包含钙流入阻滞剂用于抑制细胞生长的组合物的制作方法

专利名称：包含钙流入阻滞剂用于抑制细胞生长的组合物的制作方法
技术领域：
本发明描写的特征是用Ca2+流入阻滞剂诱导受刺激细胞死亡，包括治疗增生性疾病的方法。发明背景癌治疗的目标在很大程度上是消除或控制癌细胞的生长，同时不损伤正常组织。因此，已经将相当的注意力置于使癌细胞区别于正常细胞的特征的鉴定上，特异性治疗剂导向的目标是这些差异。
细胞的有序生长和发育在很大程度上受可溶性分泌配基和受刺激细胞表面上的特异性受体之间相互作用控制(Cell,61:203-12)。并非意外的是，在正常和异常生长刺激之间这些情况的密切关系下，已知大量生长因子及其受体在控制细胞生长中起重要作用，它们是已知的原癌基因，包括neu、EGFR(v-erb-b)、c-fms(CSF-1R)和c-kit。由于生长因子及其受体通常参与肿瘤细胞的形成和/或保持，因此这些分子可以被认为是目的在于抵销或中和它们的刺激活性的特异性治疗的有效靶。
c-kit受体是不当表达或突变与大量肿瘤相关的一个实例。c-kit除了通常在骨髓性白血病中表达(Siitonen等，1994)外，也在高比例的小细胞肺癌(Hida等，1994)、雌性生殖道肿瘤(Inoue等，1994)和乳腺癌(Hines等，1995)中发现c-kit。在这些情况中的许多情况下，肿瘤细胞既表达c-kit也表达SLF，导致引起致瘤性的自分泌刺激。并且，在人、小鼠和大鼠来源的肥大细胞瘤中已经鉴定出c-kit中一个普通的显性激活突变(Tsujimura等，1994；Tsujimura等，1995；Kanakura等，1994；kitayama等，1995)。
在许多形式的癌中，显性转化癌基因和肿瘤抑制基因功能的丧失密切相连。例如，几个研究已经记载了原发的乳腺癌细胞中生长因子受体的突变、不当表达、超量表达和自分泌刺激(Lupu等，1992；Ethier,1995；LeJeune等，1993)。因此，许多研究人员正采取特异性导向这些分子的创新方法(Kopreski等，1996；Fry等，1995；Levitzki等，1995)。也很清楚，肿瘤抑制基因功能的丧失可能通过形成不再服从细胞死亡生理机制的细胞，促使癌细胞的形成。在乳腺癌中也已经广泛地记载了肿瘤抑制基因功能的丧失(Horak等，1991；Thor等，1992；Wang等，1993；Bargou等，1995；Krajewski等，1995；Lee,1995)。肿瘤抑制基因功能丧失的一个重要结果可能是对常规形式抗癌治疗的抗性(Lu等，1996；Korsmeyer,1995)。
目前大量的抗增生剂用于癌的治疗中。对于大多数而言，将其设计为特异性地作用于快速分裂的细胞。然而，由于细胞分裂在机体许多细胞类型中是正常发生的，因此常常观察到对正常组织的毒性，限制了这些药剂的有用性和效力。
用相似的方式，异常或过量的细胞激活和增殖是许多炎性状态的特征。例如，自身免疫性疾病代表免疫系统的细胞识别该患者中存在的自身抗原并对其应答的情境。目前的治疗倾向于以非特异性方式减弱免疫细胞的应答，导致可能对感染敏感和其它不想要的结果。
变态反应性疾病代表另一种情境，这里不当的激活信号导致显著的发病率。
因此在这些和其它情境下，需要对特定生长或激活信号应答的细胞特异性更强的治疗。
Ca2+从胞内贮藏所迁移出，然后胞外Ca2+通过贮藏-操作通道(也称为lcrac通道)流入(Hoth等，1992；Hoth等，1993；Penner等，1993)是由许多生长因子、抗原、Fc和G-蛋白连接受体引发的一般信号传递事件。该信号是各种同型磷脂酶C(PLC)激活的结果，导致第二信使IP3和二酰甘油的生成(Rhee,1991)。在包括有丝分裂发生、激活和细胞运动在内的多种细胞过程中涉及这种胞内Ca2+的快速上升随后逐渐下降(Lewis等，1995)。
尽管Ca2+流入已经与多种细胞类型中的细胞凋亡或程序性细胞死亡相连，但尚不理解细胞凋亡中Ca2+流入的精确作用(Orrenius等，1992；Nicotera等，1994；Dowd,1995)。已经表明，诸如由Ca2+离子载体诱导的过高的胞内Ca2+浓度在大量试验系统中诱导细胞凋亡(Kizaki等，1989；Tadakuma等，1990)。脾细胞中的细胞凋亡似乎涉及Ca2+依赖性核酸内切酶(Ribeiro等，1993)，而胞内Ca2+的增加已与激活T细胞杂交瘤(Mercep等，1989)和未成熟胸腺细胞(McConkey等，1989)两者的细胞凋亡相连。最近，Takata等(Takata等，1995)指出，在缺乏PLC-γ的情况下，表面IgM介导的B细胞细胞凋亡降低，将该形式的细胞凋亡与Ca2+迁移相连。与这些观察相反，Ca2+的流入似乎保护某些细胞免于细胞凋亡。例如，加入Ca2+离子载体保护IL-3依赖性肥大细胞和细胞系免于去除生长因子介导的细胞凋亡(Rodriguez Tarduchy等，1992)，胞内Ca2+的增加也抑制程序性神经元死亡(Lampeet等，1995)。
已经鉴定出既介导对细胞凋亡正作用也介导对其的负作用的某些蛋白。Bcl-2是原型为线虫(C.elegans)ced-9的相关蛋白家族中的一员(Reed,1994)。尽管一类家族成员(包括Bcl-2)保护细胞抵抗细胞凋亡信号，而另一类(包括bax，该家族的一个原细胞凋亡成员)则促进细胞凋亡。已经提出，这两类之间的平衡决定细胞是细胞凋亡性死亡还是存活(Oltvai等，1993)。
Bcl-2蛋白的超量表达导致保护抵抗由种类繁多的药剂诱导的细胞凋亡，这些药剂包括辐射、化疗药物、氧化剂和类固醇(Korsmeyer,1995)。然而，其它细胞凋亡信号似乎对Bcl-2不敏感。这些包括由TNF、Fas激活、激活诱导的细胞死亡、WEHI-231细胞的抗IgM处理和超抗原介导的克隆缺失诱导的细胞死亡(Ashwell等，1987；Smith等，1989；Jones等，1990；Sentman等，1991；Brown等，1992；Cuende等，1993；Memon等，1995；Miura等，1995)。在某些情况下，已经证明这些细胞凋亡信号可能被蛋白酶的白介素-1β转化酶(ICE)家族的抑制剂中和，提示这些酶参与细胞凋亡(Enari等，1995；Chinnaiyan等，1996)。
已经报道了一种已知的Ca2+流入阻滞剂酮替芬在高浓度下抑制肥大细胞激活和单核细胞的增殖(Gushchin等，1985)。也已经表明，酮替芬可以用来控制神经纤维瘤中的肥大细胞相关症状(Riccardi等，1987；Riccardi等，1993)。也已经表明酮替芬有效地抑制全身性肥大细胞病的症状(Povoa等，1991)。已经表明酮替芬抑制T细胞对抗原的应答，但不抑制对PHA或破伤风类毒素的应答(Kondo等，1994)。已经报道了酮替芬可以抑制促细胞分裂剂刺激的淋巴细胞增殖(Petrasch等，1993)。高浓度的酮替芬也抑制T淋巴细胞有丝分裂和三磷酸腺苷分别刺激的淋巴细胞和U937人单核细胞前体细胞系中的胞内Ca2+增加。然而，在体内实验中，用1mg酮替芬每日两次处理健康志愿者7天，不改变循环淋巴细胞数目或亚群(subset)组合。
已经表明另一种Ca2+流入阻滞剂益康唑在1μg/ml下减低NS1/Ag4骨髓瘤细胞的细胞存活率和细胞数(Denyer等，1985)。
已经报道了具有Ca2+流入抑制剂活性的化合物CA1抑制肿瘤细胞的生长和对FGF应答的HUVECs的生长(Kohn等，1992；Kohn等，1994a；Kohn等，1994b)。
在美国专利4,690,935号(Taylor等，1987)中描述了用钙离子通道阻滞剂化合物抑制肿瘤生长和转移。在美国专利4,906,646号(Honn等，1990)中描述了给与钙离子通道阻滞剂化合物和铂协同化合物抑制肿瘤的生长和转移。
已经表明克霉唑在抑制体外细胞的增殖的浓度下从3T3细胞胞内贮藏所中释放Ca2+。发现克霉唑对Ca2+池的作用是可逆的。也发现克霉唑对由人黑素瘤细胞在SCID小鼠中产生的实验肺转移数具有抑制作用(Benzaquen等，1995)。发明概述本发明的一般特征为用Ca2+流入阻滞剂诱导受刺激细胞死亡。本发明在其各个方面包括给与诱导细胞死亡的组合物，包括给与哺乳动物(例如人)组合物以用于治疗；组合物，例如具有Ca2+流入阻滞剂和一种因子的组合物，其中该因子通常刺激待诱导细胞死亡的细胞；组合物试剂盒，例如具有Ca2+流入阻滞剂和一种因子的组合物，其中该因子通常刺激待诱导细胞死亡的细胞；这类组合物或组合物试剂盒作为抗炎剂和/或抗增生剂的用途；Ca2+流入阻滞剂或Ca2+流入阻滞剂与因子在用于诱导细胞死亡的药物制备中的用途。本发明包括诊断患病动物对用Ca2+流入阻滞剂或组合物治疗的敏感性以便该治疗可以诱导细胞死亡的方法，其中该组合物包含Ca2+流入阻滞剂与通常刺激细胞的因子。本发明包括筛选作为Ca2+流入阻滞剂的潜在化合物的方法。
在本发明的该方面，通常刺激细胞或细胞受体的药剂或因子或配基或其它激动剂是刺激该细胞或该受体的药剂或剂或因子或配基或激动剂。这种刺激一般促进该细胞的生长、存活和/或激活。换句话说，按照本发明，在受刺激细胞中实际上诱导细胞死亡。按照特定的下面描述其细节的实施例，在SLF存在下培养常受刺激的肥大细胞当在SLF和Ca2+流入阻滞剂的组合物存在下培养时诱导死亡。这种正常刺激一般伴随着Ca2+流入该细胞。
优选的Ca2+流入阻滞剂是非电压门控流入阻滞剂。
优选的治疗对象为人。
本发明的优选方法是在有需要的哺乳动物中诱导细胞死亡的方法，其中所述细胞能够用伴随有Ca2+流入的因子刺激，该方法包括给与哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的这种因子。
按照另一优选实施方案，在具有易受所述细胞伴随有Ca2+流入细胞的药剂受体的配基刺激的哺乳动物中，本发明为诱导所述细胞死亡的方法，包括给与哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的这种配基。
按照另一优选实施方案，本发明为诱导有需要的哺乳动物细胞死亡的方法，其中这一细胞具有一种受体，该受体在被药剂结合时，导致钙流入该细胞并激活磷脂酶C，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的这一药剂。
按照再一实施方案，本发明为诱导有需要的哺乳动物细胞死亡的方法，其中所述细胞能够被伴随有Ca2+流入的因子刺激，该方法包括给与该哺乳动物有效量的非电压门控Ca2+流入阻滞剂和有效量的这一因子。
该因子或该药剂可以例如为所述细胞受体的激动抗体或所述细胞受体的天然配基。
