01％TFA/水)，经20分钟；柱-vydac 218TP54检测-UV214和435nm-产物保留时间=21分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；预测值M+H为2070，实测值为2073。
b)含有巯基的充气微泡的制备。
所用方法如实施例15a)和b)中所描述。
c)通过二硫键的形成将巯基化的微泡与多特异性的肽氧化偶联弃去上面b)步骤中制备的微泡的清液，用溶于0.7ml稀氨水溶液(pH8)中的a)步骤中制备dabsyl-肽(1mg)溶液替换。向此溶液中加入0.2ml氰酸钾铁母液(2ml水中含有6mg氰酸钾铁)。将小瓶放在转台上，使巯基氧化反应进行2小时。用去离子水充分冲洗微泡，直到通过HPLC和MALDI质谱检测发现infratant不含dabsyl-肽为止。使用水溶性还原剂tris-(2-羧乙基)-磷化氢，通过还原二硫键检测微泡结合肽。还原后，通过HPLC和MALDI质谱检测，发现清液含有游离的dabsyl肽。
也可以考虑使用其它有关的生理还原剂(例如还原的谷光甘肽)引起释放。实施例22-包含亚乙基双(16-羟基棕榈酸酯)、己二酰氯化物聚合形成的聚合物及共价结合到此聚合物上的生物素-酰氨基己酸盐-丙氨酸的含气体的微泡a)Z-丙氨酸-聚合物(3-O-(苄氧羰基-L-丙氨酰)-聚合物)的合成如WO-A-9607434中描述的方法由亚乙基双(16-羟基棕榈酸酯)和己二酰氯化物制备所说的聚合物，使用凝胶渗透层析(GPC)纯化分子量为10000的聚合物组分。将10g的此物质(相当于1mmol的OH基团)、Z-丙氨酸(5mmol)和二甲胺吡啶(4mmol)溶于干燥的二甲基甲酰胺/四氢呋喃中，并向其中加入二环己基碳二亚胺。在室温下，搅拌反应混合液过夜。过滤除去二环己脲，使用旋转蒸发方法除去溶剂。使用层析方法纯化产物，将含有所需化合物的组分合并，并使用旋转蒸发除去溶剂。用NMR确定产物的结构。
b)丙氨酸-聚合物(3-O-(L-丙氨酰)-聚合物)的合成将Z-丙氨酸-聚合物(0.1mmol)在甲苯/四氢呋喃和冰乙酸(占总体积的15％)中搅拌，并在具有5％钯的木炭上氢化2小时。过滤反应混合物，在真空条件下浓缩。
c)生物素己酸胺-丙氨酸-聚合物的合成将溶于四氢呋喃的生物素己酸胺N-羟基琥珀酰亚胺酯的溶液加入到溶解于由四氢呋喃、二甲基甲酰胺和0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)构成的混合液的H2N-丙氨酸-聚合物中。将反应混合液加热到30℃，不停地搅拌；反应后进行薄层层析(TLC)。蒸发溶剂，在不经进一步纯化的条件下使用粗产物。
d)由生物素己酸胺-丙氨酸-聚合物和PEG 10000甲基醚16-十六酰氧十六酸酯组成的含气体的微粒将溶于(-)-莰烯(维持在60℃C)的10mL5％w/w的生物素-己酸胺-丙氨酸-聚合物溶液加入到相同温度的30mL1％w/w的PEG10000甲基醚16-十六酰氧十六酸酯(按照WO-A-9607434描述的方法制备的)的水溶液中。使用转子定子混合器(Rotor stator mixer)，在低速下将混合液乳化几分钟，然后在干冰/甲醇浴中冰冻，冷冻干燥48小时，得到所需产物白色粉末。
e)产物的声学鉴定和显微观察使用光学显微镜如WO-A-9607434描述的方法进一步验证微粒的性质。使用3.5MHz宽带转换器的超声透射测量表明，＜2mg/mL的微粒悬浮体具有至少5dB/cm的声音束衰减作用。
f)多特异性微粒使用生物素酰化的微球体制备类似于实施例5)、6)和7)中列举的多特异性导向产物实施例23-由DSPS和生物素-PEG3400-酰基-磷脂酰乙醇胺包裹的、并由链霉抗生物素蛋白和寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG官能团化的、由纤维蛋白-抗-聚合体肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)生物素酰化的多特异性充气微泡的制备a)生物素-PEG3400-酰基-磷脂酰乙醇胺的合成将二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(21.00mg,0.03mmol)、生物素-PEG-CO2-NHS(100mg,0.03mmol)和三乙胺(42ul,0.03mmol)混合，溶解在氯仿/甲醇(3∶1)溶液中，在室温下搅拌2小时。减压蒸发溶剂后，用闪烁色谱分析(亚甲基氯/甲醇/水，40∶8∶1)。获得的产物为一黄色树胶，112mg(94％)，用NMR和MALDI-MS检验其结构。
b)将缀合有荧光素的链霉抗生物素蛋白结合到气体填充的微泡上如实施例5a)描述的方法，通过将DSPS与生物素-PEG3400-酰基-磷脂酰乙醇胺混合，制备含气体的微泡。将微泡悬液分成0.2ml的等分试样，如下表所示加入缀合有荧光素的链霉抗生物素蛋白。在室温下将样品放在转台上温育15或30分钟，然后通过PBS洗涤除去过量的蛋白质。结果
使用流式细胞术和库尔特计数器分析样品。上表总结了所得的结果。
