专利名称：抑制肌腱膜纤维瘤病(硬纤维瘤)的方法
背景技术：
肌腱膜纤维瘤病是一类非转移性的结缔组织局部侵入性发育不良性损伤。该类疾病包括结节性筋膜炎、跖纤维瘤病和先前划分为硬纤维瘤的损伤。
大多数“硬纤维”损伤涉及骨骼肌和相关的筋膜层。它们最常发生于怀孕期间或孕后妇女的腹壁；它们也常见于男性并发生于腹部外的部位，包括头和颈部、股和肩部。
损伤也偶发于手术疤痕和肠系膜，一种常见的形式与Gardner综合症有关。建议的治疗方法是沿正常组织边缘大面积切除。但手足和主要血管及神经应该不受损害，即使有可能复发。常见局部复发并经常需要再切除。放射疗法对这些损伤也有效。某些情况采用他莫昔芬治疗有效。但无论如何，仍需要其它的疗法。
发明概述本发明提供抑制哺乳动物肌腱膜纤维瘤病的方法，该方法通过对需此抑制的哺乳动物施用有效量的式Ⅰ化合物或其可药用盐或溶剂化物实现，
其中R1和R3独立地是氢、-CH3、
烷基)或
其中Ar是任选取代的苯基；
R2选自吡咯烷子基、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
发明详述本发明涉及一组2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩(苯并噻吩)化合物的发现，其中的式Ⅰ化合物可用于抑制肌腱膜纤维瘤病。
本发明提供的使用方法通过给需此抑制的人施用式Ⅰ化合物或其可药用盐或溶剂化物得以实现，该化合物对抑制肌腱膜纤维瘤病有效。术语“抑制”包括其通常公认的含义，包括阻止、预防、限制和缓解、阻止或逆转疾病发展、严重程度或产生的症状或效果。
雷洛昔芬，一种其中R1和R3是氢并且R2是1-哌啶基的本发明式Ⅰ化合物的盐酸盐，是一种核调节分子。雷洛昔芬已显示与雌激素受体结合并最初被认为是具有抗雌激素功能和药理学作用的分子，因为它阻断雌激素激活子宫组织和雌激素依赖性乳腺癌的能力。确实，雷洛昔芬在某些细胞中阻断雌激素的作用；但在其它类型的细胞中，雷洛昔芬与雌激素激活相同的基因并显示出相同的药理性质，如导致骨质疏松、高血脂症。结果，雷洛昔芬被认为是具有混合激动-拮抗剂特性的一种抗雌激素。现在认为雷洛昔芬显示的与雌激素不同的独特性质是由于雷洛昔芬-雌激素受体复合物对各种基因功能的独特的激活和/或抑制作用，与雌激素-雌激素受体复合物对基因的激活和/或抑制作用不同。因此，虽然雷洛昔芬和雌激素利用并竞争相同的受体，但并不容易预测二者对基因调节的药理结果，它们各有特点。
一般来说，化合物与常用赋形剂、稀释剂或载体配制，压制成片剂；或配制为方便口服酏剂或溶液给药或经肌内或静脉内途径给药的。这些化合物可经皮给药，并可配制成缓释剂型等。
本发明的方法中使用的化合物可按照已知的方法制备，如那些在美国专利4133814、4418068和4380635中详述的方法，这些文献均引入本文以供参考。通常，从带6-羟基和2-(4-羟基苯基)的苯并[b]噻吩开始。将原料化合物加以保护、酰化，然后脱保护形成式Ⅰ化合物。上述的美国专利中给出了这些化合物的制备实施例。任意取代的苯基包括苯基和被一个或两个C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代的苯基。
本发明方法使用的化合物与各种有机和无机酸和碱形成可药用的酸和碱加成盐，包括药物化学中常用的生理上可接受的盐。这类盐也是本发明的一部分。用于形成这类盐的典型无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸和连二磷酸等。也可以使用由有机酸例如脂族单或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸和羟基链烷二酸、芳族羧酸，脂族和芳族磺酸等衍生形成的盐。这类可药用盐包括乙酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、溴化物、异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,4-二酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙磺酸盐、2一羟基乙磺酸盐、甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等。优选的盐是盐酸盐。