所述细胞可以是肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、嗜碱细胞或癌细胞。
该哺乳动物可能需要治疗增生性疾病，例如它可以是患癌、特别是乳腺癌的人，或该病人可能患变态反应或自身免疫障碍。
待诱导死亡的细胞(或细胞群)可以具有例如选自以下的一种表面受体c-kit受体或突变c-kit受体、T细胞受体、CD3、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FcεRⅠ、G-蛋白连接受体、韩蛙皮素受体、促胃液素释放肽受体、舒缓激肽受体、氨甲酰胆碱受体、蕈毒碱分子受体、CCK-8受体、后叶加压素受体、神经激肽受体、物质P受体、嘌呤能(purinergic)分子受体、TGF-α受体、EGF受体、heregulin受体、erbB1受体、erbB2受体、erbB3受体、erbB4受体、PDGF受体、SLF受体、FLT-3配基受体、碱性FGF受体、酸性FGF受体、enothelin受体、NGF受体、VEGF受体和HGF受体。
待给与所述细胞的药剂或因子可以选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
该细胞可以是超活性免疫细胞，该方法可以包括一种抗体，该因子可以例如是该抗体的抗原。该细胞可以是超活性免疫细胞，其中IgE与该细胞结合，而该因子可以例如是该IgE的激动剂。
该细胞可以包含IgE受体，而该因子可以是该受体的抗体。
所述细胞可以是嗜碱细胞或肥大细胞。
可以分别给与该Ca2+流入阻滞剂和该因子、配基等。
按照优选实施方案，在给与该药剂前给与该Ca2+流入阻滞剂。
按照另一优选实施方案，在单一步骤中给与该药剂/因子等和该Ca2+流入阻滞剂。
最好是，在缺乏Ca2+流入阻滞剂的情况下，用这一药物刺激所述细胞通常促进所述细胞生长、存活和/或激活。
在一特定的实施方案中，所述细胞表达c-kit受体，其中该方法包括给与该哺乳动物有效量的c-kit配基。
该病人可能患白血病、肿瘤生长或肺癌。
本发明的因子可以是与细胞受体结合的生长因子，该结合通常引起该细胞增殖。
该病人可能患癌或增生。
该因子可以是蛋白。
该因子可以是结合所述细胞受体的存活因子，在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，该结合通常增加该细胞的寿命。
按照特定实施方案，所述细胞为造血祖细胞。
该因子可以是与所述细胞受体结合的激活因子，在缺乏Ca2+流入阻滞剂的情况下，该结合通常引起该细胞的激活。
该Ca2+流入阻滞剂可以是任何一种或多种Ni2+、酮替芬、益康唑、tenidap、CA1、Cd2+、Co2+、La3+、Mn2+、SKF-96365和色甘酸以及它们的组合物。
按照特定的实施方案，本发明是诱导有需要哺乳动物的组成型激活细胞死亡的方法，包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂。最好是该激活导致所述细胞中的Ca2+浓度高于未激活状态时的水平。该组成型激活可以是存在突变c-kit受体的结果。该病人可以患肥大细胞病。
按照另一实施方案，本发明是诱导有需要哺乳动物细胞死亡的方法，其中所述细胞易受自分泌刺激，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂。该Ca2+流入阻滞剂可以是Ni2+。
按照另一实施方案，本发明是作为抑制细胞生长的抗增生剂给与哺乳动物的药用组合物，它包含Ca2+流入阻滞剂和一种因子，该因子通常与所述细胞受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。
该组合物可以是这样一种组合物，其中这一因子与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。该组合物可以包含Ca2+流入阻滞剂，后者为非电压门控Ca2+流入阻滞剂。该因子可以是该受体的激动抗体。该因子可以是该受体的天然配基。该因子可以选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1激动剂、erbB2激动剂、erbB3激动剂、erbB4激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。在特定的实施方案中，该组合物包括SLF作为因子。
组合物可以包含免疫细胞表面抗体的抗原。
该组合物可以包含为IgE激动剂的因子。
该组合物可以包含一种因子，在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述因子与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
按照另一方面，本发明为用于抑制哺乳动物细胞生长的药用组合物试剂盒，该试剂盒包含Ca2+流入阻滞剂和一种因子，该因子通常与所述细胞受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。该因子可以是这样一种因子，它与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。
该Ca2+流入阻滞剂可以是非电压门控Ca2+流入阻滞剂。
该组合物的因子可以是该受体的激动抗体。该因子可以是该受体的天然配基。该因子可以选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1激动剂、erbB2激动剂、erbB3激动剂、erbB4激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。特别是，该因子可以是SLF。
该因子可以是免疫细胞表面抗体的抗原。
该因子可以是IgE的激动剂。
该因子可以是这样一种因子，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，它与该受体的结合促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
在另一实施方案中，本发明包括本发明药用组合物作为抗增生剂或抗炎剂的用途。
本发明药用组合物的试剂盒可以相应地用作抗增生剂或用作抗炎剂。
本发明包括Ca2+流入阻滞剂和一种因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中该因子通常与细胞的受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。
本发明包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。
本发明包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述Ca2+流入阻滞剂为非电压门控Ca2+流入阻滞剂。
按照特定实施方案，本发明包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为该受体的激动性抗体。
特定实施方案包括本发明的Ca2+流入阻滞剂和因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为该受体的天然配基。
特定实施方案包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1激动剂、erbB2激动剂、erbB3激动剂、erbB4激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。特别是，该因子可以是SLF。
优选实施方案包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为免疫细胞表面抗体的抗原。
优选实施方案包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抑制所述细胞生长药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为IgE的激动剂。
另一实施方案包括Ca2+流入阻滞剂和本发明因子在用作抗增生剂的药物制备中的用途，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述因子与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
按照另一实施方案，本发明为诊断患病哺乳动物细胞对用Ca2+流入阻滞剂或阻滞剂与进一步激活所述细胞受体的因子治疗的敏感性的方法，该方法包括分析组织样品是否含有高于正常组织水平的PLC活性；其中较高水平的激活PLC表明所述细胞可能对所述治疗敏感。
这一方法也可以包括获得患病组织样品。
该方法还包括一个分析步骤，其中包括监测PLC底物的量，该底物在得自预定量所述组织中的PLC存在下进行反应。该方法也可以包括通过酶联免疫吸收分析，从预定量的所述组织中分离PLC。该PLC底物可以是[3H]-PIP2。
在另一实施方案中，本发明是作为Ca2+流入阻滞剂的药剂的筛选方法，该方法包括以下步骤在该药剂存在下培养第一组细胞，其中所述细胞具有促进Ca2+流入所述细胞的激活受体；在该药剂存在下培养第二组细胞，其中第二组细胞缺乏促进Ca2+流入第二组细胞的激活受体；确定第一组细胞的生长是否低于对应于在缺乏该药剂的情况下第一组细胞生长的第一预定水平；以及确定第二组细胞的生长是否与对应于在缺乏该药剂的情况下第二组细胞生长的第二预定水平大致相等；其中第一组细胞的生长低于第一预定水平，而第二组细胞的生长与第二预定水平大致相等，表明所述药剂为Ca2+阻滞剂。
第一组细胞的受体可以是组成型激活的，或第一组细胞的受体易受自分泌刺激，或第一组细胞的受体被外源药剂激活。
该药剂可以是第一组细胞受体的天然配基。第一组细胞的受体和第二组细胞的受体可以是同一受体。
在特定实施方案中，该受体选自c-kit受体、EGF受体和FGF受体。
第一组细胞和第二组细胞最好是人细胞。
最好是，第一组细胞为肥大细胞，第二组细胞为肥大细胞，该受体为c-kit受体，并且在SLF存在下培养第一组细胞。
按照特定实施方案，用第一组细胞的所述受体转染第一组细胞。附图简述

