抑制结肠肿瘤的方法

专利名称：抑制结肠肿瘤的方法
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结肠癌，包括直肠的和结肠直肠的腺癌，原发的或转移的腺癌等等，今天从疾病发病率的观点出发是一个主要的健康问题。据估计，二十五个美国人中的一个在他一生的时间里将发生某种形式的结肠癌，Sugarbaker,P.H等，Cancer,DeVita,V.T.，等(Eds.),Lippinocott Publ.Philadelphia,pp.795-884(1985)。
从治疗的观点出发，广泛采用外科方法，它有好的、混合的、或不令人满意的结果。特别是在伴随有局部地晚期或转移的疾病的结肠癌病人中，预后极其不好，伴有高发病率和死亡率。
已经尝试的药物治疗没有令人满意的结果，抗肿瘤的化合物，5-氟尿嘧啶(5-FU)，已是在治疗结肠癌方面选择的主要药物，已证实它的使用只有勉强够格的效果。5-FU可能暂时缩小结肠肿瘤的大小，但几乎没有证据显示病人的生存时间能被实质性地延长或得到“治愈”(根据五年缓解期)。在肿瘤转移至肝脏的病人中，已用5-FU进行化疗，但仅在百分之二十五或不到这个比例的病人中观察到暂时的改善，并且总的说来，没有对生存产生有意义地影响，LaMont,J.T.和Isselbacher,K.,Harrison’s Principles of Internal Medicine(10 th ed.)McGraw-Hill,New York,P.1764,(1983)。尽管5-FU勉强的效果，但没有其它药物或联合治疗表现出令人信服地更有效。Sugarbaker P.H.等，Supra.Woolley,P.V.，等，New Eng.,Med.,312:1465(1985)。
关于治疗人类癌症的药物疗法也已被评价，例如，人类结肠癌异种移植家系，在此家系中，人类肿瘤被连续异种移植到免疫缺陷的、所谓“裸的”小鼠中，然后检测这种小鼠对一种特定药物的敏感性。Giovanella,B.C.，等，Cancer 5(7):1146(1983)。在这些研究中得到的数据有力地支持异种移植人类肿瘤(包括结肠肿瘤)到免疫缺陷的哺乳动物(如“裸的”小鼠)中的有效性，它作为一个预言性模型来检测抗癌剂的效力。
在一个简短的临床试验中使用一种天然存在的生物碱-喜树碱的钠盐，来评价它对晚期不能治愈病人的毒性作用。Gottlieb,G.A.，等，Cancer Chemotherapy Rep.54:461(1970)。虽然经过这个治疗的这些病人的平均存活从大约2月增加到大约3.5+月，但从这个研究中几乎没有能得出结论。
人们已合成了喜树碱的衍生物或类似物，并在小鼠中作为抗白血病剂使用。(见例如，Wani,M.C.，等，J.Med.Chem.23:544,1980；Wani M.C.，等，J.Med.Chem.30:1774(1987)；and Wani,M.C.等，J.Med.Chem.30:2317(1987)。
在美国专利Nos.4473692和4545880中，Miyasaka等公开了10-取代喜树碱衍生物及其制备方法。10-取代喜树碱衍生物据说具有抗肿瘤活性，且同母体喜树碱化合物相比，它的毒性减低或稍有毒性。Miyasaka等没有公开特定的肿瘤靶，也没有表明用他们的10-取代喜树碱化合物可达到减小或稍有毒性至什么水平。
最近，已在各种人类癌症如白血病、淋巴瘤中检测到一种酶，人类拓扑异构酶Ⅰ。Potmesil M.等，Cancer Res.48:3537(1988)。人类拓扑异构酶Ⅰ被认为是一种单体蛋白质，它有一个100,000道尔顿的表观分子量。在各种DNA反式作用中(复制，转录和重组)，酶的转环状功能已受影响。在涉及两条DNA链中的一条瞬间断裂及一个共价拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物形成的机制中，纯化的哺乳动物拓朴异构酶Ⅰ松弛正向超螺旋的和反向超螺旋的DNA。在这个复合物中，拓扑异构酶Ⅰ被共价连接到断裂的DNA主链的3’-磷酰基末端。
最近，已经揭示了同正常粘膜的酶的水平比较，在癌组织中如结肠癌的外科手术标本中，拓扑异构酶Ⅰ的水平平均较高。(Hsiang,Y-H.，等，Proc Ann Meet of the Amer.Assoc.Cancer Res.29:172(1988)Abstract。虽然据称在这种(结肠癌)疾病的化疗中，拓扑异构酶Ⅰ可被认为是一个选择的靶，但还完全没有关于任何特异性拓扑异构酶Ⅰ相互作用药物的公开或建议。
