专利名称：作为环氧酶抑制剂的巯基衍生物的制作方法
相关申请本申请是于1995年3月24日递交的、题目为“作为氧化氮合成酶抑制剂的巯基衍生物”的第08/410,12号申请的部分继续，上述申请的内容在此作为参考。发明背景本发明涉及巯基衍生物作为环氧酶(COX)抑制剂的应用。
前列腺素(PG)是通过一族称为环氧酶(COX)的酶由花生四烯酸合成而得的。一种异构重整体(isoform)(COX-1)结构性地存在于各种组织中，并释放少量的前列腺素。由COX-1连续释放前列腺素可起到一些生理作用。例如，前列环素，一种血管舒张和抗凝聚性前列腺素，可降低血小板对内皮表面的粘结。
COX的可诱导异构重整体(COX-2)是在多种细胞类型中应答免疫刺激时被表达的，所述细胞包括巨噬细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，并产生大量的可导致组织损伤的前列腺素。
现有大量证据表明，COX-2在各种炎性疾病的致病机理中起着重要的作用。在内毒素休克的动物模型中，内毒素诱导COX-2的产生。另外，现认为，过量前列腺素的产生可能与许多其他炎性疾病有关，包括关节炎和溃疡性结肠炎。
在治疗使用中已有多种的COX抑制剂。例如，非甾体抗炎药(乙酰水杨酸、布洛芬等)是COX的抑制剂。与COX抑制作用有关的美国专利的例子包括5,155,110；5,360,925；5,399,970；5,409,944；5,474,995；和5,475,021。虽然上述讨论的COX抑制剂具有治疗作用，鉴定其他可抑制COX的化合物也是重要的。希望的是找到其他具有组合作用的化合物，例如抑制COX以及其他前炎性(pro-inflammatory)酶活性。发明概述本发明涉及一种用于在哺乳动物中抑制COX的药物组合物。该组合物包括巯基衍生物以及药物学上可接受的载体，其中巯基衍生物在组合物中的量足以抑制哺乳动物中的COX。
在此方面，上述专利申请涉及相同的巯基化合物在治疗与氧化氮(一种强细胞毒性的自由基)过渡形成有关的疾病中的应用。因此，在本发明中描述的作为COX抑制剂的巯基化合物与其他类型的COX抑制剂相比具有明显的优势，即它们还可抑制其他类型的炎性酶(氧化氮合成酶)。
本发明还涉及抑制哺乳动物中COX的方法，该方法包括向哺乳动物给药纯物质形式的或者是在药物学上可接受的载体中的巯基衍生物的步骤。
上述组合物和方法中的巯基衍生物是由以下通式限定的化合物及其盐
以及
其中，R1是H、烷基、链烯基、苯基、亚烷基、alkenylene或苯基亚烷基或它们的取代衍生物；
R1是亚烷基或alkenylene时，R1可任选地连接在上述包含R1的通式中的脒基Ns、Z或X上，形成5-、6-或7-元杂环，其条件是，在R1连接于Z上时，Z是亚烷基或alkenylene或它们的取代衍生物，而在R1连接于X上时，X是CR5或N；R2、R3、R′2和R′3相互独立地是H、低级烷基、链烯基、亚烷基、alkenylene、氨基、苯基或苯基亚烷基，或者是它们的取代衍生物；R2或R′2为亚烷基或alkenylene时，R2或R′2任选地连接在位于邻近脒基C上的亚氨基N上，形成5-或6-元杂环；Z和Z′相互独立地是亚烷基、alkenylene、环亚烷基或环alkenylene或者是它们的取代衍生物；R2、R3、R′2和R′3是亚烷基或alkenylene时，R2、R3、R＇2和R′3任选地连接在相邻的Z或Z′上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，所述杂环任选地为低级烷基、烷氧基、卤素、羟基或氨基所取代；X是N、NR4、O、CR5或CR4R5；X′是N、NR′4、O、CR′5或CR′4R′5；Y是S；R4和R′4独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基；R5和R′5独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基、硫酯亚烷基、氨基或羧基；以及如果R4或R′4是亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基时，R4或R＇4任选地连接在R2、R3、R′2或R′3上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，如此连接的R2、R3、R＇2或R′3独立地为亚烷基、alkenylene、氨基、苯基、苯基亚烷基或者是它们的取代衍生物，其中取代衍生物是低级烷基或卤素。附图简要说明