c)链霉抗生物素蛋白涂布的微泡与寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和生物素酰化的纤维蛋白-抗-聚合体肽生物素-GPRPPERHOS的缀合取上面6号等分试样中的粒子离心，用含有0.2mg生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和0.2mg生物素-GPRPPERHOS(实施例5c)的1ml PBS缓冲液(pH7.5)替换其上清液。温育24小时后，用PBS和水充分洗涤制备的粒子。
可以想象，使用这种方法，也可以将其它生物素酰化的载体或者治疗试剂缀合到链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白涂布的微泡上。实施例24)由DSPS包裹的、由导向血栓的脂肽和溶血栓素酶组织纤溶酶原激活剂官能团化的微泡的制备本实施例涉及由治疗性的溶栓剂组成的血栓导向US剂的制备。
a)对血栓具有亲和性的脂肽(二棕榈酰基-Lys-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)的合成
使用1mmol氨基酸药筒，在0.1mmol水平上从Rink酰胺树脂(Novabiochem)起始，通过ABI 433A自动肽合成仪合成脂肽。所有氨基酸与棕桐酸在偶联之前使用HBTU预先活化。使用含有5％苯酚、5％EDT、5％苯甲醚和5％H2O的TFA从树脂上同时除去肽和侧链保护基，进行2小时后得到80mg的粗产物。使用制备型HPLC(Vydac218TP1022柱)对20mg粗提物的等分试样进行纯化。冷冻干燥后，得到6mg纯物质。使用MALDI质谱和分析型HPLC进一步鉴定产物。
b)用磺基-SMPB修饰组织纤溶酶原激活剂向含有0.1mg t-PA(Sigma)的碳酸铵缓冲液(0.1ml)中加入水，使其达到0.2mL。向此溶液中加入0.4mg溶解于0.05mL DMSO的磺基-SMPB(Pierce)。在室温下将蛋白质溶液左倾放置45分钟，然后用Superdex 200柱进行纯化。用PBS洗涤所得的产物，收集修饰后的蛋白质组分。
c)由DSPS/血栓-结合脂肽和含有硫醇的脂肽包裹的微泡的制备及将其缀合到修饰的组织纤溶酶原激活剂上称量DSPS(Avanti,5.0mg)、a)部分制备的脂肽(0.5mg)和实施例15a)中制备的含有硫醇的脂肽(0.5mg)，放入一个洁净的小瓶中。向此溶液中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液，超声处理混合液2分钟，在80℃下温热5分钟，然后立即用4微米滤膜热过滤。将混合液冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。将小瓶在加帽混合器中振荡45秒，以去离子水洗涤微泡2次。弃去清液，用上面b)中制备的1mL蛋白质溶液置换。使缀合反应进行1小时。将微泡离心，用1mL的蛋白质溶液进一步置换清液。反复进行温育，直到所用蛋白质溶液用完为止。然后用水充分冲洗微泡，用库尔特计数器分析。通过实施例1c)中描述的方法，使用流室分析方法检测微泡。发现蛋白质修饰的微泡比含有脂肽/DSPS或只含有DSPS的微泡结合的数量更高。
可以想象，通过体内体外血栓形成模型可以评价这些微泡的导向/治疗/超声活性。实施例25-由DSPS、用于导向的脂肽(包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI))和用于治疗应用的脂肽(含有氨酰心安)包裹的多特异性充气PFB微泡a)包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的合成。
合成和纯化方法如实施例1a)中的描述。
b)适用于固相偶联的受保护的氨酰心安衍生物的合成ⅰ)4-[(2.3-环氧)丙氧基]苯乙酸甲酯的合成将4-羟基苯乙酸甲酯(4.98g,0.01mol)、环氧氯丙烷(23.5ml,0.30mol)和吡啶(121μl,1.5mmol)混合，在85℃下搅拌2小时。冷却反应混合液，蒸馏除去过量的环氧氯丙烷(旋转蒸发仪)。残余物用乙酸乙酯提取，用盐水和干燥Na2SO4洗涤。将溶液过滤浓缩，将黑色的残余物层析(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)，得到2.25g(34％)的无色油状物，其结构与1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)的波谱相一致。
ⅱ)4-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]-丙氧基]苯乙酸甲酯的合成在室温下，将4-[(2,3-环氧)]-丙氧基]苯乙酸甲酯(2.00g,9.00mmol)、异丙胺(23ml,0.27mol)和水(1.35ml,74.7mmol)混合，搅拌过夜。将反应混合液浓缩(旋转蒸发仪)，将油状残余物溶于氯仿和无水Na2SO4中。过滤并浓缩得到一定量的黄色油状产物，这些油状产物不经进一步纯化即可用于下一步反应。用1H和13C NMR分析检验其结构。