鉴于经受了结肠癌常规治疗(如外科手术切除或用5-FU化疗)的病人极低的5年生存率(大约百分之五十或更少)，发现一种例如在外科手术后用药物或化合物有效治疗人类恶性结肠肿瘤的新方法将是非常有用的，这有助于证实诊断及消除大部分癌。这种药物治疗也有助于晚期疾病患者，这些患者的癌已转移或扩散到各种器官，以致于外科手术不适宜消除所有的癌组织。
发明概述本发明提供通过将有效量的下式Ⅰ化合物及其药学上可接受的盐及其溶剂化物给予需要它的哺乳动物而抑制结肠癌的方法
其中R1和R3独立地为氢、-CH3、
(C1-C6烷基)、或
其中Ar是可任选取代的苯基；R2选自吡咯烷基(pyrrolidino)、六亚甲基亚氨基和哌啶子基。
本发明的详细描述本发明涉及2-苯基-3-芳酰基苯并噻吩类(苯并噻吩)的一个精选组的发现，它表示于式Ⅰ，它对抑制结肠癌有作用。
本发明提供的使用方法通过将一定量的对抑制结肠癌有效的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物给予需要它的人来实施。此处术语“抑制”包括它的一般接受的含义阻止、防止、抑制以及减缓、停止或逆转进程、严重性或产生的症状或影响。
本发明的一个化合物，雷洛昔芬(Raloxifene)，它是R1和R3是氢、R2是1-哌啶基的式Ⅰ化合物的盐酸盐，它是一个核调节分子。已表明雷洛昔芬同雌激素受体结合，并且它最初被认为是一个在功能和药理学上为抗-雌激素的分子，因为它阻断雌激素激活子宫组织以及雌激素依赖的乳腺癌的能力。实际上，雷洛昔芬在某些细胞中能阻止雌激素的作用，而在其它细胞类型中，雷洛昔芬激活的基因与雌激素激活的基因相同，并显示出相同的药理学，如骨质疏松症、高脂血症。结果，雷洛昔芬已被认为是具有混合的兴奋剂-拮抗剂特性的一个抗雌激素。雷洛昔芬显示出且与雌激素不同的一个独特的特征范围是，现在认为在于它通过雷洛昔芬-雌激素受体复合物的不同基因独特的激活作用和/或抑制作用与通过雌激素-雌激素受体复合物的基因的激活作用和/或抑制作用相反。因此，虽然雷洛昔芬和雌激素利用和竞争相同的受体，但从二者的基因调节而来的药理学上的结果不能容易地预言并且是各自独特的一般地，这种化合物是用通常的赋形剂、稀释剂或载体来配制，并压制成片剂，或配制成酏剂或溶液剂以便于口服，或通过肌肉内的或静脉内的途径使用。这些化合物能被经皮使用，并且可以配制成缓释剂型等。
可根据既定的步骤制备在本发明方法中使用的这些化合物，如在美国专利Nos.4133814、4418068和4380635中详述的那些步骤，它们全部通过引用结合到本文中。通常，这个过程以具有6-羟基基团和2-(4-羟基苯)基团的苯并[b]噻吩开始。起始化合物被保护、酰化、然后去保护形成式Ⅰ的化合物。这种化合物制备的例子在上面讨论的美国专利中提供。可任选取代的苯基包括苯基和用C1-C6烷基、C1-C4烷氧基、羟基、硝基、氯、氟或三(氯或氟)甲基取代一次或二次的苯基。
本发明方法中所用的化合物可用种类繁多的有机和无机酸和碱形成药学上可接受的酸和碱加成盐以及包括在生理学上可接受的盐，这类化合物经常在药物化学中使用。这类盐也是本发明的部分。通常形成这类盐所用的典型的无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、次磷酸等等。从下列有机酸得到的盐也可用，如脂族一元羧酸和二羧酸、苯取代的链烷酸、羟基链烷酸和羟基链烷双酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸。因而这类药学上可接受的盐包括醋酸盐、苯乙酸盐。三氟醋酸盐、丙烯酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻-乙酸基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐，溴化物。异丁酸盐、苯基丁酸盐、β-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,4-二酸盐、癸酸盐、辛酸盐、氯化物、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二酸盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯丙酸盐、水杨酸盐、癸二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、硫酸盐、酸式硫酸盐、焦硫酸盐、亚硫酸盐、酸式亚硫酸盐、磺酸盐、苯磺酸盐、对-溴苯磺酸盐、氯代苯磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、酒石酸盐等等。优选的盐是盐酸盐。