图1是巯基乙基胍(MEG)对在花生四烯酸存在下未经刺激的J774巨噬细胞(A)以及经免疫刺激(用LPS和干扰素-γ刺激6小时)的J774巨噬细胞(B)产生6-酮基前列腺素F1α的作用图；图2巯基乙基胍(MEG)对在花生四烯酸存在下未经刺激的J774巨噬细胞(A)以及经免疫刺激(用LPS和干扰素-γ刺激6小时)的J774巨噬细胞(B)产生血栓烷B2的作用图；图3是巯基乙基胍(MEG)对经纯化的COX-1(A)和在无细胞系统中(N=3-6)的经纯化的COX-2(B)产生6-酮基前列腺素F1α的作用图。本发明详述本发明涉及用于抑制哺乳动物中COX的药物组合物。该组合物包括巯基衍生物以及药物学上可接受的载体，其中巯基衍生物在组合物中的量足以抑制哺乳动物中的COX。本发明还涉及抑制哺乳动物中COX的方法，该方法包括向哺乳动物给药纯物质形式的或者是在药物学上可接受的载体中的巯基衍生物的步骤。
用于本发明组合物或方法中的合适的巯基衍生物可根据以下文献中教授的合成方法来制备，所述文献在此并入作为参考。
(1)约瑟夫X.基姆(Joseph X.Khym)等人，“转胍基反应的离子交换研究，I.S,2-氨基乙基异硫脲向2-巯基乙基胍和2-氨基噻唑啉的重排”(Ion Exchange Studies of Transguanylation Reactions,I.Rearrangement ofS,2-Aminoethylisothiourea to 2-Mercaptoethylguanidine and 2-Aminothiazoline”)，美国化学协会杂志(Joumal of the AmericanChemical Society)，第79卷，5663-5666页，1957年11月5日；(2)戴维G.多赫迪等人(David G000000000，“氨基烷基异硫脲盐的合成以及它们向巯基烷基胍和噻唑啉的转化”(Synthesis ofAminoalkylisothiuronium Salts and their Conversion to Mercaptoalkylguanidines and Thiazolines)，美国化学协会杂志，第79卷，5667-5671页，1957年11月5日；(3)约瑟夫X.基姆(Joseph X.Khym)等人，“转胍基反应的离子交换研究，Ⅱ.3-氨基丙基异硫脲以及N-取代的氨基乙基-和氨基丙基异硫脲向巯基烷基胍和2-氨基噻唑啉或Penthiazolines的重排”(IonExchange Studies of Transguanylation Reactions,Ⅱ.Rearrangement of 3-Aminopropylisothiourea and N-Substituted Aminoethyl-and Aminopropyl-isothioureas to Mercaptoalkylguanidines and 2-Aminothiazoline orPenthiazolines”)，美国化学协会杂志，第80卷，3342-3349页，1958年7月5日；(4)戴维G.多赫迪等人(David G.Doherty),“D-和L-2-氨基丁基异硫脲二氢溴酸异构体的合成以及它们向胍基硫醇、二硫化物和噻唑啉的转化”(Synthesis of D-and L-2-AminobutylisothiureaDihydrobromide Isomers and their Conversion to Guanidothiols,Disulfides,and Thiazolines)，有机化学杂志(Journal of Organic Chemistry)，第28卷，1339-1342页，1963年；(5)朱石溪等人(Shih-Hsi Chu)，“潜在的防辐射剂，Ⅱ.2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和相关化合物的硒类似物”(Potential AntiradiationAgents.Ⅱ.Selenium Analogs of 2-Aminoethylisothiouronium Hydrobromideand Related Compounds)，美国化学协会杂志，第27卷，2899-2901页，1962年8月(6)日野达等人(Tohru Hino)，“辐射保护剂，I.N-烷基-2-(2-氨基乙基)假硫脲和1,1-(二硫代亚乙基)二胍的研究”(Radiation-protective Agents.Ⅰ.Studies on N-Alkylated-2-(2-aminoethyl)thiopseudoureas and 1,1-(Dithioethylene)diguanidines)，化学及药学快讯(Chemical & Pharmaceutical Bulletin)，第14卷，第11期，1193-1201页，1966年11月。