ⅲ)4-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]-丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成将溶于6M盐酸(15ml)的4-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]-丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg,2.00mmol)在100℃下加热4小时。将反应混合液浓缩(旋转蒸发仪)，将残余物用水提取，然后冷冻干燥。其结构与1H和13C的NMR波谱相一致。MADI质谱的实测值M+H为268(与预测值相同)。
ⅳ)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]-丙氧基]苯乙酸的合成将4-[2-羟基-3-[(1-甲基乙基)氨基]-丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)溶于水，将此溶液加入到溶于水/二氧六环(2∶1,15ml)的碳酸氢钠(0.60g,7.2mmol)溶液中。加入溶于二氧六环(5ml)的二-叔-丁基-碳酸氢钠(0.48g,2.2mmol)溶液。通过TLC分析(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)监测反应进程。直到转化彻底完成时才加入二-叔-丁基-碳酸氢钠成分。将反应混合液倒入饱和的硫酸氢钾水溶液中，有机物质经萃取进入乙酸乙酯中。用水、盐水和无水Na2SO4洗涤有机相，过滤后得到0.6g粗提物质。用层析(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)纯化产物。将溶液浓缩，剩余物用冰醋酸提取，冷冻干燥后得到415mg(56％)的白色固体产物。用1H和13C NMR分析鉴定其结构。
c)由氨酰心安官能团化的脂肽的合成
在0.125mmol水平上，从Fmoc保护的Rink酰胺MBHA树脂(Novabiochem)起始，使用手动氮气气泡装置合成具有以上结构的物质，所用的氨基酸从Novabiochem购买，棕榈酸从Fluka购买，化合物由a)步骤中制备。使用标准TBTU/HOBt/DIEA程序进行偶联。使用含有5％EDT和5％H2O的TFA，从树脂上除去肽同时使侧链保护基脱保护，进行2小时。将粗提物从乙醚中沉淀出来，使用制备液相色谱(Vydac218TP1022柱)对粗提物进行纯化，所用梯度为70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经60分钟，流速为10mL/分钟。冷冻干燥后，得到38mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经过20分钟；流速为1mL/分钟；柱-vydac 218TP54检测UV214nm；产物保留时间=25分钟)。使用MALDI质谱(ACH matris)进一步鉴定产物；M+H的实测值为1258，预测值为1257。
d)包含肝素硫酸酯结合肽(KRKR)与纤连蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽和含氨酰心安的脂肽的DSPS充气微泡的制备向小瓶中由DSPS(Avanti,5.0mg)、a)中合成的产物(0.5mg)和c)中合成的产物(0.5mg)组成的混合物中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。将溶液过滤冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)，小瓶先在加帽混合器(cap mixer)中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。用MALDI质谱分析确认含氨酰心安的脂肽已掺合进气泡的程度(方法如实施例1b)中的描述)。
e)多特异性充气微泡的体外研究如实施例1c)中描述的方法，进行微泡悬液的体外分析。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速条件下从细胞中消失。实施例26)含有用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的胆甾醇基酯的PFB充气DSPS微泡本实施例涉及内皮细胞多种细胞受体的非特异性修饰。