图1A-1F表明通过生长或激活信号与Ca2+流入阻滞剂的组合在BMMC中诱导死亡。按照材料和方法中描述的方法进行细胞毒性分析。在图1A-1C中，BMMC或者与SLF(在所有情况下都为500ng/ml)(圆圈)或者与IL-3(在所有情况下都为25％WEHI-3条件培养基)(方框)以及指示量的酮替芬(图1A)、益康唑(图1B)或Ni2+(图1C)一起培养。在图1D中，BMMC与IL-3以及指示量的SLF一起培养。绘制的圆圈也包含2.5mM Ni2+，而绘制的方框不含Ni2+。在图1E中，BMMC涂有IgE抗DNP单克隆SPE-7，然后与IL-3加指示量的DNP-HSA(Ag)以及5μM益康唑(圆圈)或无益康唑(方框)一起培养。在图1F中，BMMC与IL-3加指示量的物质P以及5μM益康唑(圆圈)或无益康唑(方框)一起培养。在所有情况下，在培养24小时后，通过数可以排斥台盼蓝或不可以排斥台盼蓝的细胞，测定死亡细胞的比例。误差条线表示由三次重复测定确定的标准误差。
图2A和2B显示在32D-kit中或p815细胞中用SLF加Ca2+流入阻滞剂诱导细胞死亡。32D-kit(图2A)或p815(图2B)细胞或者与SLF(实心条带)或者与IL-3(条纹条带)加指示浓度的Ca2+流入阻滞剂一起培养。培养18小时后，通过台盼蓝排染确定细胞死亡。
图3A-3E显示与各种因子和Ca2+流入阻滞剂一起培养的32D-kit细胞的形态学。32D-kit仅与SLF(图3A)、仅与IL-3(图3B)、与5μM益康唑和SLF(图3C)或与5μM益康唑和IL-3(图3D)一起温育18小时(图3D)。在图3E中，所述细胞不加入因子培养。细胞在相衬下放大400×拍照。
图4显示作为细胞DNA含量函数的32D-kit细胞(y轴)相对数的曲线图。32D-kit仅与SLF(图4A)、仅与IL-3(图4B)、在8μM益康唑和SLF中(图4C)或在8μM益康唑和IL-3(图4D)中一起温育18小时(图3D)。在图4E中，不加入任何因子培养细胞。细胞如材料和方法中所述，用碘化乙锭(propidium iodide)染色，然后用流式细胞仪分析DNA含量。
图5显示油酸保护32D-kit细胞免于由SLF和Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡。32D-kit细胞与SLF和5μM益康唑和油酸(实心条带)、或与SLF和5μM益康唑和反油酸(影线条带)、或与IL-3和5μM益康唑和油酸(打点条带)一起培养18小时。通过台盼蓝排染确定死亡细胞的比例。
图6A和图6B显示离子霉菌素对SLF和Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡的作用。在图6A中，32D-kit细胞在或者SLF(圆圈)或者IL-3(方框)存在下与5μm益康唑和指示量的离子霉菌素一起培养。在图6B中，32D-kit-Bcl-2细胞与5μm益康唑和指示量的离子霉菌素一起，在或者SLF(圆圈)或者IL-3(方框)存在下培养18小时。通过台盼蓝排染确定死亡细胞的比例。
图7A显示32D-kit(第1泳道)或32D-kit-Bcl-2(第2泳道)细胞的细胞裂解液的Western印迹。如材料和方法中所述裂解细胞，通过SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维素膜，然后用抗Bcl-2抗体探测。
图7B显示Bcl-2超量表达对由SLF加Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡的作用。32D-kit(实心条带)或32D-kit-Bcl-2(条纹条带)细胞与SLF或IL-3加2.5μM、5μM或10μM益康唑一起培养18小时，然后通过台盼蓝排染确定死亡细胞的比例。在另一培养中，单独加入IL-3或不加入任何因子，同样测试细胞存活率。在不加入额外因子的单独的培养物中，也评价加入25μM和250μM YVAD-CHO对细胞存活率的作用。
图8显示YVAD-CHO对SLF和Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡的作用。32D-kit细胞或者在缺乏YVAD-CHO的情况下与SLF(圆形)、或者在25μM YVAD-CHO存在下与SLF(三角形)、或与IL-3以及指示量的益康唑一起培养。培养18小时后，通过台盼蓝排染评价死亡细胞的比例。
图9A显示在具有连续激活受体的癌细胞中由Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡。在96孔板中，将2.5×104SK-BR3细胞(ATCC分类号为HTB-30)在0.1ml RPMI加0.5％FBS与(圆形)或不与(方框)10ng/mlEGF(表皮生长因子)以及指示浓度的益康唑中培养18小时。培养18小时后，通过台盼蓝排染评价死亡细胞的比例。
图9B显示在自分泌刺激的MDA-MB-231乳腺癌细胞中，在各种条件下由Ca2+阻滞剂诱导的细胞凋亡。条带1对照；条带2:20μM益康唑；条带3:20μM益康唑和100μM YVAD-CHO(ICE抑制剂)；条带4:20μM益康唑和100μM YVAD-CHO；条带5:20μM益康唑和0.1nM离子霉菌素(钙离子载体)；条带6:20μM益康唑和10nM离子霉菌素；条带7:20μM益康唑和1μM离子霉菌素；条带8:20μM益康唑和10μM油酸(PLC激活抑制剂)和条带9:20μM益康唑和100μM油酸。
图10显示在得自人乳腺癌的细胞中由EGF和Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡。在96孔板中，将2.5×104MCF-7细胞在0.1ml DMEM加0.5％FBS与(圆形)或不与(方框)10ng/ml EGF以及指示浓度的益康唑中培养18小时。培养18小时后，通过台盼蓝排染评价死亡细胞的比例。
图11A显示在静脉注射SLF的小鼠中Ca2+流入阻滞剂和激活因子对白血病细胞的作用。给小鼠静脉接种1×107G418抗性32D-kit细胞。接种后3-5周(实验1和3:5周，实验2:3周)，通过经口管饲法给与小鼠100mg/kg酮替芬。酮替芬处理4小时后，给小鼠静脉注射15μg SLF。2小时后，经口给与该小鼠另一份100mg/kg酮替芬。第二天，取出脾，通过将细胞在0.3％琼脂生长培养基中铺平板，分析白血病细胞的存在，该培养基含20％WEHI-3条件培养基和1mg/mlG418，以限制G418抗性白血病细胞的检测。7天后，计算集落。
图11B与图11A相似，但在这种情况下，分析脾细胞在琼脂中包括白血病细胞以及正常细胞在内的能够对IL-3应答形成集落的细胞的存在。
图12显示在皮下注射SLF的小鼠中Ca2+流入阻滞剂和激活因子对白血病细胞的作用。给小鼠静脉接种1×10732D-kit细胞。接种3周后，通过经口管饲法给与小鼠100mg/kg酮替芬。酮替芬处理4小时后，小鼠皮下注射15μg SLF。该注射2小时后，再经口给与小鼠100mg/ml酮替芬。第二天，取出脾，通过将细胞在0.3％琼脂生长培养基中铺平板，分析白血病细胞的存在，其中该生长培养基含有20％WEHI-3条件培养基和1mg/ml G418，以限制G418抗性白血病细胞的检测。7天后，计算集落数。优选实施方案的描述材料和方法细胞.如先前所述(Berger等，1994)，产生骨髓起源肥大细胞(BMMC)。将它们在添加10％热失活FBS和作为IL-3源的2％WEHI-3上清液的OPTI-MEM(Gibco,Burlington,ON)中培养。32D-kit细胞(Mark Minden博士的赠品，Ontario Cancer Institute)是表达c-kit的IL-3依赖性髓单核细胞细胞系(Hu等，1995)。让32D-kit细胞在添加10％热失活FBS、2％WEHI-3上清液和1mg/ml G418(Gibco)的RPMI(Gibco)中生长。p815细胞系为鼠肥大细胞瘤细胞系。让P815细胞在添加10％热失活FBS的RPMI中生长。让Bcl-2gp+e NIH 3T3包装细胞在Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM-Gibco)中生长，并添加10％FBS和2μg/ml嘌呤霉素(Sigma,St.Louis,Mo)。所有的细胞培养物也都含有55μMβ-巯基乙醇和抗体(都得自Sigma)。SK-BR3、MDA-MB231和MCF-7细胞都得自ATCC。在添加10％热失活胎牛血清的RPMI培养基中培养SK-BR3和MDA-MB231细胞。在添加10％热失活胎牛血清和10μg/ml人胰岛素(Sigma)的DMEM培养基中培养MCF-7细胞。
超量表达Bcl-2的32D-kit细胞的产生.gp+e bcl-2逆转录病毒生产细胞为Y.Ben-David博士(Toronto)的赠品，含有表达嘌呤霉素抗性基因和鼠bcl-2基因的LXSN基逆转录病毒载体。对于感染，gp+e包装细胞的会合层与32D-kit细胞共培养24小时。然后取出非粘附32D-kit细胞，培养48小时，然后在2μg/ml嘌呤霉素存在下筛选超量表达bcl-2的细胞。
重组SLF的生产.在大肠杆菌中，采用IPTG诱导型分泌表达载体pFLAG.ATS(InterScience,Markham,ON)，以可溶性形式生产重组鼠Steel因子(SLF)。该载体包含一个8个氨基酸N-末端的FLAG表位(InterScience)。将含有该pFLAG.ATS.SLF质粒的大肠杆菌于37℃在具有100μg/ml氨苄青霉素(Sigma)的Luria液体培养基(Gibco)中培养过夜。然后，将该培养物稀释20倍，让其生长至OD600为0.4-0.5，然后用33mg/L IPTG(Gibco)诱导。然后将培养物于37℃培养过夜，将所述细胞以10,000rpm沉淀20分钟。将该细菌上清液通过0.22微米滤器，用1mM CaCl2和100μM PMSF贮存于-80℃。在共价连接到琼脂糖凝胶的抗FLAG M1鼠单克隆抗体柱(InterScience)上亲和纯化FLAG-SLF。该单克隆抗体以Ca2+依赖性方式结合该FLAG表位，使得能够通过用EDTA螯合过量的Ca2+进行洗脱。该柱首先用30ml PBS+1mMCaCl2平衡，然后将细菌上清液通过该柱3次。该柱用PBS+1mM CaCl2彻底洗涤，用6等份1ml PBS+2mM EDTA洗脱FLAG-SLF融合蛋白。收集这些蛋白，将其浓缩，对PBS透析，然后通过银染检查其纯度。
其它试剂.单克隆鼠二硝基苯基(DNP)-特异性IgE、克隆SPE-7以及白蛋白-人DNP-HSA抗原得自SIGMA。物质P、所有的Ca2+通道阻滞剂、离子霉菌素、油酸和反油酸、EGF和bFGF也得自Sigma。离子霉菌素以DMSO中的1mM溶液贮存于-20℃。油酸和反油酸贮存在脱气乙醇溶液中，浓度分别为1M和100mM，在氮气源下密封，并贮存于-20℃。YVAD-CHO ICE蛋白酶抑制剂肽得自Amersham(Arlington Heights,IL)，并作为DMSO中的1mM溶液贮存于-20℃。