合适的巯基衍生物还可根据本发明详述部分尾部的实施例来制备。
上述组合物和方法中的巯基或硒基衍生物是由以下通式限定的化合物及其盐
以及
其中，R1是H、烷基、链烯基、苯基、亚烷基、alkenylene或苯基亚烷基或它们的取代衍生物；R1是亚烷基或alkenylene时，R1可任选地连接在上述包含R1的通式中的脒基Ns、Z或X上，形成5-、6-或7-元杂环，其条件是，在R1连接于Z上时，Z是亚烷基或alkenylene或它们的取代衍生物，而在R1连接于X上时，X是CR5或N；R2、R3、R′2和R′3相互独立地是H、低级烷基、链烯基、亚烷基、alkenylene、氨基、苯基或苯基亚烷基，或者是它们的取代衍生物；R2或R′2为亚烷基或alkenylene时，R2或R＇2任选地连接在位于邻近脒基C上的亚氨基N上，形成5-或6-元杂环；Z和Z′相互独立地是亚烷基、alkenylene、环亚烷基或环alkenylene或者是它们的取代衍生物；R2、R3、R＇2和R′3是亚烷基或alkenylene时，R2、R3、R′2和R＇3任选地连接在相邻的Z或Z′上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，所述杂环任选地为低级烷基、烷氧基、卤素、羟基或氨基所取代；X是N、NR4、O、CR5或CR4R5；X′是N、NR′4、O、CR′5或CR′4R′5；Y是S；R4和R′4独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基；R5和R′5独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基、硫酯亚烷基、氨基或羧基；以及如果R4或R′4是亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基时，R4或R＇4任选地连接在R2、R3、R′2或R′3上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，R2、R3、R′2或R′3独立地为亚烷基、alkenylene、氨基、苯基、苯基亚烷基或者是它们的取代衍生物，其中取代衍生物是低级烷基或卤素。
在此所用术语“盐”是指得自于任何药物学上可接受的有机或无机酸的加成盐。合适酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，在此所用的任何烷基或亚烷基都可以是直链、支链或成环的，“卤素”包括溴、氯、氟和碘。
如上所述，R1是H、烷基、链烯基、苯基、亚烷基、alkenylene或苯基亚烷基，或者是它们的取代衍生物。如果需要，该R1衍生物可以是被烷氧基、卤素、羟基、氨基或硝基中的一种或多种取代。另外，如上所述，R2、R3、R′2和R′3独立地是H、低级烷基、链烯基、亚烷基、alkenylene、氨基、苯基或苯基亚烷基、或者是它们的取代衍生物。如果需要，R2、R3、R′2和R′3衍生物可以被低级烷基或卤素取代。
如果R4、R′4、R5或R′5取代基是硫代亚烷基，硫代亚烷基优选具有如[-(CH2)n-SH]的通式，其中，n独立地是1-4。如果R4、R′4、R5或R′5是硫酯亚烷基，硫酯亚烷基优选具有如[-(CH2)n-S-R6]的通式，其中，R6独立地是低级烷基，n独立地是1-4。
巯基衍生物的Z和Z′取代基独立地是亚烷基、alkenylene、环亚烷基或环alkenylene或者是它们的取代衍生物。如果使用它们的取代衍生物，取代基可包括烷氧基、卤素、羟基、氨基或硝基。
巯基衍生物的优选副组包括其中R1是H或低级烷基；R2是H；R3是H；R′2是H；R′3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4和R′4独立地是H、甲基或乙基；而Z和Z′独立地是亚烷基的巯基衍生物。一些非限制性的例子包括巯基乙基胍、巯基丙基胍、S-甲基-巯基乙基胍、S-甲基-巯基丙基胍、和胍基乙基化二硫。巯基衍生物的其他优选副组是其中R1是H；R2是H；R3是H；R′2是H；R＇3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4是H；R′4是H；而Z和Z′独立地是C1-6亚烷基的巯基衍生物。非限制性的例子包括巯基乙基胍、巯基丙基胍、和胍基乙基化二硫。