a)4-[4-双(2-氯乙基)氨基]-苯基]丁酸胆甾醇酯的合成将DIC(170μl,1.10mmol)加入到溶于无水二氯甲烷(15ml)的苯丁酸氮芥(Sigma,669mg,2.20mmol)溶液中。将混合液在室温下搅拌0.5小时，然后将其加入到胆固醇(Aldrich,387mg,1.00mmol)和DMAP(122mg,1.00mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中。搅拌反应混合液过夜，然后将其倒入5％的碳酸氢钠溶液中。将各相分离，用盐水和无水MgSO4洗涤有机相。将溶液过滤浓缩，用柱层析(二氧化硅，氯仿)纯化产物，得到560mg(83％)无色的油状物。用MALDI质谱鉴定，M+H实测值为674(与预测值相同)。用1H(500Mz)和13C NMR(125Mz)分析进一步鉴定，测得其波谱与其结构一致。
b)含有用于诊断和/或治疗应用的苯丁酸氮芥的胆甾醇基酯的充气DSPS微泡的制备向放在小瓶中的DSPS(Avanti,4.5mg)和a)中合成的产物(0.5mg)组成的混合物中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)，并将溶液冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间(head space)，小瓶在加帽混合器(cap mixer)中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。MALDI质谱显示没有可检测水平的a)中的化合物存在于最终的洗涤溶液中用MALDI质谱分析确认苯丁酸氮芥胆甾醇基酯掺合进气泡的程度，方法如下将约50μl的微泡转入到一个含有约100μl的90％甲醇的洁净的小瓶中。将混合液用超声波处理30秒，用MALDI质谱分析，得到M+H的峰值为668(相当于a)中的结构)。
与肿瘤特异性载体组合使用，这些微泡作为导向药物传递剂是十分有用的。实施例27-包含含氨酰心胺的酯肽和用于诊断和治疗应用的和苯丁酸氮芥的胆固醇衍生物的脂肽的多特异性充气DSPS微泡a)适于固相偶联的带保护基的的氨酰心安衍生物的合成方法如实施例25b)的描述。
b)由氨酰心安官能团化的脂肽的合成方法如实施例25c)中的描述。
c)4-[4-双(2-氯乙基)氨基]-苯基]丁酸胆甾醇酯的合成方法如实施例25d)中的描述。
d)包含含氨酰心安的脂肽和苯丁酸氮芥的胆甾醇基酯的DSPS微泡的制备向放在小瓶中的由DSPS(Avanti,5.0mg)、b)中合成的产物(0.5mg)和c)中合成的产物(0.5mg)组成的混合物中加入1.0mL 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。将混合液用超声波处理5分钟，然后在80℃下温热5分钟(在温热期间振荡小瓶)。将溶液过滤冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间，小瓶先在加帽混合器中振动45秒，然后用去离子水充分洗涤。如实施例1c)中描述的方法，用MALDI质谱分析确认含有氨酰心安的脂肽和苯丁酸氮芥类似物掺合进气泡的程度。
e)包含含氨酰心安的酯肽和用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的胆固醇衍生物的多特异性PFB充气DSPS微泡的体外研究使用如实施例1c)中描述的体外鉴定方法，估计在流动条件下细胞的结合。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。实施例28-包含用于细胞导向的含氨酰心安的脂肽和用于治疗的甲巯丙脯酸的亲脂性硫醇酯的多特异性充气DSPS微泡a)适于固相偶联的带保护基的氨酰心安衍生物的合成所用方法如实施例25b)中的描述。
b)由氨酰心安官能团化的脂肽的合成所用方法如实施例25c)中的描述。
c)甲巯丙脯酸的胆烷酸硫醇酯的合成将溶于二氯甲烷(5ml)的5-β-胆烷酸(Sigma,36lmg,1.00mmol)和DIC(77μl,0.50mmol)混合物搅拌10分钟，然后将其加入到甲巯丙脯酸(Sigma,130mg,0.600mmol)和DBU(180μl,1.20mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中。将反应混合液搅拌过夜，然后倒入稀盐酸中。加入30ml氯仿。将各相分离，用盐水和无水MgSO4洗涤有机相。将溶液过滤并浓缩后，用柱层析(二氧化硅，氯仿/甲醇/醋酸95∶4∶1)纯化产物。将产物在乙腈/水/乙醚混合物溶液中冷冻干燥，得到137mg(49％)的黄白色固体。用1H(500Mz)和13C NMR(125Mz)分析鉴定产物的结构，用MALDI质谱进一步鉴定，以阳性方式测得其M+Na的峰在m/z 584处。
d)包含用于细胞导向的含氨酰心安的脂肽和用于治疗的甲巯丙脯酸的亲脂性硫醇酯的充气DSPS微泡的制备向放在小瓶中的由DSPS(Avanti,5.0mg)、b)中合成的产物(0.5mg)和c)中合成的产物(0.5mg)组成的混合物中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。将混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)，并将溶液冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间，小瓶在加帽混合器中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。最后的洗涤溶液用MALDI质谱检测，直到检测不到b)和c)制备的化合物为止。用MALDI质谱确认b)和c)制备的化合物掺合到气泡中的程度，方法如下将约50μl的微泡转入到一个含有约100μl的90％甲醇的洁净的小瓶中。将混合液用超声波处理30秒，用MALDI质谱(ACH-基质)分析，得到的峰值分别与b)和c)制备的化合物的结构相一致。