细胞死亡检定.在96孔平底板中，将2.5×104BMMC、32D-kit细胞或P815细胞在含0.5％FBS的0.1ml体积的RPMI中铺平板。细胞添加SLF、物质P或IL-3以及Ca2+通道阻滞剂。加入IgE时，细胞与10μg/ml SPE-7一起于4℃温育45分钟，然后用RPMI、0.5％FBS洗涤3次，然后在96孔板中铺平板，并加入10ng/ml DNP-HSA。培养18或24小时后，通过计数能够或不能够排斥台盼蓝的细胞数，确定死亡细胞的比例。
DNA含量分析.1.25×106细胞如上述培养18或24小时。将细胞离心，重悬浮于Vindelov试剂中3.4mM Tris-pH8、75μM碘化乙锭(得自Sigma)、0.1％NP-40、700μ/l RNA酶(Sigma)和10mMNaCl。然后用流式细胞仪分析细胞。
Western印迹分析将1×10632D-kit和32D-kit-bcl2细胞在PBS中洗涤，并重悬浮于含有1％NP-40、10％甘油并具有以下抑制剂的TBS裂解缓冲液中500μM原钒酸钠、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮抑酶肽和1mM PMSF(都得自Sigma)，于4℃温育20分钟。将裂解液以12,000rpm离心10分钟，将该上清液加入等体积具有β2-巯基乙醇的样品缓冲液中。通过12％SDS-PAGE分离样品，然后将其转移至硝酸纤维素膜上。用含5％脱脂奶粉、0.1％TWEEN-20(ICN,Aurora OH)的PBS封闭该印迹，并用抗bcl-2抗体(U.B.I.,Lake Placid,NY)探测。用化学发光试剂(Amersham)将该Western印迹显影。
小鼠.对于体内32D-kit实验，小鼠为6-8周龄的雄性C3H/he小鼠，得自Charles River实验室，波士顿，麻省。给小鼠静脉接种1×107白血病细胞。接种后3-5周，通过经口管饲法给与小鼠0.1ml体积水中的100mg/kg酮替芬(Sigma)。第一次酮替芬处理后，给小鼠静脉注射或皮下注射含15μg SLF的PBS。第二次酮替芬处理后，给与SLF。实验1Ca2+通道阻滞剂将激活信号转化为死亡信号。
C-kit受体酪氨酸激酶配基SLF通常刺激肥大细胞增殖。然而，如图1A-C中所示，如果所述细胞与Ca2+流入阻滞剂(诸如酮替芬、益康唑或Ni2+)一起温育，则该增殖信号转化为死亡信号。相反，当肥大细胞与Ca2+流入阻滞剂和IL-3一起温育时，则观察不到死亡。将肥大细胞与SLF、Ca2+流入阻滞剂和IL-3同时温育导致细胞死亡(图1D)，表明IL-3对该特定死亡信号不是保护性的。由于去除生长因子或存活因子，Ca2+流入阻滞剂本身不促进肥大细胞死亡(未显示)。SLF加Ca2+流入阻滞剂诱导细胞死亡随SLF浓度的增加而增强。这表明有一信号传递性质与SLF相关，但与IL-3无关，这需要与阻滞剂结合诱导该形式的细胞死亡。该Ca2+流入阻滞剂的作用不是简单地抵销或中和SLF的刺激性质。相反，阻滞剂与SLF产生的关键信号结合，将激活路径转化为细胞死亡路径。
尽管SLF和IL-3都是肥大细胞的促细胞分裂剂，但只有SLF诱导Ca2+流入(Columbo等，1994；Rao等，1994)。因此研究了已知肥大细胞中迁移Ca2+的两种信号对细胞存活率的作用。IgE的高亲和受体与抗原的交联引发一系列信号传递事件，包括PLC-γ激活和Ca2+迁移，这导致肥大细胞去颗粒(Jouvin等，1995)。图1E显示在Ca2+流入阻滞剂存在下用Ag加IgE刺激肥大细胞对细胞存活率的作用。如图所示，当在益康唑存在下用IgE加抗原刺激肥大细胞时，诱导细胞死亡，而单独的抗原或单独的益康唑刺激则对细胞存活率无作用。Ni2+和酮替芬也与IgE受体混合交联，诱导细胞死亡(未显示)。
肥大细胞也对诸如物质P之类的两亲阳离子肽应答(Bueb等，1990；Mousli等，1990)。这些分子直接刺激异源三聚G-蛋白，导致PLC-β激活、Ca2+迁移，以及在次优浓度的抗原加IgE存在下，导致肥大细胞去颗粒。如图1F所示，当在益康唑存在下用物质P刺激肥大细胞时，也诱导细胞死亡。关于SLF，在Ca2+流入阻滞剂存在下，细胞死亡的程度随Ag或物质P浓度的增加而增加。由于这三种信号(但不是IL-3)全都使Ca2+迁移，导致Ca2+流入，因此可能Ca2+迁移是与Ca2+流入阻滞剂结合诱导细胞死亡的所需信号。
也在非肥大细胞的细胞中检查通过激活信号和Ca2+流入阻滞剂的结合细胞死亡的诱导。32D细胞为除去因子时细胞凋亡性死亡的c-kit阴性、IL-3依赖性髓单核细胞(Baffy等，1993)。在这些细胞中，c-kit的转移和表达使得它们在体外对SLF应答，赋予它们体内致瘤性(Hu等，1995)。如图2A所示，c-kit的表达使得这些细胞对SLF和Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞死亡敏感。
已经描述了大量不依赖因子的肿瘤由于生长因子受体的组成型激活或自分泌刺激而被转化。不依赖因子的肿瘤的一个实例是肥大细胞瘤p815，它由于存在突变的组成型激活的c-kit受体而在缺乏加入的因子时生长(Tsujimura等，1994)。如图2B所示。在缺乏加入的SLF刺激物的情况下，在p815中单独的Ca2+流入阻滞剂足以诱导细胞死亡。这可能反映出通过该p815c-kit受体的信号传递的不依赖配基的性质以及因此与Ca2+流入阻滞剂结合诱导细胞死亡的能力。这些结果表明，SLF加Ca2+流入阻滞剂诱导细胞死亡不限于肥大细胞，而是可以在其它细胞类型中以及特别是具有高度激活受体的那些细胞中观察到。实验2BMMC和32D-kit诱导的死亡为细胞凋亡用SLF和Ca2+流入阻滞剂处理后肥大细胞和32D-kit细胞的目测，揭示出包括核浓缩和膜水泡状生长在内的细胞凋亡特征(图3C)。也测定了DNA含量，它在细胞凋亡期间特征性地成片段并减少。如图4A和4B所示并总结于表1，单独用SLF或Il-3处理32D-kit细胞18小时，不产生具有亚二倍体DNA含量的细胞群体，而用益康唑加SLF而不是IL-3处理时，产生具有亚二倍体DNA的大细胞群体(图4C和4D)。已知32D-kit细胞除去生长因子时进行细胞凋亡。去除生长因子18小时后，32D-kit细胞表现出中等比例的具有亚二倍体DNA含量的细胞。该群体在去除因子24小时后实际上增大(未显示)。因此。Ca2+流入阻滞剂加SLF诱导的该细胞凋亡过程比去除因子观察到的细胞凋亡更加快速。用SLF加Ca2+流入阻滞剂处理后，肥大细胞也表现出亚二倍体DNA含量(表1)，与通过细胞凋亡机制诱导细胞凋亡一致
1)BMMC与8μM益康唑加IL-3(25％WEHI条件培养基)、SLF(500ng/ml)或无因子一起培养24小时，用碘化乙锭染色，并分析DNA含量。(2)在分析前同样将32D-kit温育18小时。n.d.未检测到。实验3油酸保护细胞免于SLF-Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡Ca2+迁移信号可以与Ca2+流入阻滞剂结合诱导细胞凋亡的观察，提示该作用是由磷脂酶C介导的。为了检测PLC激活对于细胞死亡是否重要，检测了已经表明抑制对表皮生长因子(EGF)刺激应答的PLC激活(Casabiell等，1993)的油酸对细胞凋亡诱导的作用。不改变EGF的结合或EGF受体酪氨酸激酶活化的该抑制作用，仅用顺-9-十八烯酸(油酸)观察到，而用反-9-十八烯酸(反油酸)观察不到(Casabiell等，1991)。在或者油酸或者反油酸存在下，将32D-kit细胞与益康唑和SLF或IL-3一起温育。如图5所示，用SLF和Ca2+通道阻滞剂处理的32D-kit细胞被油酸(而非反油酸)营救逃脱细胞死亡。油酸的效力范围为1-100μM，相当于PLC抑制所需的浓度(Casabiell,Zugaza,1993)。该观察与结合Ca2+流入阻滞剂诱导细胞凋亡中需要磷脂酶C激活一致。实验4离子霉菌素保护细胞免于SLF-Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡通过打开贮藏-操作Ca2+通道(也称为Icara)介导受体激活后的Ca2+流入(Penner等，1993)。由于酮替芬、益康唑和Ni2+这三种化合物与SLF结合诱导细胞死亡的效力与它们抑制Icara的能力有关，因此可能Icara通道为抑制的靶(Franzius等，1994)。也已经观察到，电压门控Ca2+通道阻滞剂异博停和硝苯吡啶与SLF结合时在诱导细胞死亡方面是无效的(未显示)。该结果提示，与SLF结合诱导细胞死亡对非电压门控Ca2+流入阻滞剂是特异性的。
已经报道了益康唑和酮替芬的其它非特异性作用(Franzius,Hoth,1994)。为了测定Ca2+流入的阻滞对于诱导细胞死亡是否重要，检测了钙离子载体离子霉菌素对细胞凋亡诱导的作用。如图6A所示，离子霉菌素以依赖于浓度的形式保护32D-kit细胞免于SLF加Ca2+流入阻滞剂诱导的死亡，在10nM下保护作用最大。已知离子霉菌素对Ca2+有特异性(Liu等，1978)，这些结果表明它为与激活信号结合诱导细胞凋亡所需的Ca2+流入特异性的阻滞。较高浓度的离子霉菌素产生过高浓度的胞内Ca2+，导致细胞死亡的恢复。这证明在细胞激活的方面，过高和过低的Ca2+流入都可以诱导细胞死亡。实验5Bcl-2对32D-kit细胞中SLF以及加Ca2+流入阻滞剂诱导的细胞凋亡的作用。
已经将Bcl-2蛋白家族与防止细胞被种类繁多的药剂诱导的细胞凋亡的保护作用密切联系起来。Bcl-2的表达与增殖细胞相关(Hockenbery等，1991；Veis等，1993)，受肿瘤抑制基因p53负调节(Miyashita等，1994),Bcl-2的超量表达保护32D细胞免于去除因子后的细胞凋亡性死亡(Nunez等，1990；Baffy,Miyashita等，1993)。因此，检测了Bcl-2蛋白的超量表达对SLF和Ca2+流入阻滞剂诱导细胞凋亡的作用。用含有该Bcl-2基因的逆转录病毒载体(Schwarze等，1995)感染32D-kit细胞，产生Bcl-2超量表达的细胞系(图7A)。测试所述细胞对细胞凋亡的敏感性，发现Bcl-2的超量表达保护32D-kit细胞免于去除因子诱导的细胞凋亡(图7B)。然而，也如图7B中所示，Bcl-2在32D-kit细胞中的超量表达不能保护这些细胞免于SLF和益康唑诱导的细胞凋亡。这些观察得出的结论是以与Bcl-2无关的方式发生SLF加阻滞剂诱导的细胞凋亡。