可药用酸加成盐通常是通过式Ⅰ化合物与等摩尔量或过量的酸反应形成的。一般将反应物在它们的共同溶剂，如乙醚或苯中混合。通常在一小时或10天内盐从溶液中沉淀出来，该盐可经过滤或用常规方法除去溶剂加以分离。
常用于形成盐的碱包括氢氧化铵及碱金属和碱土金属氢氧化物，碳酸盐以及脂族和伯、仲、叔胺，脂族二胺。特别适合用于制备加成盐的碱包括氢氧化铵、碳酸钾、甲胺、二乙胺、乙二胺和环己胺。
与衍生它们的化合物相比，可药用盐通常溶解性提高，因此，它们常常更适合配制液体或乳剂。
药物制剂可采用本领域已知的方法配制。例如，可将化合物与常用赋形剂、稀释剂或载体配制形成片剂、胶囊、悬浮液、粉剂等。适用于这类制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括下述填充剂和膨胀剂，如淀粉、糖类、甘露醇和硅质衍生物；粘合剂，如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物，藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂，如甘油；崩解剂，如碳酸钙和碳酸氢钠；延迟溶解的试剂，如石蜡；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如鲸蜡醇，甘油单硬脂酸酯；吸附载体，如高岭土和膨润土；以及润滑剂，如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁及固态聚乙二醇。
也可将化合物配制成方便口服给药的酏剂或溶液，或者配制成适于非胃肠道，如肌内、皮下或静脉途径给药的溶液。此外，这些化合物很适于配制成缓释剂型等。可以将制剂配制成仅在或优选在肠道特定部位在一个时间段内释放活性成分。还可带有包衣、包封和保护性基质，如使用聚合物或蜡。
根据本发明，抑制肌腱膜纤维瘤病或本文公开的其它用途所需的式Ⅰ化合物的特定剂量将取决于疾病的严重程度、给药途径和由临床医师决定的其它因素。通常，可接受的有效每日剂量为约0.1-约1000毫克/天，更典型的是约50-约200毫克/天。为有效抑制肌腱膜瘤病，对需此抑制的被治疗对象，该剂量可每天给药一次至约三次，或根据需要给药更多次。
式Ⅰ化合物通常优选以酸加成盐形式给药，正如带有碱性基团如哌啶子基环的药物的常用作法一样。通过口服给药这类化合物也是有益的。为此，可利用下列口服剂型。
对于局部给药，可按照本领域已知的直接应用于表面的技术配制化合物。为此目的的常规形式包括软膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂和气雾剂。本发明化合物在局部制剂中的重量百分含量取决于各种因素，但一般为制剂总重量的0.5％-95％，典型为1-25％(重量)。
组合物可呈含水或无水溶液或分散液形式，或者呈乳液或悬浮液形式。
这些组合物可含有现有技术中公知的可药用载体和辅剂。例如，为制备溶液，可使用一种或多种生理可接受的有机溶剂，除水外，还选自丙酮、乙醇、异丙醇、乙二醇醚(如名称为“Dowanol”的市售产品)、聚乙二醇类、聚氧乙烯类、短链酸的C1-C4烷基酯(优选乳酸乙酯或乳酸异丙酯)、脂肪酸甘油三酯(如名称为“Miglyol”的市售产品)、肉豆蔻酸异丙酯以及动物、矿物和植物油和聚硅氧烷。
本发明的组合物还可含有增稠剂，如纤维素和/或纤维素衍生物。它们还可含有树胶，如黄蓍胶、瓜耳胶或角豆胶或阿拉伯胶，或者聚乙二醇、有机皂土和蒙脱土等。
主要适于局部应用的盖伦形式呈乳油、奶液、凝胶、分散液或微乳形式，呈或多或少增稠了的洗剂、浸渍垫、软膏剂或棒状制剂形式，或者呈喷雾或泡沫形式的气雾剂或皂块形式。
制剂在下列制剂中，“活性成分”是指式Ⅰ化合物。
制剂1明胶胶囊采用下列成分制备硬明胶胶囊
将成分混合并过45目美国筛，然后填充到硬明胶胶囊中。制备的特定雷洛昔芬胶囊制剂的实例包括下列成分制剂2雷洛昔芬胶囊
制剂3雷洛昔芬胶囊
制剂4雷洛昔芬胶囊
制剂5雷洛昔芬胶囊
上述的具体配方可以依照所规定的合理变动而变化。采用下述成分制备片剂制剂6片剂
将各成分混合并压制成片。或者，如下制备各含0.1-1000毫克活性成分的片剂制7片剂