e)b)中制备的充气微泡的体外研究使用实施例1c)中描述的体外测定方法，检查在流动条件下细胞的结合。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。实施例29)-含有生物素酰胺-PEG-β-Ala-胆固醇和用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的氯乙基酯的磷脂酰丝氨酸的充气微泡a)N-Boc-β-丙氨酸胆甾醇酯的合成在惰性气体中，将DIC(510μl，)加入到溶于无水二氯甲烷(15ml)的Boc-β-Ala-OH(1.25mg,6.60mmol)溶液中。将混合液在室温下搅拌30分钟，然后将其转入到含有胆固醇(1.16g,3.00mmol)和DMAP(367mg,3.00mmol)的二氯甲烷(15m1)溶液的烧瓶中。搅拌反应混合液2小时，然后将其倒入含水的碳酸氢钠溶液中。将各相分离，用氯仿萃取水相。用含水的硫酸氢钾、水和无水过MgSO4洗涤结合的有机相。将溶液过滤蒸发后，将粗产物层析(二氧化硅，氯仿/甲醇99∶1)，得到1.63mg(97％)的白色固体。用1H NMR(500Mz)进一步确定其结构。
b)β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐的合成将溶于含有1,4-二氧六环的1M盐酸的a)中制备的化合物(279mg,0.500mmol)的溶液(5ml)在室温下搅拌4小时。将反应混合液浓缩，得到一定量的β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐。经1H NMR(500Hz)分析和MADI质谱鉴定其结构，获得的实测值M+Na峰值为482，预测值为481。
c)生物素-PEG3400-β-Ala-胆固醇向溶于氯仿/湿甲醇(2.6∶1,3ml)的β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐(15mg,0.03mmol)溶液中加入三乙胺(42μl,0.03mmol)。在室温下将混合液搅拌10分钟，然后滴加溶于1,4-二氧六环(1ml)的生物素-PEG3400-NHS(100mg,0.03mmol)溶液。在室温下搅拌3小时后，将混合液蒸干，将残余物用急骤(flash)层析法纯化，得到一种白色晶体，产量为102mg(89％)。用MALDI质谱和NMR分析鉴定产物的结构。
d)4-[4-双(2-氯乙基)氨基]-苯基]丁酸胆甾醇酯的合成将DIC(170μl,1.10mmol)加入到溶于无水二氯甲烷(15ml)的苯丁酸氮芥(Sigma,669mg,2.20mmol)溶液中。将混合液在室温下搅拌0.5小时，然后将其加入到胆固醇(Aldrich,387mg,1.00mmol)和DMAP(122mg,1.00mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中。搅拌反应混合液过夜，然后将其倒入5％的碳酸氢钠溶液中。用盐水和无水MgSO4洗涤有机相。将溶液过滤浓缩，用柱层析(二氧化硅，氯仿)纯化产物，得到560mg(83％)无色的油状物。用MALDI质谱鉴定，实测值M+H为674(与预测值相同)。用1H(500Mz)和13C NMR(125Mz)分析进一步鉴定，测得其波谱与其结构一致。
e)充气微泡的制备向放在小瓶中的由DSPS(Avanti,5.0mg)、c)中合成的产物(0.5mg)和d)中合成的产物(0.5mg)组成混合物中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)。将溶液过滤并冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间，小瓶先在加帽混合器中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。用MALDI质谱检测最后溶液，直到其中c)和d)化合物的浓度检测不到为止。
如实施例1b)中描述的方法，用MALDI质谱分析确认c)和d)化合物掺合进气泡中的程度。实施例30)-包含含有用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的脂肽的充气DSPS的微泡本实施例涉及对多种内皮细胞的表面分子具有非特异性亲和性的官能团化的微泡的制备。
a)含有苯丁酸氮芥的脂肽的合成