用低浓度离子霉菌素同样保护32Dkit-Bcl-2细胞免于SLF加阻滞剂引起的细胞凋亡(图6B)，然而，与32Dkit细胞不同，它们没有证明高浓度离子霉菌素下显著的细胞死亡。因此，这些结果表明，对于激活细胞，Ca2+阻滞剂诱导的死亡对过高水平Ca2+流入诱导的死亡至少在Bcl-2敏感性水平方面是不同的。实验6ICE蛋白酶抑制剂对Ca2+流入阻滞剂和SLF诱导的细胞死亡和去除因子诱导的细胞死亡的作用。
TNF-α和Fas配基是Bcl-2超量表达不能提供保护的两个细胞凋亡诱导信号的实例(Memon等，1995；Strasser等，1995)。在这些情况下，已经表明细胞凋亡由蛋白酶的白介素-1β转化酶家族的成员介导的。为了确定ICE蛋白酶家族是否参与SLF和Ca2+流入阻滞剂对细胞凋亡的诱导，将细胞与四肽醛ICE抑制剂YVAD-CHO(Mashima等，1995；Vasilakos等，1995)共温育。我们发现，YVAD-CHO保护32D-kit细胞免于拓扑异构酶抑制剂依托泊苷诱导的细胞凋亡(未显示)。也发现YVAD-CHO提供对SLF加益康唑诱导的细胞凋亡的抗性(图8)，但不能保护32D-kit细胞免于去除因子诱导的细胞凋亡(图7B)。因此，可能是生长信号或激活信号与Ca2+流入阻滞剂结合诱导的细胞凋亡是由ICE样蛋白酶介导的。实验7Ca2+阻滞剂和EGF对人癌细胞的作用研究已经证明乳腺癌中涉及生长因子受体。例如，已经发现45％以上的乳腺癌为EGFR阳性(Fox等，1994；Franzius等，1994)。与该EGFR密切相关的生长因子受体erbB2在所有乳腺癌的30-40％中超量表达(Salmon等，1989)。为了确定在这些细胞中是否可以用Ca2+流入阻滞剂加激活信号诱导细胞死亡，将SK-BR3细胞与或不与EGF一起在益康唑存在下温育。SK-BR3细胞(ATCC分类号HTB-30)得自人乳腺的腺癌。它们在裸鼠中是致瘤的。这些细胞含有突变的p53基因(Elstner等，1995)，为雌激素受体阴性并表达高水平的erbB2分子(Li等，1993)，导致连续激活该受体。如图9A中所示，益康唑在存在或缺乏EGF的情况下，在SK-BR3细胞中诱导等水平的死亡。
MDA-MB-231细胞系为高度退行发育的乳腺癌。它在裸鼠中的致瘤性太高，但仅表达低水平的erbB2。然而，它为FGFR阳性，并且以自分泌方式受bFGF刺激(el Yazidi等，1995)。进行实验以确定MDA-MB-231细胞对Ca2+流入阻滞剂的敏感性和油酸、离子霉菌素和YVAD-CHO对该阻滞剂诱导细胞死亡的影响。这些结果一起总结于图9B中。如图所示，MDA-MB-231细胞对暴露于Ca2+阻滞剂益康唑应答，经受细胞凋亡。此外，该Ca2+流入阻滞剂诱导的MDA-MB-231细胞凋亡机制的特征似乎与32D-kit细胞的特征相同。离子霉菌素、油酸和YVAD-CHO可以保护MDA-MB-231细胞免于该Ca2+流入阻滞剂诱导的死亡。
MCF-7细胞(ATCC分类号为HTB-22)得自人乳腺癌。它们在裸鼠中是致瘤的，特别是当该小鼠用雌激素处理(Benz等，1993)时或将所述细胞囊封于matrigel时(Noel等，1995)。已经报道这些细胞受EGF刺激(Godden等，1992)。为了确定这些细胞对Ca2+流入阻滞剂和激活信号引起的细胞死亡的敏感性，将MCF-7细胞与或不与10g/ml EGF以及各种浓度的益康唑一起温育18小时。如图10所示，MCF-7细胞在10ng/ml EGF存在下比在缺乏10ng/ml EGF的情况下对来自益康唑的细胞死亡更敏感。将图9A、图9B和图10所示实验结合在一起，表明某些乳腺癌细胞在诸如EGF之类的激活因子存在下表现出对阻滞剂敏感性较高。实验8Ca2+流入阻滞剂和SLF对32D-kit白血病细胞的体内作用为了确定Ca2+流入阻滞剂与激活信号结合的体内效力，用酮替芬与SLF的组合物处理接种依赖于因子和G418抗性的32D-kit白血病细胞的小鼠。在一组实验中，取出脾细胞，通过将细胞在琼脂生长培养基中铺平板，分析白血病细胞的存在，其中该琼脂生长培养基含有20％WEHI-3条件培养基和1mg/ml G418，以限制G418抗性白血病细胞的检测。在另一组实验中，分析脾中包括白血病细胞和正常细胞在内的、能够对IL-3应答在琼脂中形成集落的细胞的存在。如图11A所示，在每个实验中，在接种动物中可以检测到G418抗性集落形成细胞。接种动物的脾中发现的水平在动物与动物之间不同，然而大多数动物含有30-1,000个G418抗性集落。接种但未处理的动物的算术平均集落计数为69,938，然而一只动物含有非常高水平的白血病细胞。如果不包括该动物，那么该算术平均集落计数为391。该组的几何平均为813集落/脾。仅注射SLF的动物中检测的G418抗性集落数倾向于高于接受该因子的那些动物，变化范围为65-31,000集落/脾，算术平均为7,399集落/脾，几何平均为1,545集落/脾。这种可检测的集落数的增加可能由SLF刺激白血病细胞引起的。在仅接受酮替芬的小鼠中，可检测集落数的变化范围为114-27,645，算术平均为5,502，几何平均为849。在用酮替芬和SLF处理的动物中，可检测集落数变化的范围为8-537，算术平均为131，而几何平均为61个G418抗性集落/脾。采用单侧成对学生t检验法分析该数据(在对数转化后)，表明未处理组和处理组不是相互不同的可能性仅有6.2％。如果该分析中不包括未处理组含有非常高水平白血病细胞的一只动物，那么未处理组和处理组不是相互不同的可能性为8.9％。
仅接受酮替芬的动物组对接受酮替芬加SLF的动物组的相似比较表明，这些组不是不同的可能性为0.8％，因此非常显著。该结果表明单独的酮替芬几乎没有对白血病细胞的体内活性，而酮替芬和SLF的组合物的确导致白血病细胞数的显著降低。
(1)采用单侧成对学生t检验法相互比较图11A数据的对数。显示两个比较组不是相互不同的可能性的百分数。如果在该分析中不包括具有非常高数目白血病细胞的一只动物，那么括号中的数字为同一可能性。
同样分析这些小鼠脾中集落形成细胞总数，该数据示于图11B中。未接种白血病细胞的小鼠的算术平均集落数为857，其几何平均为669。接种但未处理动物的算术平均集落计数为84,073，然而一只动物含有非常高水平的白血病细胞，如果不包括该动物，那么该算术平均集落计数为3,448。该组的几何平均为4,573集落/脾。仅注射SLF的IL-3依赖性集落数倾向于高于未接受该因子的那些动物，算术平均为18,212集落/脾，而几何平均为5,171集落/脾。这种可检测集落数的增加可能可归因于SLF对白血病细胞的刺激。在仅接受酮替芬的小鼠中，该算术平均为7,715，几何平均为2,320。在用酮替芬和SLF处理的动物中，该算术平均为793个IL-3依赖性集落/脾，而几何平均为66个IL-3依赖性集落/脾。采用单侧成对学生t检验分析这些数据(在对数转化后)，表明未处理组和处理组不是相互不同的可能性为2％。如果该分析中不包括未处理组中含有非常高水平白血病细胞的一只动物，那么未处理组和处理组不是相互不同的可能性为5.1％。同样，仅用SLF或仅用酮替芬处理的组对用酮替芬加SLF一起处理的那些组的比较，也表明这些组不是不同的可能性为2％或1.6％。
(1)采用单侧成对学生t检验法相互比较图11B数据的对数。报道两个比较组不是相互不同的可能性的百分数。如果在该分析中不包括具有非常高数目白血病细胞的一只动物，那么括号中的数为同一可能性。
进行另一实验，其中接种32D-kit细胞的小鼠用酮替芬经口处理，并皮下注射SLF。如图12所示，在这种情况下，SLF与酮替芬的结合似乎对处理小鼠脾中的白血病细胞数没有明显作用。该实验表明，该激活因子的传递途径和两种物质的可能相对定时可能影响特定治疗制度的效力。
以上实验的结果描述了诱导细胞凋亡的新方法。该方法涉及Ca2+流入细胞的阻滞、在正常环境下激活时导致Ca2+流入的受体以及激活该受体的因子的组合。在特定实施方案中，磷脂酶C的激活与该Ca2+流入有关。
已经表明，例如SLF、物质P以及IgE和抗原，而非IL-3，可以与(非电压门控)Ca2+流入阻滞剂结合，在肥大细胞中诱导细胞凋亡。由于SLF和IL-3都是增殖性的，而物质P和抗原-IgE仅为弱增殖性的，因此该形式的细胞凋亡不必需要增殖信号。由于增加的信号导致增加的细胞凋亡，因此该形式的细胞死亡当Ca2+流入阻滞剂与高度激活的受体结合时最有效。在该观察的支持方面，具有组成型激活c-kit受体的p815肥大细胞瘤对单独的Ca2+流入阻滞剂敏感(图2B)。SK-BR3和MDA-MB-231细胞也对单独的Ca2+流入阻滞剂敏感。这也提示具有相似突变(或经受自分泌刺激)的细胞可能对由该类药物引起的细胞凋亡敏感。
油酸可以逆转SLF加阻滞剂诱导的细胞凋亡的观察表明，在至少某些实施方案中需要导致磷脂酶C激活的激活信号。离子霉菌素也可以保护细胞免于SLF加阻滞剂诱导的细胞死亡，表明该Ca2+流入的特异性阻滞是细胞凋亡诱导所需的。SLF加阻滞剂诱导的细胞凋亡对Bcl-2的超量表达不敏感，但可以由ICE蛋白酶抑制剂逆转，提示至少在某些实施方案中，在该细胞凋亡机制中ICE或ICE蛋白酶家族一员的作用。
因为某些增殖性细胞具有高度激活的受体(图9A)，导致PLC的激活，因此本发明包括诊断这类细胞对用Ca2+流入阻滞剂或阻滞剂和进一步激活所述细胞受体的因子处理的敏感性的方法。这一方法包括
获得患病组织的样品；确定该组织与正常组织相比，是否含有较高水平的PLC；如果该组织含有较高水平的PLC，那么确定该PLC是否被激活。如果在该组织中发现这一较高水平的激活PLC，那么所述细胞可能是可治疗的，即通过将所述细胞暴露于Ca2+流入阻滞剂或Ca2+流入阻滞剂与进一步激活所述受体的因子，诱导它们死亡或消除增殖，其中所述受体产生导致较高水平激活PLC的信号。
抗PLC-特异性抗血清已经用来表明，与正常对照相比，乳腺癌具有较高水平的该酶。用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀，然后用抗PLC抗体进行Western印迹分析可以用来测定激活PLC的水平，因为酪氨酸磷酸化的PLC可能被激活(Arteaga等，1991)。
可以直接分析PLC酶活性(Huang等，1995)。简单地说，裂解待分析细胞，采用PLC特异性抗血清(例如可得自Upstate Biotechology Inc,Lake Placid,New York)免疫沉淀PLC，并在含有0.3mM总脂类的50mM Tris(pH8)、0.1mM CaCl2的缓冲液中，用[3H]-PIP2(得自NewEngland Nuclear,Boston,Massachuetts)作为脂质体中的底物(90％DMPM,10％PIP2)分析该酶。加入含0.2M CaCl2的1M HCl终止反应。在滤板(诸如Millipore96孔疏水MultiScreen DP板)上收集沉淀的小泡，通过闪烁计数定量测定存在于流通物中该反应的肌醇磷酸酯产物。