药学上可接受的酸加成盐典型地是由式Ⅰ化合物同等摩尔的或超量的酸反应而形成的。通常在互溶剂如乙醚或苯中化合反应物。这种盐通常在大约1小时至10天中从溶液中沉淀，通过过滤或通过常规方法除去溶剂而分离这种盐。
通常用于形成盐的碱包括氢氧化铵和碱金属和碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、还有脂族伯胺、仲胺和叔胺、脂族二元胺。在加成盐的制备中特别有用的碱包括氢氧化铵、碳酸钾、甲胺、二乙胺、乙二胺和环己胺。
药学上可接受的盐与衍生出这些盐的化合物相比，一般增加溶解度特性，因此经常更适于配制成液体或乳剂。
采用本领域公知的方法可制备药用制剂。例如，这些化合物可用普通赋形剂、稀释剂或载体来配制，形成片剂、胶囊剂、混悬液、粉剂等等。适于这样的制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括填料和增量剂，如淀粉、糖、甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；增湿剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；抑制溶解剂如石蜡；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、甘油一硬脂酸酯；吸附载体如高岭土和膨润土；以及润滑剂如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁和固体聚乙二醇。
这些化合物也可以配制成酏剂或溶液供方便的口服，或配制成溶液以适于非肠道使用，例如通过肌内的、皮下的、或静脉的途径。另外，这些化合物也适于配制成缓释剂型等制剂，这种制剂如此构成使得它们仅在或最好在肠道的一个特定部位并可能经过一段时间释放活性成分。也可例如用高分子物质或蜡制作包衣、外壳和保护基质。
在此公开的以及根据本发明为抑制结肠癌所需的或任何其它用途的式Ⅰ化合物的特定剂量将取决于疾病的严重程度，给药途径、和将由主治医师决定的相关因素。一般地，可接受的且有效的每日剂量是从大约0.1至大约1000毫克/天，更典型地是从大约50到大约200毫克/天。这种剂量给予需要它的受治疗者，从每天一次至大约三次，或当需要更有效地抑制结肠癌时，给予更频繁。
式Ⅰ化合物通常最好是以酸加成盐的形式使用，正如通常在给予含有碱性基团(如哌啶子基环)的药物中所做的那样。这样的化合物也有利于通过口的途径给予。为此目的，下列口服剂型是可用的。
制剂在下列制剂中，“活性成分”意指式Ⅰ化合物。制剂1明胶胶囊硬明胶囊用以下成分制备
将这些成分混合，通过一个No.45目U.S.筛，填入硬明胶胶囊。
制造特定的雷洛昔芬胶囊制剂的实施例包括下示制剂2雷洛昔芬胶囊
<claim>1、通式Ⅰ含全氟烷基的化合物RF-L-AⅠ其中RF是全氟化的、直链或支链的式-CnF2nX的烃链，这里X是终端的氟、氯、溴、碘或氢原子，n是4～30的数，L是直接的键、亚甲基基团、-NHCO-基团、或基团
这里，p是0～10的数，q和u相互独立的是数0或1和R1是氢原子、甲基基团、-CH2-OH基团、-CH2-CO2H基团或者C2-C15链，其需要时可被1～3个氧原子、1～2个＞CO基团或者一个取代或未取代的芳基基团中断，和/或被1～4个羟基基团、1～2个C1-C4-烷氧基基团、1～2个羧基基团或基团-SO3H取代，或者L是直链、支链、饱和或者不饱和的C2-C30烃链，其需要时可包含1～10个氧原子、1～3个-NR1基团、1～2个硫原子、哌嗪、-CONR1基团、-NR1CO基团、-SO2基团、-NR1-CO2基团、1～2个-CO基团、基团
或1～2个取代或未取代的芳基和<p>活性成分 0.1-1000纤维素，微晶 0-650锻制二氧化硅 0-650Stearate acid0-15将这些组分混合并压制形成片剂。