在0.125mmol水平上，从Fmoc保护的Rink酰胺MBHA树脂(Novabiochem)起始，使用手动氮气气泡装置合成具有以上结构的物质，标准氨基酸从Novabiochem购买，棕榈酸从Fluka购买。使用标准TBTU/HOBt/DIEA程序进行偶联。用DIC预先激活，通过赖氨酸的侧链，将苯丁酸氮芥作为对称的酸酐偶联。使用含有5％EDT、5％H2O和5％乙甲基硫化物的TFA，从树脂上除去肽和同时将侧链保护基脱保护，进行2小时。使用制备液相色谱(Vydac218TP1022柱)对10mg等分试样的粗提物进行纯化，所用梯度为70-100％B(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经60分钟，流速为10mL/分钟。冷冻干燥后，得到30mg纯物质(分析型HPLC；梯度，70-100％B(其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)，经过20分钟；流速为1mL/分钟；柱-vydac218TP54检测UV214nm；产物保留时间=26.5分钟)。使用MALDI质谱进一步鉴定产物；M+H的实测值为1295，预测值为1294。
b)包含含有用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的脂肽的充气微泡的制备向放在小瓶中的混合物(由DSPS(Avanti,4.5mg)和从a)中合成的产物(0.5mg)组成)中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)，接着冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间，小瓶先在加帽混合器中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。直到最后的洗涤溶液中用MALDI质谱检测不到a)中制备的物质为止。用MALDI质谱分析确认含有脂肽的苯丁酸氮芥掺合进气泡中的程度，方法如下将约50μl的微泡转入到一个含有约100μl的90％甲醇的洁净的小瓶中。将混合液用超声波处理30秒，用MALDI质谱(ACH-matrix)分析，得到的M+H峰值为1300，预测值为1294，M+Na的峰值为1324，预测值为1317。
c)掺入了含有用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的脂肽的充气DSPS微泡的体外研究使用实施例1c)中描述的体外流动分析方法，评价微泡。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。实施例31)-包含含氨酰心安的脂肽和用于诊断和治疗应用的甲巯丙脯酸的亲脂性衍生物的充气DSPS的微泡a)适用于固相偶联的带保护基的氨酰心安衍生物的合成所用方法如实施例25b)中的描述b)N-[(s)-3-十六烷基硫-2-甲基丙酰]脯氨酸的合成将DIEA(188μl,1.10mmol)加入到溶于四氢呋喃(5ml)的碘代十六烷(176mg,0.500mmol)、甲巯丙脯酸(120mg,0.550mmol)和DBU(165μl,1.10mmol)溶液中。将混合液在70℃下搅拌2小时，然后将其浓缩。将残余物倒入硫酸氢钾溶液中。将有机物质萃取进入氯仿。用水和无水MgSO4洗涤有机相。用层析(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH85∶10∶5)纯化产物。冷冻干燥后得到105mg(48％)的白色固体产物。用1H和13C NMR分析鉴定其结构。用MALDI质谱进一步确认，阴性方式给出M-H的值为m/z 440(与预测值相同)。
c)包含含氨酰心安的脂肽和用于诊断和治疗应用的甲巯丙脯酸的亲脂性衍生物的充气DSPS的微泡的制备向放在小瓶中的由DSPS(Avanti,4.5mg)、b)中合成的产物(0.5mg)和c)中合成的产物组成的混合物中加入1.0mL1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。混合液用超声波处理5分钟，然后温热至80℃5分钟(在温热期间振荡小瓶)，将溶液冷却。以全氟丁烷气体冲洗液面上空间，小瓶先在加帽混合器中振荡45秒，然后用去离子水充分洗涤。用MALDI质谱检测最后溶液，直到其中b)和c)化合物的浓度检测不到为止。如实施例1b)中描述的方法，用MALDI质谱分析确认b)和c)化合物掺合进气泡的程度。