离子霉菌素既可以防止细胞死亡，也可以诱导细胞死亡的观察表明，过高或过低的Ca2+流入都可以导致细胞凋亡。然而在两种情况下，细胞激活似乎是需要的，因为在缺乏SLF的情况下仅观察到少量的细胞死亡。Bcl-2的超量表达仅保护细胞免于高浓度离子霉菌素诱导的死亡，提示在过高或过低的Ca2+流入下细胞死亡下的机制是不同的，至少在对Bcl-2的敏感性方面的不同的。因此，在高浓度离子霉菌素下，所述细胞可能经受“Ca2+超载”的形式，已知暴露于该形式毒性的某些细胞受Bcl-2的保护(Strasser等，1991；Reed,1994)。已经假定高Ca2+死亡的可能介体可能是Ca2+依赖性磷脂酶钙调神经磷酸酶，已经表明后者在T细胞(Shibasaki等，1995)和B细胞(Bonnefoy等，1994)中加强细胞凋亡。
本文描述的结果(图7B和图8)表明，Bcl-2和ICE参与不同细胞凋亡机制的调节。ICE抑制剂(而非Bcl-2)保护抵抗Ca2+流入阻滞剂和SLF的结合，而Bcl-2(而非ICE抑制剂)保护细胞免于去除因子引起的细胞凋亡。用其它细胞凋亡诱导信号进行的实验也与这些观察一致(Cuende等，1993；Memon等，1995；Strasser等，1995；Vasilakos等，1995；Parijs等，1996)。最近也已经证明，Fas激活抑制T细胞中抗CD3介导的Ca2+流入，而不影响从内部贮藏所释放Ca2+(Kovacs等，1995)。
酮替芬是熟知的抗变态反应和抗哮喘药物，表现出组胺H1受体拮抗作用和抑制Ca2+流入的抑制(Martin等，1978；Grant等，1990)。已知Ca2+流入参与肥大细胞去颗粒，该过程的抑制是一个被接受的抗炎作用的机制。因此，本文描述的结果提示Ca2+流入阻滞剂，特别是酮替芬可以与合适的激活信号一起给与，以治疗变态反应症状。已经提出将Ca2+流入阻滞剂作为抗增生剂(Riccardi,1987；Felder等，1991；Kohn等，1992；Estacion等，1993；Petrasch等，1993；Kondo等，1994；Buckley等，1995；De Vries等，1995)。本文描述的结果提示，这些化合物与强增殖信号或激活信号结合时可能更有效。因此，Ca2+流入阻滞剂与增殖信号或激活信号结合可能具有有效的、仅为特异性的抗增生或抗炎性质。
本发明不希望结合任何理论解释引起Ca2+流入细胞的精确机制。然而，本文提出的结果的确建立了给与该细胞Ca2+流入阻滞剂和一种因子的组合物时诱导细胞死亡之间的联系，其中该因子与这一细胞的受体结合，在正常条件下引起该受体激活，以便引起Ca2+流入。
这种因子可以是该受体的天然配基(即天然作用于该受体的配基)、激动抗体等。至少在某些情况下，该流入涉及PLC的激活。在许多情况下，激活涉及该细胞的刺激，其中“刺激”包括该细胞的增殖、激活和/或存活。
图9A所示结果表明，在该受体通常由配基激活、然后Ca2+流入的组成型激活细胞的情况下，仅给与Ca2+流入阻滞剂可以诱导细胞死亡。本文公开的本发明包括给与Ca2+流入阻滞剂，以诱导具有组成型激活受体的细胞死亡，其中该受体的激活促进Ca2+流入该细胞。
对具有对该细胞本身产生的因子应答被激活的细胞而言，也可能用Ca2+阻滞剂处理，以诱导细胞死亡。
对于特定的已知因子，例如SLF、SLF的变异体，该c-kit受体配基在诱导细胞死亡中也可能是有效的。可以按照本领域技术人员已知的方法研制例如该c-kit受体的激动抗体。能够交联受体并诱导Ca2+流入的其它小分子也可能是有效的。SLF本身可以通过突变进行修饰，以稳定该分子，并由此延长它在哺乳动物机体内的半衰期。另一方面或此外，可以通过用聚乙二醇(PEG)缀合修饰SLF，以便延长其使用寿命。
可以使用例如细胞IgE受体本身的抗体代替肥大细胞情况下的IgE和其抗原。可能能够交联IgE受体的抗体最可能引起Ca2+流入的发生。
在患变态反应病人的情况下，已经受变应原特异性T细胞刺激以产生该特定的同种特异性的B细胞产生对该类IgE变应原特异性的免疫球蛋白。B细胞将IgE抗体分泌到胞外空间，在此它们可以与在肥大细胞或嗜碱细胞表面上发现的称为FcεRⅠ的特异性受体结合。如果这些肥大细胞和嗜碱细胞遇到由其表面结合的IgE识别的多价变应原，该IgE/受体则可以交联并被激活，引起一种或多种预形成的诸如组胺的介体释放，最终合成并释放诸如白三烯素、前列腺素和细胞因子之类的其它炎性分子。因此该种复杂的应答涉及多种不同的细胞类型和分子，所有这些都是调节该变态反应应答的可能的靶。这包括产生变应原特异性IgE的B细胞、表达该变应原特异性T细胞受体的T细胞以及表面上具有变应原特异性IgE的肥大细胞和嗜碱细胞。由于通过这些受体传递的信号都使Ca2+迁移，因此它们能够与Ca2+流入阻滞剂结合诱导细胞死亡，正如已经表明的IgE加抗原对肥大细胞的作用。对于表达膜IgE的B细胞，特异性抗IgE化合物将交联这些分子，导致信号传递。这类化合物可以是抗体，诸如Chang在美国专利5,422,258号和5,428,133号或Rupp等在美国专利4,940,782中所描述的。
另外，可以使用诸如(Fab)2试剂之类的这些抗体的片段或识别并交联B细胞表面上的IgE的其它化合物。当B细胞作为特异性靶时，因此可能希望用优先识别B细胞表面上的IgE、而非结合到肥大细胞或嗜碱细胞上的IgE的试剂。
在希望特异性地消除产生识别特定抗原的抗体的B细胞的情况下，如果抗原本身是多价的并且给与足够的量，那么抗原与Ca2+流入阻滞剂结合可以提供足够的信号，使得将杀死产生该抗体的B细胞。另一方面，也可以使用识别该B细胞产生的抗体可变区的抗个体基因型抗体。这一治疗的潜在的靶包括产生抗自身抗原抗体、导致自身免疫性疾病的B细胞。
当然，有其它的细胞受体与配基结合导致Ca2+流入带有该受体的细胞。本发明范围内的生长因子受体激动剂包括TGF-α(转化生长因子)、EGF、heregulin以及以下物质的激动剂ergB1、2、3和4、PDGF A和PDGF B(血小板来源生长因子)、SLF、FLT-3(fms样酪氨酸激酶3)配基、碱性和酸性FGF(成纤维细胞生长因子)(相关生长因子家族)、enothelin、NGF(神经生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、HGF(SF)(肝生长因子；散布因子(scatter factor))。多链免疫识别受体的激动剂包括B细胞上该抗原受体(即B细胞识别的特异性抗原)的激动剂，包括交联表面免疫球蛋白的抗体；T细胞受体激动剂，诸如识别特定的TCR的抗体；抗CD3抗体或激活FcγRⅡ和FcγRⅢ的其它激动聚集的抗体和其它试剂；以及肥大细胞和嗜碱细胞上FcεRⅠ受体的激动剂。G-蛋白连接受体的激动剂也在本发明内容的范围内韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱和其它蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、诸如物质P的神经激肽、包括ATP和腺苷在内的嘌呤能受体激动剂、1,25-二羟基维生素D3。也有许多神经递质刺激Ca2+流入。采用类似于本文公开的实验可以表明，由于给与这类细胞Ca2+流入阻滞剂和配基可以发生细胞死亡。也可以研制这类配基和激动受体抗体的变异体，以使用并采用与上述实验类似的实验进行测试，其中测定对结合Ca2+流入阻滞剂给与这一变异体应答的细胞死亡。
除结合优选实施方案描述的那些钙流入阻滞剂外，钙流入阻滞剂还包括tenidap、CAI、Cd2+、Co2+、La3+、Mn2+、SKF-96365和色甘酸，尽管有比本领域技术人员已知的(Lewis等，1995)更多的许多钙流入阻滞剂。
在任一特定情况下，都可以发现结合一种或多种Ca2+流入阻滞剂给与的受体结合药剂组合物在引起所需细胞应答中证明是最有效的。
正如本文公开的实验所指出的，正是该受体和该细胞对适当受体上结合时产生信号的正常应答，在确定是否可以通过给与受体配基(或其它激动剂)和Ca2+流入阻滞剂诱导细胞死亡方面是重要的。然而，已知用于本文公开实验中的细胞类型以外的细胞类型至少在其生活周期的某个时期具有这类表达的受体，这将产生应用本文公开的发明所需的正常细胞应答。已知表达c-kit受体并对SLF应答的其它细胞类型的实例是造血祖细胞、黑素细胞和生殖细胞。可以表达结合其它配基的受体、这种结合通常导致必要应答的细胞类型的实例包括表达EGF和FGF受体的乳腺癌细胞和表达PDGF受体的结肠癌细胞。
表现出致瘤性、增生或高活性状态的这类细胞可以通过给与适当的按照本发明的结合因子和Ca2+流入阻滞剂进行处理。因此，可能给与按照本发明的治疗物治疗例如患癌、肥大细胞病、自身免疫性炎症或变态反应的人。
已经发现c-kit在白血病细胞上超量表达(Muroi等，1995)并在高比例的小细胞肺癌(Hida等，1994)、雌性生殖道肿瘤(Inoue等，1994)中发现，可能参与神经纤维瘤的肥大细胞浸润(Hirota等，1993)。因此，这类部位是按照本发明治疗的主要候选部位。
在作为按照本发明的靶的细胞被组成型激活的情况下，由于信号已经产生，(图9A)可能不必包括刺激受体结合产生的信号的药剂。在这种情况下，可以给与Ca2+流入阻滞剂，而不用伴随受体刺激剂。某些肿瘤细胞已知具有这种活性，因此可以用该方法治疗。在人和啮齿动物来源的肥大细胞瘤中已经发现了c-kit激活突变(Kanakura等，1994；Kitayama等，1995)。不是说在某些情况下不优选通过给与合适的因子与Ca2+阻滞剂加强该信号。
确定特定细胞类型是否对按照本发明的处理敏感的起始步骤，是确定该细胞膜上表达的受体的配基结合是否引起胞内Ca2+浓度的增加。与关于本文所公开实施方案的细胞描述的实验类似，然后给与各种浓度的该配基和Ca2+流入阻滞剂的细胞培养物，以测定诱导细胞死亡的水平。
关于特定的适应症，该合适剂量将随例如该宿主、给药模式和待治疗疾病的性质和严重性等而变化。对于受体结合药剂，待获得的满意结果的日剂量表明为，比方说大约0.1-1mg/kg动物体重，尽管这可以随特定药剂或待治疗对象或疾病而变化。另外，可能最好将该日剂量分为2、3、4或更多的剂量。
如果该药剂为诸如生长因子的多肽，那么可以例如通过皮内、肌内、静脉内注射给药。