发现纯物质形式或在药物载体中的巯基衍生物有益于治疗通过抑制环氧酶来治疗的病症和疾病。例如，巯基衍生物可用于治疗包括各方面的循环性休克，如血管和心肌机能不良、包括抑制线粒体酶和细胞色素P450介导的药物代谢之代谢衰竭、以及包括成人呼吸窘迫综合症的多发性器官机能障碍综合症。循环性休克可能是由革兰氏阴性和革兰氏阳性脓毒症、外伤、出血、烧伤、过敏反应、细胞因子免疫治疗、肝衰竭、肾衰竭或系统性炎症应答综合症引起的。巯基衍生物对接受细胞因子如TNF、LI-1和IL-2治疗的病人、或用细胞因子诱导药物治疗的病人、或者在器官移植治疗中接受辅助性短期免疫抑制的病人也是有益的。另外，巯基衍生物还可用于抑制患有炎性疾病的病人体内的前列腺素合成，在该病症中COX-2活性引发了所述疾病的病理过程，如关节炎、炎性肠炎、以及心肌炎。
还有证据表明，COX-2与自体免疫和/或炎性病症有关，如关节炎、类风湿性关节炎和系统性盘状红斑狼疮(SLE)，而且还与胰岛素依赖性的糖尿病有关，因此证明巯基衍生物对治疗这些疾病是有益的。
而且现已知道有许多的其他炎性和非炎性疾病与COX-2产生有关。这些生理疾病的例子包括炎性肠道疾病，如回肠炎、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎；炎性肺部疾病，如气喘和慢性梗阻性气管疾病；眼部的炎性疾病，如角膜营养不良、沙眼、盘尾丝虫病、眼色素层炎、交感神经性眼炎和眼内炎；慢性牙龈炎性疾病，如牙周炎；包括关节炎和骨关节炎的慢性关节炎性疾病、结核病、麻风病、肾小球性肾炎肉样瘤和肾变病；包括硬化性皮炎、牛皮癣和湿疹的皮肤疾病；中枢神经系统的炎性疾病，包括如多发性硬化的慢性脱髓鞘疾病、包括与AIDS病有关的神经变性和阿尔茨海默氏病的痴呆、脑脊髓炎和病毒性或自体免疫性脑炎；包括免疫综合脉管炎、系统性狼疮和红斑的自体免疫性疾病；以及包括局部缺血心脏病和心肌病的心脏疾病。得益于使用巯基衍生物的其他疾病包括肾上腺缺乏；血胆甾醇过多；动脉粥样硬化；与骨吸收增加有关的骨疾病，如骨质疏松，惊厥前期，惊厥，尿毒并发症；慢性肝衰竭，包括中风和脑局部缺血的中枢神经系统(CNS)的非炎性疾病；以及各种癌症。
巯基衍生物的药物制剂包括适用于口服、直肠、鼻腔、局部(包括颊部和舌下)、阴道和非胃肠道(包括肌肉内、皮下和静脉内)给药的剂型，或者是适于吸入或吹入给药的剂型。如果合适的话，药物组合物可方便地放入单一的给药装置中，并可用药学工艺中任何已知的方法制备。所有所述的药学方法都包括将活性化合物与液体载体或细分的固体载体或在需要时液体及固体两者缔合的步骤，然后如果需要的话，将产物成型为所需的剂型。
适于口服给药的药物剂型可通常为单个的装置，如胶囊、扁囊(cachet)或片剂，各含有预定量的活性组份；粉末或颗粒；或为溶液、悬浮液和乳剂。活性组份也可为团块药糖剂或糊剂，而且可为纯物质形式，即没有载体。用于口服给药的片剂和胶囊可包含常规的赋形剂，如粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂或润湿剂。片剂可用压制或模制法制备，可选择性地添加一种或多种次要组份。压制片剂可通过以下方法来制备在合适的机器中将如粉末或颗粒之流动形式的活性组份，其也可选择性地混有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑表面活性剂或分散剂，压制成片。模制片剂可通过将用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物在合适的机器中模制来制备。片剂可根据本领域已知的方法包衣。口服流动性制剂可为例如水性或油性悬浮液、溶液、乳液、糖浆或甘香酒剂的剂型，或者是在使用前用水或其他合适载体来配制的干燥产品的形式。此类液体制剂可包含常规的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水载体(其可包括食用油)或防腐剂。片剂还可配制成活性组份缓释或控释的剂型。
非胃肠道给药的剂型包括水性或非水性无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与待给药的血液等张的溶质；以及水性或非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增粘剂。该制剂可在单剂量或多剂量容器内，例如密封的安瓿和管形瓶，也可在冻干(冻干剂)条件下贮存，这只需要在使用前添加无菌液体载体，例如盐水、注射用水。另外，所述制剂也可为连续输液的形式。临时配制的注射液和悬浮液可由上述的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