d)包含含氨酰心安的脂肽和用于诊断和治疗应用的甲巯丙脯酸的亲脂性衍生物的充气DSPS的微泡的体外研究使用实施例1c)中所描述的体外流动鉴定方法，评价微泡。细胞上的微泡逐渐积累，这种积累取决于流速。通过增加流速，细胞开始从盖玻片上分离，微泡仍然与细胞结合。不携带载体的对照气泡不附到内皮细胞上，并在最小流速下从细胞中消失。实施例32-使用包含与内皮细胞结合的多特异性脂肽的DSPS微泡浮选内皮细胞实施本实施例以说明本发明也能用于细胞分离。将人内皮细胞系ECV304(来源于一正常的脐带(ATCC CRL-1998))培养在260ml的Nunc培养烧瓶中(chutney153732)，培养基为RPMI1640(BioWhittaker)(其中加入了200mM L-谷酰胺，青霉素/链霉素(10.000U/mL和10.000mcg/mL)和10％胎牛血清(HycloneLotno.AFE5183))。以1∶5-1∶7的割裂比(split ratia)对细胞进行继代培养，直到铺满。从胰蛋白酶作用的铺满的培养基上取2mill细胞加入到一系列(5个)离心管中，然后接着加入对照DSPS微泡、实施例1中的微泡或实施例14制备的掺入了内皮细胞结合脂肽的DSPS微泡，每试管的浓度分别为2、4、6、8或10mill气泡，在400g下离心5分钟后，用库尔特计数器计算在试管底部的细胞。结果发现，结合4个或更多个微泡的细胞发生浮选。而且通过内皮细胞结合脂肽气泡，所有的细胞都发生浮选，而与实施例1)中的微泡结合的细胞约有50％的发生浮选。实施例33-通过PFB充气微泡进行基因转移本实施例涉及用于基因转移的导向微泡的制备。
a)由多聚-L-赖氨酸涂布的DSPS脂肽气泡/PFB气体的制备称量DSPS(4.5mg)和实施例17b)中制备的脂肽(0.5mg)放入两个2毫升的小瓶。向每个小瓶中加入0.8ml丙二醇/甘油(4％)水溶液。混合液温热至80℃5分钟，振荡小瓶。将溶液冷却至室温，以全氟丁烷气体冲洗液面上空间。小瓶在Capmix(Espe Capmix,4450次振动/分钟)中振荡45秒，然后将其放在转台上5分钟。将各瓶中的物质混合，在2000rpm下离心5分钟洗涤样品。除去清液，加入相同体积的蒸馏水。重复洗涤一次。
将多聚-L-赖氨酸HBR(Sigma,20.6mg)溶于2ml水中，然后取0.4ml试样稀释到2ml。向1.2ml稀释的多聚-L-赖氨酸溶液中加入0.12ml DSPS-脂肽气泡悬液。然后温育，通过用水充分洗涤除去过量的多聚赖氨酸。
b)细胞的转染将内皮细胞(ECV304)培养在6孔培养板上，以便形成均匀的亚铺满层。制备最后的体积为250μl的转染混合物，其含有5μl DNA(从CLONTECH得到的一种增强的绿色荧光蛋白载体)和50μl RPMI培养基中的a)中制备的微泡悬液。在室温下将混合液左倾放置15分钟，然后加入1ml完全RPMI培养基。从细胞培养皿中除去培养基，向细胞中加入DNA-微泡混合液。将细胞在细胞培养温箱中(37℃)温育。
c)超声处理温育15分钟后，将选择的孔暴露在1MHz,0.5W/cm2的连续超声波中30秒。
d)温育和检查将细胞放在细胞培养温箱(37℃)中进一步温育大约4.5小时。通过抽吸将含有DNA-微泡的培养基除去，加入2ml完全RPMI培养基。将细胞温育40-70小时，然后检查。将其中的大部分培养基除去，在荧光显微镜下检查细胞。将结果与对照实验的结果比较，发现细胞中加入了DNA或DNA-多聚赖氨酸)。
权利要求
1．一种可导向的诊断和/或治疗活性剂，其含有报道物在含水载液中的悬液，所说的报道物包含含气体或产气体的物质，所说的活性剂能够与靶形成至少两种类型的结合对。
2．按照权利要求1的活性剂，其中所说的气体包括空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，惰性气体，氟化硫，六氟化硒，低分子量的碳氢化合物，酮，酯，卤代低分子量碳氢化合物或任何上述的混合物。
3．按照权利要求2的活性剂，其中所说的气体包括全氟化酮，全氟化醚或全氟碳。
4．按照权利要求2的活性剂，其中所说的气体包括六氟化硫或全氟丙烷，全氟丁烷或全氟戊烷。
5．按照上述权利要求之任一的活性剂，该活性剂含有由以下物质稳定化的气体微泡抗聚结表面膜、产生膜的蛋白质、聚合物、非聚合的和不可聚合的形成壁的物质或表面活性剂。
6．按照权利要求5的活性剂，其中所说的表面活性剂包含至少一种磷脂。
7．按照权利要求6的活性剂，其中至少75％的所说表面活性剂物质包含单独带有净电荷的磷脂分子。
8．按照权利要求7的活性剂，其中至少75％的形成膜的表面活性剂物质包含一种或多种选自磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸和心肌磷脂的磷脂。
9．按照权利要求8的活性剂，其中至少80％的所说磷脂包含磷脂酰丝氨酸。
10．按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的含气体的或产气体的物质缀合到至少两种载体上，或者缀合到能够结合到至少两个结合位点上的一种载体上。
11．按照权利要求1-9之任一的活性剂，其中所说的含气体的或产气体的物质缀合到一种或多种导向载体(其对一种或多种细胞表面受体具有特异性)上，并且还含有能够结合到受体系统上以诱导治疗反应的部分。
12．按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体选自抗体；细胞粘着分子；细胞粘着分子受体；细胞因子；生长因子；肽激素和其片段；细胞粘着分子，细胞因子，生长因子和肽激素的受体的非生物活性连接物；低核苷酸和修饰的低核苷酸；DNA-结合药物；蛋白酶底物/抑制剂；组合文库所产生的分子；生物活性小分子；以及结合到细胞表面蛋白多糖上的蛋白质和多肽。