含有本发明受体结合化合物的药用组合物可以包括至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、润滑剂、缓冲液、抗菌剂、膨胀剂、抗氧剂等，通过与该药学上可接受的载体或稀释剂等混合，以常规方式生产该组合物。单位剂量形式含有例如大约0.025-50mg该化合物。
可以按照已知方法制备和给与已知的Ca2+流入阻滞剂，条件是该药剂到达所需的靶细胞。
为了导向特定的细胞，比方说例如产生特定IgE的B细胞，可以产生该IgE表面部分的激动抗体。合适的Ca2+流入阻滞剂(或阻滞剂)可以适当地与该抗体连接(例如共价连接)，使得该抗体与表面IgE的结合使带该阻滞剂与希望作用的特定细胞接触。参考文献下面给出引用的参考文献的详细说明。所有列出的参考文献都通过引用结合到本文中。Artreaga,C.L.Johnson,M.D.,Todderud,G.,Coffey,R.J.,Carpenter,G.,Page,D.L.(1991)原发性人乳腺癌中酪氨酸激酶底物磷脂酶C-γ1的较高含量。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88,10435-9.Ashwell,J.D.,Cunningham,R.E.,Noguchi,P.D.和Hemandez,D.(1987)用抗原激活时T细胞杂交瘤细胞生长周期的阻滞。J.Exp.
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权利要求
1．在有需要的哺乳动物中诱导细胞死亡的方法，其中所述细胞能够被伴随有Ca2+流入的因子刺激，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的所述因子。
2．在具有易受所述细胞伴随有Ca2+流入的药剂受体的配基刺激的细胞的哺乳动物中，诱导所述细胞死亡的方法，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的所述配基。
3．诱导有需要的哺乳动物的细胞死亡的方法，其中所述细胞具有一种受体，该受体被药剂结合时导致钙流入该细胞并激活磷脂酶C，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂和有效量的所述药剂。
4．诱导有需要的哺乳动物的细胞死亡的方法，其中所述细胞能够被伴随有钙流入的因子刺激，该方法包括给与该哺乳动物有效量的非电压门控Ca2+流入阻滞剂和有效量的所述因子。
5．权利要求1或4的方法，其中该因子为所述细胞受体的激动抗体。
6．权利要求1或4的方法，其中该因子为所述细胞受体的天然配基。
7．权利要求2或权利要求的方法，其中该配基为该受体的天然配基。
8．权利要求3的方法，其中该药剂为该受体的激动抗体。
9．权利要求3的方法，其中该药剂为该受体的配基。
10．权利要求9的方法，其中该配基为该受体的天然配基。
11．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法，其中所述细胞为肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、嗜碱细胞或癌细胞。
12．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法，其中该哺乳动物患增生性疾病。
13．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法，其中该哺乳动物患癌。
14．权利要求13的方法，其中该哺乳动物患乳腺癌。
15．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法，其中该哺乳动物患变态反应。
16．权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法，其中该哺乳动物患自身免疫障碍。
17．权利要求1、4、5或6的方法，其中所述细胞具有选自以下的表面受体c-kit受体或突变c-kit受体、T细胞受体、CD3、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FcεRⅠ、G-蛋白连接受体、韩蛙皮素受体、促胃液素释放肽受体、舒缓激肽、氨甲酰胆碱受体、蕈毒碱分子受体、CCK-8受体、后叶加压素受体、神经激肽受体、物质P受体、嘌呤能(purinergic)分子受体、TGF-α受体、EGF受体、heregulin受体、erbB1受体、erbB2受体、erbB3受体、erbB4受体、PDGF受体、SLF受体、FLT-3配基受体、碱性FGF受体、酸性FGF受体、enothelin受体、NGF受体、VEGF受体和HGF受体。
18．权利要求2、3、7、8或9的方法，其中所述受体选自c-kit受体或突变c-kit受体、T细胞受体、CD3、FcγRⅡ、FcγRⅢ、FcεRⅠ、G-蛋白连接受体、韩蛙皮素受体、促胃液素释放肽受体、舒缓激肽、氨甲酰胆碱受体、蕈毒碱分子受体、CCK-8受体、后叶加压素受体、神经激肽受体、物质P受体、嘌呤能分子受体、TGF-α受体、EGF受体、heregulin受体、erbB1受体、erbB2受体、erbB3受体、erbB4受体、PDGF受体、SLF受体、FLT-3配基受体、碱性FGF受体、酸性FGF受体、enothelin受体、NGF受体、VEGF受体和HGF受体。
19．权利要求1或4的方法，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGFA、PDGFB、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
20．权利要求2的方法，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGFA、PDGFB、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
21．权利要求2的方法，其中所述配基选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGFA、PDGFB、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
22．权利要求3的方法，其中所述药剂选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGFA、PDGFB、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
23．权利要求1或4的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞并包含一种抗体，而该因子为该抗体的抗原。
24．权利要求1或4的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞，并且IgE与所述免疫细胞结合，而所述因子为该IgE的激动剂。
25．权利要求24的方法，其中所述细胞包含IgE受体，而该因子为该受体的抗体。
26．权利要求2的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞并包含一种抗体，而该配基为该抗体的抗原。
27．权利要求2的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞，并且IgE与所述免疫细胞结合，而所述因子为该IgE的激动剂。
28．权利要求27的方法，其中所述细胞包含IgE受体，而该配基为该受体的抗体。
29．权利要求3的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞并包含一种抗体，而该药剂为该抗体的抗原。
30．权利要求3的方法，其中所述细胞为超活性免疫细胞，并且IgE与所述免疫细胞结合，而所述药剂为该IgE的激动剂。
31．权利要求30的方法，其中所述细胞包含IgE受体，而该药剂为该受体的抗体。
32．权利要求24、27或30的方法，其中所述细胞为嗜碱细胞。
33．权利要求24、27或30的方法，其中所述细胞为肥大细胞。
34．权利要求1、4、5、6、17、23、24或25的方法，其中分别给与该Ca2+流入阻滞剂和该因子。
35．权利要求2、7、18、20、21、26或27的方法，其中分别给与该Ca2+流入阻滞剂和该配基。
36．权利要求3、8、9、22、29或30的方法，其中分别给与该Ca2+流入阻滞剂和该配基。
37．权利要求1、4、5、6、17、23、24或25的方法，其中在给与该因子之前给与该Ca2+流入阻滞剂。
38．权利要求2、7、18、20、21、26或27的方法，其中在给与该配基之前给与该Ca2+流入阻滞剂。
39．权利要求3、8、9、22、29或30的方法，其中在给与该药剂之前给与该Ca2+流入阻滞剂。
40．权利要求1、4、5、6、17、23、24或25的方法，其中在单个步骤中给与该Ca2+流入阻滞剂和该因子。
41．权利要求2、7、18、20、21、26或27的方法，其中在单个步骤中给与该Ca2+流入阻滞剂和该配基。
42．权利要求3、8、9、22、29或30的方法，其中在单个步骤中给与该Ca2+流入阻滞剂和该药剂。
43．权利要求1或4的方法，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下用该因子刺激所述细胞通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
44．权利要求2的方法，其中在缺乏Ca2+流入阻滞剂的情况下该配基与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
45．权利要求3的方法，其中在缺乏Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述药剂通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
46．权利要求1、2、3或4的方法，其中所述细胞表达c-kit受体，其中该方法包括给与该哺乳动物有效量的c-kit配基。
47．权利要求1、2、3、4或46的方法，其中该哺乳动物为患白血病、肿瘤生长或肺癌的人。
48．权利要求3的方法，其中所述因子为与所述细胞受体结合的生长因子，该结合通常引起所述细胞增殖。
49．权利要求48的方法，其中该哺乳动物患癌或增生。
50．权利要求3的方法，其中所述因子为蛋白。