用于直肠给药的剂型可为添加有常规载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂。在口腔如颊部或舌下中局部给药的剂型包括锭剂，其包括活性组份和调味剂如蔗糖和阿拉伯胶或西黄耆胶，以及包括活性组份和明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的软锭剂。在鼻内给药时，本发明的化合物可为液体喷雾剂或可分散粉末和滴剂的形式。滴剂可用包括一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂的水性或非水性基来配制。液体喷雾剂通常从加压包装中释放。
在吸入给药时，本发明的化合物通常由吹入器、喷雾加压包装或其他常规的释放气雾喷雾剂的装置中释放。加压包装包括合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。如果是加压的气雾剂，给药装置可通过设置阀门来确定给药剂量。
另外，在吸入或吹入给药时，根据本发明的化合物可为干燥粉末组合物的形式，例如化合物与合适的粉末状乳糖或淀粉的混合粉末。粉末状组合物可为单元剂量形式，例如胶囊、管壳、明胶或泡罩包装，在给药时粉末借助吸入器或吹入器由这些包装中释放出来。
如果需要的话，上述制剂也可为持续释放活性组份的形式。根据本发明的药物组合物还可包含其他的活性组份，如抗菌剂、免疫抑制剂或防腐剂。
本发明的化合物也可与其他的治疗化合物合用，例如抗炎药物、特别是氧化氮合成酶抑制剂，超氧化物或过氧化物清除剂，包括前列环素和前列腺素E1的血管舒张前列腺素，包括顺铂、NO供体或NO吸入治疗、或PAF受体拮抗剂的癌症化学治疗药物。
应理解的是，除上述特别提到的组份，本发明的制剂可包括其他本领域中根据剂型的需要而常用的试剂，例如那些适合于口服给药的剂型可包括调味剂。
优选的单元给药剂型包含如下所述的有效剂量的或者是适当的活性组份。
在上述提到的病症中，巯基衍生物的口服或经注射给药的剂量为每曰0.1-250mg/kg。对于成人，剂量范围通常为5mg-17.5g/天，优选为5mg-10g/天，最优选为100mg-3g/天。在单一单元中的片剂或其他制剂通常可包含此剂量或多个此剂量的有效剂量，例如包含5mg-500mg，通常为约100mg-500mg的单剂量。
药物组合物优选口服或注射(静脉内或皮下)给药，对病人的精确给药量由住院医师来决定。但是，所用剂量取决于许多因素，例如病人的年龄和性别、治疗的确切病症、以及严重情况。给药途径也取决于病症及其严重情况。
以下实施例将用于说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1本实施例(图1)说明巯基乙基胍对J774.2巨噬细胞中花生四烯酸或免疫刺激诱导的6-酮基前列腺素F1α形成的作用。J774巨噬细胞株得自于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并使用常规方法在Dulbecco改良伊革氏培养基(DMEM)中培养，该培养基中添加有10％胎牛血清、谷氨酸、青霉素(10000 U/I)和链霉素(10000 U/I)。细胞在96孔板中培养，以测定前列腺素代谢物的产生和细胞存活性。所有实验都在无胎牛血清的情况下进行，以避免对放射免疫测试的干扰。用放射免疫测试测定培养基中前列环素的稳定代谢产物--6-酮基前列腺素F1α的浓度。在进行放射免疫测试前，按1∶5在缓冲液中稀释上清液或反应样品，所述缓冲液包含0.1％聚乙烯吡咯烷、0.9％NaCl、50 mM的Tris碱、1.7mM的MgSO4、和0.16mM CaCl2(pH7.4)。如Wise WC,CookJA,Haluskha PV的“内毒素耐受性中的花生四烯酸代谢(Arachidonic AcidMetabolism in Endotoxin Tolerance)”Adv.Shock，第10卷，131-142页，1983所述，通过放射免疫测试测定前列环素的稳定代谢物--6-酮基前列腺素F1α。环氧酶1在J774细胞中活性的测定以90-100％融合将细胞放入96孔板中(200μM-3mM)。加入抑制剂作为30分钟的预处理。用花生四烯酸(16μM)刺激细胞，以激活结构性环氧酶(COX-1)。然后再将细胞温育30分钟，收集上清液，以便通过放射免疫测试测定花生四烯酸代谢。环氧酶2在J774细胞中活性的测定以90-100％融合将细胞放入96孔板中(最终体积200μL)，然后用MEG(1μM-3mM)预处理30分钟。用大肠杆菌(E.coli)(LPS,10μg/ml)内毒素和干扰素γ(IFN,150 Uml)刺激细胞，以诱导可诱导性环氧酶(COX-2)的表达。然后再将细胞温育6小时，并收集上清液，以便通过放射免疫测试测定花生四烯酸代谢。