或者，每个含0.1-1000毫克活性成分的片剂用以下成分配制制剂7片剂成分 量(毫克/胶囊)活性成分 0.1-1000淀粉 45纤维素，微晶 35聚乙烯吡咯烷酮 4(以10％水溶液)羧甲基纤维素钠 4.5硬脂酸镁 0.5滑石 1将活性成分、淀粉和纤维素通过一个No.45目U.S.筛并完全混合，产生的粉末与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，再通过一个No.14目U.S.筛，这样产生的颗粒于50-60℃干燥，通过一个No.18目U.S.筛。羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，事先通过一个No.60目U.S.筛，然后加到颗粒中，混合后，在压片机上压制生产片剂。
每5毫升剂量含0.1-1000毫克药物的混悬液，按如下方法配制制剂8混悬液成分 量(毫克/胶囊)
活性成分 0.1-1000mg羧甲基纤维素钠 50mg糖浆 1.25mg苯甲酸溶液 0.10mL增香剂 适量色素 适量纯水至 5mL药物通过一个No.45目U.S.筛并同羧甲基纤维素钠和糖浆混合，形成调匀的糊剂。苯甲酸溶液、增香剂和色素用一些水稀释并加入，同时搅拌，加入充分的水至要求的体积。
纤维性肿瘤罕见纤维性起源的非转移肿瘤。临床上相关的意见是，在这类肿瘤自然的历史中，类固醇激素可能有一个作用它在分娩年龄的女性病人中显著地被见到，且这些肿瘤的退化与绝经或与抗雌激素治疗有联系。
这个工作的目的是识别在纤维性肿瘤原代细胞中的雌激素受体，并评价式Ⅰ化合物在原代培养的纤维细胞中的作用。
因为有时纤维性肿瘤在家族性腺瘤息肉病(FAP)的病人中发生，在结肠或直肠癌中它可发生退化，我们已检测到化合物Ⅰa对腺癌细胞系(HCT8)和从结肠癌活检标本中来的成纤维细胞的细胞生长的抑制作用。
化合物Ⅰa是式Ⅰ的一个化合物，其中R2是吡咯烷基，R1和R3是氢。
结合研究是用完整细胞完成。纤维细胞被接种到6孔板上的生长培养基中(Coon’s修改的Ham’s F12补充10％FCS)。24小时后，用没有酚红的稳态培养基取代生长培养基，细胞在饥饿中维持24小时。然后用含25毫摩尔HEPES和0.5％EtOH(结合缓冲液)的1亳升无酚红培养基和浓度增加(0.05-10nM)的[3H]17βE2以及化合物Ⅰa孵育细胞1小时，浓度增加的[3H]17βE2。含或不含超500倍量的未标记17βE2。孵育后，细胞用800μl结合缓冲液洗2次并用1N NaOH在70℃溶解30分钟。然后对每个孔加入4N HCl中和。用液体闪烁分光术测定放射活性。通过Scatchard分析评价ER结合亲和力和结合能力。
所有随后的步骤均在0-4℃完成。研碎的组织在一个polytron匀浆器中以2次10秒破裂匀浆，在下列缓冲液中，通过30秒冷却过程分离，10mM Tris-HCl、5mM EDTA、10mM钼酸钠、10mM二硫苏糖醇、10％甘油(v/v),pH 7.4。匀浆液以7000g离心20分钟，弃去沉淀，上清液于10500g再离心60分钟得到细胞溶质进行雌激素受体分析。将细胞溶质稀释至1-2毫克蛋白质/毫升，细胞溶质蛋白根据Brodford的方法确定。为了评价雌激素受体，在浓度范围0.05-5nM的[3H]17βE2和化合物Ⅰa上于40℃孵育细胞溶质16小时，[3H]17βE2含有或没有超过500倍量的未标记17βE2。通过Scatchard分析评价ER结合亲和力和结合能力。
细胞以8×104细胞的密度接种于6孔板的生长培养基中，24小时后，在没有酚红、补充了0.1％DMF、0.1％EtOH和不同浓度的化合物Ⅰa(2×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M)的生长培养基中刺激细胞。
细胞培养6天，用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液分离细胞，然后通过显微镜下计数来评价生长。同样的方法用于结肠癌原代成纤维细胞系和HCT8细胞系这个细胞系在RPMI培养基中培养、刺激后孵育4天。
用酶联免疫测定法(ELISA)测定培养基中的Ⅰ型胶原和细胞层。简短地说，细胞于无补充物的Coon’s修改的Ham F12培养基中孵育24小时，该培养基含50μg/ml抗坏血酸和100μg/mlβaminopropionitryl fumarate。