13．按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体具有对靶的亲和性，其亲和性水平使得活性剂与靶相互作用，但并非牢固地结合在所说的靶上。
14．按照权利要求13的活性剂，其中所说的载体选自细胞粘着蛋白的配体和具有对应于内皮细胞表面的配体的细胞粘着蛋白。
15．按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体被定位住，这样它们不容易暴露给靶。
16．按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体借助亲和素-生物素和/或链霉抗生物素蛋白-生物素的相互作用与报道物偶连或连接。
17．按照上述权利要求1-15的活性剂，其中所说的载体可以共价或非共价偶联或连接到报道物上。
18．按照权利要求1-15之任一的活性剂，其中所说的载体借助静电相互作用与报道物偶联或连接。
19．按照上述权利要求之任一的活性剂，其还含有放射性的或作为X光造影剂，光造影探针或旋转标记有效的组分。
20．按照上述权利要求之任一的活性剂，其还包含治疗化合物。
21．按照权利要求20的活性剂，其中所说的治疗化合物是抗肿瘤剂，血液制品，生物效应修饰剂，抗真菌剂，激素或激素类似物，维生素，酶，抗过敏剂，组织因子抑制剂，血小板抑制剂，凝聚蛋白质靶抑制剂，血纤蛋白形成抑制剂，纤溶促进剂，抗血管生成药物，循环药物，代谢增强物，抗结核物，抗病毒物，血管舒张物，抗生素，消炎剂，抗原生动物物，抗风湿物，麻醉药，阿片剂，强心苷，神经肌肉阻断剂，镇静剂，局部麻醉剂，全身麻醉剂或遗传物质。
22．按照权利要求20或权利要求21的活性剂，其中所说的治疗化合物通过二硫化物基团与报道物共价偶连或连接。
23．按照权利要求20或权利要求21的活性剂，其中所说的亲脂性或亲脂性衍生化的治疗化合物通过疏水相互作用与报道物相连接。
24．一种组合制剂，该制剂包含ⅰ)包含对所选择靶具有亲和性的前导向载体的第一可施用组合物；和ⅱ)包含上述权利要求之任一的活性剂的第二可施用组合物，其中所说的活性剂包含对所说的前导向载体具有亲和性的载体。
25．按照权利要求24的组合制剂，其中所说的前导向载体是单克隆抗体。
26．一种组合制剂，该制剂包含ⅰ)包含权利要求1-23之任一的活性剂的第一可施用组合物；和ⅱ)包含可从所说活性剂的靶中取代或释放该活性剂的物质的第二可施用组合物。
27．一种组合制剂，该制剂包含ⅰ)包含按照权利要求22的活性剂的第一可施用组合物；和ⅱ)包含可还原性切割偶连或连接治疗化合物与报道物(它们存在于所说的第一可施用组合物的活性剂中)的二硫化物基团的还原剂的第二可施用组合物。
28．一种制备按照权利要求1的可导向的诊断和/或治疗活性剂的方法，该方法包括使至少一种载体与含气体的或产气体的物质的报道物相偶连或连接，以便所说的活性剂能够与靶形成至少两种类型的结合对。
29．按照权利要求28的方法，其中治疗化合物也与报道物组合。
30．按照的权利要求1-23之任一的活性剂的用途，其作为可导向的超声造影剂。
31．一种获得人或非人动物体的增强的影像的方法，该方法包括施用权利要求1-21之任一的活性剂至所说人或非人动物体内，并产生至少一部分身体的超声，磁共振，X光，放射照相或光影像。
32．按照权利要求31的方法，该方法包括以下步骤ⅰ)施用对所选择靶具有亲和性的前导向载体至所说的身体内；然后ⅱ)施用权利要求的1-23之任一的活性剂，其中所说的活性剂包含对所说的前导向载体具有亲和性的载体。
33．按照权利要求32的方法，其中所说的前导向载体是单克隆抗体。
34．按照权利要求31的方法，该方法包括以下步骤ⅰ)施用权利要求1-23之任一的活性剂至所说的身体内；然后ⅱ)施用可从所说活性剂的靶中取代或释放该活性剂的物质。
35．按照权利要求31-34之任一的方法，其中所说的活性剂还包含治疗化合物。
36．按照权利要求35的方法，其中所说的治疗化合物通过二硫化物基团与报道物共价偶连或连接，随后施用包含可还原性切割所说的二硫化物基团的还原剂的组合物。
37．一种体外研究权利要求1-23之任一的活性剂导向的方法，其中表达靶的细胞被固定于流腔室中，使所说活性剂的载液悬液流过所说的腔室，并检查所说活性剂与所说细胞的结合。
38．按照权利要求37的方法，其中控制载液流量以模拟在体内所遇到的剪切速率。
全文摘要
本发明提供了一些可导向的诊断和/或治疗活性剂，例如超声造影剂，这些活性剂含有报道物在含水载液中的悬液，所说的报道物包含含气体或产气体的物质，所说的活性剂能够与靶形成至少两种类型的结合对。
文档编号A61K47/02GK1238700SQ9718016
公开日1999年12月15日 申请日期1997年10月28日 优先权日1996年10月28日
发明者J·卡拉威斯, P·罗格维德, A·霍斯特, H·托里沙格, A·库比特森, A·戈达尔, L·霍夫, G·戈斯塔德, K·比赖恩, A·尼维斯塔德, D·洛哈格, H·赫里布斯特, M·索巴肯 申请人:奈科姆成像有限公司