用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴)之线粒体依赖性还原为formazan，来估测作为细胞存活指标的线粒体呼吸。细胞在96孔板中与MTT(0.2mg/ml,60分钟)-起温育(37℃)。通过抽吸除去培养基，将细胞溶解在二甲基亚砜(DMSO)(100μl)中。用微板读数计通过测量OD550来定量细胞中MTT向formazan还原的程度。绘制DMSO中MTT向fomazan还原的校正曲线。细胞中formazan的产生用得自未处理细胞的百分数值来表示。
用花生四烯酸(图a)或内毒素(图b)刺激的细胞向培养基中释放6-酮基前列腺素1α。其被巯基衍生物--巯基乙基胍(MEG)剂量依赖性地抑制。抑制前列腺素产生的作用不是因为细胞被杀死，其原因是这些药物在它们有效剂量范围中并没有降低细胞的存活性(未示出)。与MEG相似，其他相关的巯基衍生物也表现出不同程度抑制COX-2活性的抑制作用。
表1所选巯基衍生物对免疫刺激J744巨噬细胞中COX-2活性的半最大抑制作用效力
实施例2本实施例(图2)说明巯基乙基胍对J774.2巨噬细胞中花生四烯酸或免疫刺激诱导的血栓烷B2形成的作用。如实施例1培养和处理J774巨噬细胞。用放射免疫测试测定培养基中血栓烷A2的稳定代谢产物--血栓烷B2的浓度。在进行放射免疫测试前，按1∶5在缓冲液中稀释上清液或反应样品，所述缓冲液包含0.1％聚乙烯吡咯烷、0.9％ NaCl、50mM的Tris碱、1.7mM的MgSO4、和0.16mM CaCl2(pH7.4)。如Wise WC,Cook JA,Haluskha PV的“内毒素耐受性中的花生四烯酸代谢(Arachidonic Acid Metabolismin Endotoxin Tolerance)”Adv.Shock，第10卷，131-142页，1983所述，通过放射免疫测试测定血栓烷A2的稳定代谢物--血栓烷B2。
用花生四烯酸(A)或内毒素(B)刺激的细胞向培养基中释放血栓烷A2。其被巯基衍生物--巯基乙基胍(MEG)剂量依赖性地抑制。抑制前列腺素产生的作用不是因为细胞被杀死，其原因是这些药物在它们有效剂量范围中并没有降低细胞的存活性(未示出)。
实施例3本实施例(图3)说明巯基乙基胍对经纯化的COX-1(A)和COX-2(B)同工酶形成6-酮基前列腺素F1α的作用。在-个包含0.1MTris-HCl缓冲液(pH 8.0，最终体积2ml)以及1mM EDTA、0.2mM苯酚和1μM氯化血红素的试管中，在有或没有MEG(1μM-3mM)存在下，于37℃使10单位COX-2的COX-1与100μM花生四烯酸反应2分钟。通过添加50μL氯化锡溶液(100mg/ml，在1M盐酸中)使反应骤停。使反应再进行10分钟，并通过添加5ml的缓冲液使其停止，所述缓冲液包含0.1％聚乙烯吡咯烷、0.9％NaCl、50mM的Tris碱、1.7mM的MgSO4、和0.16mM CaCl2(pH7.4)。
培养基中的6-酮基前列腺素1α--前列腺素稳定代谢产物的浓度用放射免疫测试来测定。按1∶5在缓冲液中稀释上清液或反应样品，所述缓冲液包含0.1％聚乙烯吡咯烷、0.9％NaCl、50mM的Tris碱、1.7mM的MgSO4、和0.16mM CaCl2(pH7.4)。如Wise WC,Cook JA,HaluskhaPV的“内毒素耐受性中的花生四烯酸代谢(Arachidonic Acid Metabolismin Endotoxin Tolerance)”Adv.Shock，第10卷，131-142页，1983所述，通过放射免疫测试测定前列环素的稳定代谢物--6-酮基前列腺素F1α。
在反应混合物中有明显的6-酮基前列腺素1α产生。其被巯基衍生物--巯基乙基胍(MEG)剂量依赖性地抑制。