将活性成分、淀粉和纤维素过45目美国筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，然后过14目美国筛。将如此得到的颗粒于50-60℃干燥，然后过18目美国筛。将预先通过60目美国筛的羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石加到该颗粒中，混合后，在压片机上压片得到片剂。
如下制备每5毫升含0.1-1000毫克药物的悬浮液制剂8悬浮液
将药物通过45目美国筛并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形成柔滑的糊状物。将苯甲酸溶液、芳香剂和着色剂用一定量的水稀释并在搅拌下加入。然后加入足量水至所需体积。制备下列局部组合物制剂9
制剂10
制剂11
制剂12
制剂9-12为凝胶形式。制剂13
制剂14
制剂15
制剂16
制剂13、14、15和16呈洗剂形式。制剂17
制剂18
制剂17和18呈棒状制剂形式。
硬纤维瘤是稀少的纤维源非转移性肿瘤。临床验证表明甾类激素可能在这类肿瘤的自然史中起作用它主要见于育龄妇女患者中，而且这类肿瘤的退化与绝经和抗雌激素疗法有关。
本研究的目的是确认硬纤维瘤原代细胞中的雌激素受体，评价式Ⅰ化合物对原代培养物中硬纤维瘤细胞的作用。
由于有时硬纤维瘤发生于家族性多发性腺癌(FAP)患者中，它可在结肠或直肠癌患者中退化，我们试验了式Ⅰa化合物对腺癌细胞系(HCT8)和结肠癌患者活检样品的成纤维细胞的细胞生长抑制作用。
化合物Ⅰa是其中R2是吡咯烷子基并且R1和R3是氢的式Ⅰ化合物。
使用完整细胞进行结合性研究。将硬纤维瘤细胞平铺在有生长培养基(补充有10％FCS的Coon改性的Ham F12)的6孔培养板上。24小时后，用不加酚红的稳态培养基替换该生长培养基，使细胞在饥饿状态保持24小时。然后将细胞用1毫升不加酚红、但含有25mM HEPES和0.5％EtOH的培养基(结合缓冲液)和增高浓度(0.05-10nM)的[3H]17βE2(其中含或不含500倍过量的未标记的17βE2和式Ⅰa化合物)培养1小时。培养后，细胞用800微升结合缓冲液洗涤两次并用1N NaOH于70℃裂解30分钟。然后将4N HCl加到每孔中以便中和。用液体闪烁光谱法测定放射活性。通过Scatchard分析法评价ER结合亲和性和结合容量。
随后的所有步骤均在0-4℃下进行。将研碎的组织在缓冲液中于polytron匀浆器中匀化两次，每次10秒，中间有30秒的冷却时间，缓冲液的成分是10mM Tris-HCl、5mMEDTA、10mM钼酸钠、10mM二硫赤藓糖醇、10％甘油(v/v)、pH 7.4。将匀浆在7000g离心20分钟，摒弃沉淀物，上清液于105000g再离心60分钟，得到用于雌激素受体分析用的细胞溶质。将细胞溶质稀释到1-2毫克蛋白/毫升。按照Bradford法测定细胞溶质蛋白。为进行雌激素受体分析，将细胞溶质于4℃和浓度范围为0.05-5nM的[3H]17βE2并与或不与500倍过量的未标记的17βE2和式Ⅰa化合物一起培养。通过Scatchard分析法评价ER结合亲和性和结合容量。
将细胞以每孔8×104个细胞的密度平铺在有生长培养基的6孔培养板中。24小时后，用不加酚红、但补充有0.1％DMF、0.1％EtOH和不同浓度式Ⅰa化合物(2×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M)的生长培养基刺激。
将细胞培养6天，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液使其移动，然后通过显微镜计数评价生长情况。使用相同方法评价结肠癌初期成纤维细胞系和HCT8细胞系该细胞系在RPMⅠ中培养并在刺激后培养4天。
用酶联免疫分析法(ELISA)测定培养基中的Ⅰ型胶原和细胞层。简言之，将细胞在含有50微克/毫升抗坏血酸和100微克/毫升β-氨基丙腈基(propionitryl)富马酸酯的未加补充养分的Coon改性Ham F12培养基中培养24小时。
收获培养基并用0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)适当稀释，然后用其包被ELISA培养板，于4℃过夜，为使非特异性结合位点饱和，将ELISA培养板在含5％奶粉的PBS(PBS Blotto)中于37℃培养1.5小时，与含特异性多克隆抗体的PBS Blotto于37℃培养2小时，在含山羊抗兔IgG-碱性磷酸酶共轭复合物(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的PBS Blotto中于37℃培养1.5小时。