收获培养基并适当地稀释在0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中，然后用来包被ELISA平板，4℃过夜，ELISA平板在含5％奶粉的PBS中(PBS Blotto)37℃孵育1.5小时以饱和非特异结合位点，与含特异多克隆抗体的PBS Blotto于37℃孵育2小时，在含羊抗兔IgG-碱性磷酸酶结合复合物(Sigma Chemical Co.,St Louis,MO)的PBS Blotto中37℃孵育1.5小时。
然后以50μg/ml Mg++和1mg/ml对硝基苯磷酸盐作为碱性磷酸酶的底物将样品室温下暴露于10％二乙醇胺(pH9.8)中。读405nm处的光密度，并在标准曲线的基础上计算浓度。单层细胞收获在0.5NNaOH中，并用超声处理以决定细胞的胶原类型Ⅰ。然后将细胞抽提物稀释到0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中(pH9.6)，并用于ELISA平板的包被。以一式三份分析标准品和样品，结果用微克蛋白质/微克细胞DNA表示，DNA含量用荧光分光法测定。
结合实验是在原代纤维性肿瘤细胞和纤维性肿瘤的冰冻标本中用[3H]17βE2作为配体来完成。
在两个实验中，用超过500倍量的未标记雌激素和化合物Ⅰa少量地(约10％)置换[3H]17βE2。采用计算机结合程序LIGAND(MunsonP.J.,Rodbard D.Anal.Bioehem.1980；107:220-39)Scatchard分析的[3H]17βE2结合数据显示在三个不同的培养物中和在二个不同的从纤维性肿瘤活检标本来的细胞溶质制品中均存在ER。
在生长测定中，当暴露于不同浓度的化合物Ⅰa中时刺激纤维性肿瘤原代细胞，结果为随化合物Ⅰa的浓度增加细胞生长抑制(表1)。HCT8细胞系(表2)和结肠癌成纤维细胞系(表3)获得同样的结果。
纤维性细胞在10-5M、5×10-6M、10-6M的浓度下，以剂量依赖方式被抑制，它的最大抑制效应在10-5M浓度(表4)。
化合物Ⅰa仅在非常高的浓度下(超过500倍量)能取代17βE2结合于纤维性组织。
化合物Ⅰa能以微摩尔浓度显著地抑制纤维性细胞增殖。另外，在同样的浓度，这个化合物能抑制人类结肠癌来源的上皮和成纤维细胞的增殖。
用化合物Ⅰa，在纤维性细胞的原代培养中也显著地减少了Ⅰ型胶原产生。
在所有测试的条件下(电穿孔、Ca/p沉淀、脂质体(Lyposomes))，用雌激素应答因子转染纤维性细胞，细胞都被破坏，结果不适于“在体外”分析。
表1化合物Ⅰa(Mol/L) 细胞×10-4对照 12.32.10-50.110-52.85.10-67.010-610.0表2化合物Ⅰa(Mol/L)细胞×10-4对照 1502.10-5310-5715.10-6115表3化合物Ⅰa(Mol/L)细胞×10-4对照 7.62.10-50.110-55.45.10-66.310-67.6表4DNA DNA胶原 胶原 P值(O:D.) (μg) 类型Ⅰ 类型Ⅰ(pg/孔)(μg/μg DNA)对照 4.85±0.32 1.36±0.06 47.82±4.15 35.00±1.41化合物Ⅰa 1μM 8.20±0.23 1.97±0.05 43.78±5.23 22.00:±1.46 P＜0.005化合物Ⅰa 5μM 6.90±0.50 1.85±0.24 38.01±6.24 20.50±0.61 P＜0.005化合物Ⅰa10μM 7.90±1.46 1.96±0.29 35.16±2.44 18.00±1.41 P＜0.00权利要求
1．一种抑制结肠癌的方法，包括将有效量的下式化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物给予需要它的哺乳动物，
其中R1和R3独立地为氢、-CH3-、
烷基)、或
，其中Ar是可任选取代的苯基；R2是选自吡咯烷基、六亚甲基亚氨基、和哌啶子基。
2．权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
3．权利要求2的方法，其中所述化合物是其盐酸盐。
4．权利要求3的方法，其中所述化合物是下式化合物或其盐酸盐。
全文摘要
一种抑制结肠癌的方法,包括将有效量的式(Ⅰ)化合物或药学上可接受的盐或其溶剂合物给予需要它的哺乳动物,在式(Ⅰ)中,R
文档编号A61K31/4025GK1209745SQ97191791
公开日1999年3月3日 申请日期1997年1月27日 优先权日1996年1月29日
发明者M·L·布兰迪, F·托内利 申请人:伊莱利利公司