51．权利要求3的方法，其中所述因子为结合所述细胞受体的存活因子，在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下该结合通常增加该细胞的寿命。
52．权利要求51的方法，其中所述细胞为造血祖细胞。
53．权利要求3的方法，其中所述因子为与所述细胞受体结合的激活因子，在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，该结合通常引起该细胞的激活。
54．任一前述权利要求的方法，其中所述哺乳动物为人。
55．任一前述权利要求的方法，其中所述Ca2+流入阻滞剂选自Ni2+、酮替芬、益康唑、tenidap、CAI、Cd2+、Co2+、La3+、Mn2+、SKF-96365和色甘酸或它们的组合物。
56．诱导有需要哺乳动物组成型激活细胞死亡的方法，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂。
57．权利要求56的方法，其中所述激活导致Ca2+浓度高于所述细胞未激活状态时的水平。
58．权利要求56的方法，其中所述组成型激活为存在突变c-kit受体的结果。
59．权利要求58的方法，其中所述哺乳动物为患肥大细胞病的人。
60．诱导有需要哺乳动物细胞死亡的方法，其中所述细胞易受自分泌刺激，该方法包括给与该哺乳动物有效量的Ca2+流入阻滞剂。
61．权利要求56、57、58、59或60的方法，其中所述Ca2+流入阻滞剂为Ni2+。
62．作为抑制细胞生长的抗增生剂给与哺乳动物的药用组合物，它包含Ca2+流入阻滞剂和一种因子，该因子通常与所述细胞受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。
63．权利要求62的组合物，其中所述因子与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。
64．权利要求62或63的组合物，其中所述Ca2+流入阻滞剂为非电压门控Ca2+流入阻滞剂。
65．权利要求62、63或64的组合物，其中所述因子为该受体的激动抗体。
66．权利要求62、63或64的组合物，其中所述因子为该受体的天然配基。
67．权利要求62、63或64的组合物，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
68．权利要求67的组合物，其中所述因子为SLF。
69．权利要求62的组合物，其中所述因子为免疫细胞表面抗体的抗原。
70．权利要求62的组合物，其中所述因子为IgE的激动剂。
71．权利要求62的组合物，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述因子与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
72．用于抑制哺乳动物细胞生长的药用组合物试剂盒，该试剂盒包含Ca2+流入阻滞剂和一种因子，该因子通常与所述细胞受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。
73．权利要求72的组合物，其中所述因子与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。
74．权利要求72和73的组合物，其中所述Ca2+流入阻滞剂为非电压门控Ca2+流入阻滞剂。
75．权利要求72、73或74的组合物，其中所述因子为该受体的激动抗体。
76．权利要求72、73或74的组合物，其中所述因子为该受体的天然配基。
77．权利要求72、73或74的组合物，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
78．权利要求77的组合物，其中所述因子为SLF。
79．权利要求72的组合物，其中所述因子为免疫细胞表面抗体的抗原。
80．权利要求72的组合物，其中所述因子为IgE的激动剂。
81．权利要求72的组合物，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述因子与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
82．权利要求62、63、64、65、66、67、68或71的组合物作为抗增生剂的用途。
83．权利要求62、63、64、65、66、67、68、69、70或71的组合物作为抗炎剂的用途。
84．权利要求72、73、74、75、76、77、78或81的试剂盒作为抗增生剂的用途。
85．权利要求72、73、74、75、76、77、78、79、80或81的试剂盒作为抗炎剂的用途。
86．Ca2+流入阻滞剂和一种因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子通常与细胞受体结合，以便引起Ca2+流入该细胞。
87．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86的因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子与该受体的结合通常导致磷脂酶C的激活。
88．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86或87的因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述Ca2+流入阻滞剂为非电压门控Ca2+流入阻滞剂。
89．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86、87或88的因子在用作抑制细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为该受体的激动抗体。
90．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86、87或88的因子在用作抑制细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述作用为该受体的天然配基。
91．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86、87或88的因子在用作抑制细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子选自SLF、TGF-α、EGF、heregulin、erbB1的激动剂、erbB2的激动剂、erbB3的激动剂、erbB4的激动剂、PDGF A、PDGF B、FLT-3配基、碱性FGF、酸性FGF、enothelin、NGF、VEGF、HGF、TCR激动剂、CD3受体激动剂、FcγRⅡ受体激动剂、FcγRⅢ受体激动剂、FcεRⅠ受体激动剂、G-蛋白连接受体激动剂、韩蛙皮素、促胃液素、促胃液素释放肽、舒缓激肽、氨甲酰胆碱、蕈毒碱受体激动剂、CCK-8、后叶加压素、神经激肽、物质P、嘌呤能受体激动剂、ATP、腺苷和1,25-二羟基维生素D3以及它们的组合物。
92．Ca2+流入阻滞剂和权利要求91的因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为SLF。
93．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86的因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为免疫细胞表面抗体的抗原。
94．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86的因子在用作抑制所述细胞生长的药剂的药物制备中的用途，其中所述因子为IgE的激动剂。
95．Ca2+流入阻滞剂和权利要求86的因子在制备用作抗增生剂的药物中的用途，其中在缺乏所述Ca2+流入阻滞剂的情况下，所述因子与该受体的结合通常促进所述细胞的生长、存活和/或激活。
96．患病哺乳动物细胞对用Ca2+流入阻滞剂或阻滞剂与进一步激活所述细胞受体的因子治疗的敏感性的诊断方法，该方法包括分析与正常组织相比，组织样品含有的PLC水平是否较高；其中较高的激活PLC水平表示所述细胞可能对所述治疗敏感。
97．权利要求96的方法，还包括获得患病组织样品。
98．权利要求96或97的方法，其中分析该样品的步骤包括监测PLC底物的量，该底物在得自预定量所述组织的PLC存在下进行反应。
99．权利要求98的方法，还包括通过酶联免疫吸收检定从预定量的所述组织中分离该PLC。
100．权利要求98或99的方法，其中所述PLC底物为[3H]-PIP2。
101．作为Ca2+流入阻滞剂的药剂的筛选方法，该方法包括以下步骤在该药剂存在下培养第一组细胞，其中所述细胞具有促进Ca2+流入所述细胞的激活受体；在该药剂存在下培养第二组细胞，其中第二组细胞缺乏促进Ca2+流入第二组细胞的激活受体；确定第一组细胞的生长是否低于对应于在缺乏该药剂的情况下第一组细胞生长的第一预定水平；以及确定第二组细胞的生长是否与对应于在缺乏该药剂的情况下第二组细胞生长的第二预定水平大致相等；其中第一组细胞的生长低于第一预定水平，而第二组细胞的生长与第二预定水平大致相等，表明所述药剂为Ca2+阻滞剂。
102．权利要求101的方法，其中第一组细胞的受体为组成型激活。
103．权利要求101的方法，其中第一组细胞的受体易受自分泌刺激。
104．权利要求101的方法，其中第一组细胞的受体被外源药剂激活。
105．权利要求104的方法，其中该药剂为第一组细胞受体的天然配基。
106．权利要求101、104或105的方法，其中第一组细胞的受体和第二组细胞的受体为同一受体。
107．权利要求101、104、105或106的方法，其中该受体选自c-kit受体、EGF受体和FGF受体。
108．权利要求101、102、103、104、105、106或107的方法，其中第一组细胞和第二组细胞为人细胞。
109．权利要求101、102、103、104、105、106或108的方法，其中第一组细胞为肥大细胞，第二组细胞为肥大细胞，该受体为c-kit受体，并且在SLF存在下培养第一组细胞。
110．权利要求101的方法，其中用第一组细胞的所述受体转染第一组细胞。
全文摘要
本发明的一般特征为用Ca
文档编号A61K39/395GK1213315SQ97192863
公开日1999年4月7日 申请日期1997年1月13日 优先权日1996年1月11日
发明者S·A·贝格尔, J·L·戈姆梅尔曼 申请人:韦尔斯利医院基金会