然后用50微克/毫升Mg++和1毫克/毫升对硝基苯基磷酸酯作为碱性磷酸酶的底物，将样品与10％二乙醇胺(pH9.8)在室温接触。在405纳米读取光密度，并根据标准曲线计算浓度。在0.5N氢氧化钠中收获单层细胞并超声测定细胞的Ⅰ型胶原。然后在0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中稀释细胞提取物并用其包被ELISA培养板。将标准品和样品重复分析三次。结果以微克蛋白/微克细胞DNA表示。DNA含量是经分光荧光法测定的。
在原代硬纤维瘤细胞和冷冻的硬纤维瘤样品中用[3H]17βE2作为配体进行结合性试验。
在两种试验中，[3H]17βE2结合仅少量(约10％)被500被过量的两种未标记的雌激素和化合物Ⅰa代替。使用计算机结合程序LIGAND对[3H]17βE2结合数据进行的Scatchard分析(Munson P.J.,Rodbard D.Anal.Biochem.1980；107:220-39)表明在三种不同的培养物中和由硬纤维瘤的活检样品制备的两种不同细胞溶质中均存在ER。
在生长分析中，当于各种浓度的式Ⅰa化合物接触时硬纤维瘤原代细胞受到刺激。结果是细胞生长随化合物Ⅰa浓度的增加而受到抑制(表1)。使用HCT8细胞系(表2)和结肠癌成纤维细胞系(表3)也得到了类似结果。
硬纤维瘤细胞以剂量依赖方式被浓度为10-5M、5×10-6M、10-6M的式Ⅰa化合物抑制，于10-5M浓度时获得最大抑制作用(表4)。
式Ⅰa化合物仅在极高的浓度下(500倍过量)可替代[3H]17βE2与硬纤维瘤组织结合。
式Ⅰa化合物在毫摩尔浓度下可明显抑制硬纤维瘤细胞增殖。此外，在类似浓度下，该化合物还抑制由人结肠癌得到的上皮和成纤维细胞的增殖。
在原代培养物中的硬纤维瘤细胞中Ⅰ型胶原的产生也由于化合物Ⅰa而明显减少。
在所有硬纤维细胞与雌激素效应元件的转染试验条件(电穿孔法、Ca/P沉淀法、脂质体法)下，细胞均破裂，结果不适于“体外”分析。
表1化合物Ⅰa(Mol/L)细胞×10-4对照 12.32.10-50.110-52.85.10-67.010-610.0表2化合物Ⅰa (Mol/L) 细胞×10-4对照 1502.10-5310-5715.10-6115表3化合物Ⅰa(Mol/L)细胞×10-4对照7.62.10-50.110-55.45.10-66.310-67.6表4DNADNA 胶原 胶原 P值(O∶D.) (μg) Ⅰ型 Ⅰ型(pg/孔)(μg/μg DNA)对照 4.85±0.32 1.36±0.06 47.82±4.15 35.00±1.41化合物 8.20±0.23 1.97±0.05 43.78±5.23 22.00±1.46p＜0.005Ⅰa(1μM)化合物 6.90±0.50 1.85±0.24 38.01±6.24 20.50±0.61p＜0.005Ⅰa(5μM)化合物 7.90±1.46 1.96±0.29 35.16±2.44 18.00±1.41p＜0.005Ⅰa(10μM)
权利要求
1．一种抑制肌腱膜纤维瘤病的方法，包括给需此抑制的哺乳动物施用有效量的式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或溶剂化物
其中R1和R3独立地是氢、-CH3、
烷基)或
其中Ar是任选取代的苯基；R2选自吡咯烷、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
2．权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物是人。
3．权利要求2的方法，其中所述的化合物是其盐酸盐。
4．权利要求3的方法，其中所述的化合物是
或其盐酸盐。
全文摘要
一种抑制肌腱膜纤维瘤病的方法,包括给需此抑制的哺乳动物施用有效量的式(Ⅰ)化合物或其可药用盐或溶剂化物,其中R
文档编号A61K31/445GK1209746SQ9719191
公开日1999年3月3日 申请日期1997年1月27日 优先权日1996年1月29日
发明者M·L·布兰迪, F·托内利 申请人:伊莱利利公司