实施例4本实施例说明合成巯基乙基胍硫酸盐的方法。将巯基乙胺盐酸盐(2g)溶解在甲醇(5ml)中，然后在盐/冰浴中冷却。加入氢氧化钾(0.99g)之甲醇(10ml)冷溶液，搅拌混合物。1小时后，过滤溶液，在12ml滤液中加入S-甲基异硫脲(2g)。在氮气氛、室温(18℃)下搅拌溶液16小时。过滤溶液，然后添加醚，沉淀出粗产物，该产物在醚/乙醇混合物中重结晶。
以上对本发明的详细描述仅用于说明，而不应理解为是对本发明范围的限制，本发明的范围由以下权利要求书来确定。
权利要求
1.一种用于抑制哺乳动物中环氧酶的药物组合物，包括具有以下通式的化合物或其盐以及药物学上可接受的载体
或
其中，R1是H、烷基、链烯基、苯基、亚烷基、alkenylene或苯基亚烷基或它们的取代衍生物；R1是亚烷基或alkenylene时，R1可任选地连接在上述包含R1的通式中的脒基Ns、Z或X上，形成5-、6-或7-元杂环，其条件是，在R1连接于Z上时，Z是亚烷基或alkenylene或它们的取代衍生物，而在R1连接于X上时，X是CR5或N；R2、R3、R＇2和R′3相互独立地是H、低级烷基、链烯基、亚烷基、alkenylene、氨基、苯基或苯基亚烷基，或者是它们的取代衍生物；R2或R＇2为亚烷基或alkenylene时，R2或R′2任选地连接在位于邻近脒基C上的亚氨基N上，形成5-或6-元杂环；Z和Z′相互独立地是亚烷基、alkenylene、环亚烷基或环alkenylene或者是它们的取代衍生物；R2、R3、R＇2或R′3是亚烷基或alkenylene时，R2、R3、R＇2或R′3任选地连接在相邻的Z或Z′上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，所述杂环任选地为低级烷基、烷氧基、卤素、羟基或氨基所取代；X是N、NR4、O、CR5或CR4R5；X′是N、NR′4、O、CR′5或CR′4R′5；Y是S；R4和R′4独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基；R5和R′5独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基、硫酯亚烷基、氨基或羧基；以及如果R4或R′4是亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基时，R4或R′4任选地连接在R2、R3、R′2或R＇3上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，R2、R3、R′2或R′3独立地为亚烷基、alkenylene、氨基、苯基、苯基亚烷基或者是它们的取代衍生物，其中取代衍生物是低级烷基或卤素；所述巯基衍生物以有效抑制哺乳动物中环氧酶的量存在于所述组合物中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述R1的取代衍生物选自烷氧基、卤素、羟基、氨基和硝基的一种或多种。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述R2、R3、R′2或R′3的取代衍生物相互独立地选自低级烷基和卤素。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述R4、R5、R＇4或R＇5硫代亚烷基具有[-(CH2)n-SH]的通式，其中n独立地是1-4。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述R4、R5、R′4或R′5硫酯亚烷基具有[-(CH2)n-S-R6]的通式，其中R6独立地是低级烷基，而n独立地是1-4。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述Z或Z′的取代衍生物独立地选自烷氧基、卤素、羟基、氨基和硝基。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，R1选自H或低级烷基；R2是H；R3是H；R′2是H；R′3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4和R′4独立地选自H、甲基和乙基；而Z和Z′独立地是亚烷基。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，R1是H；R2是H；R3是H；R＇2是H；R＇3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4是H；R′4是H；而Z和Z′独立地是C1-6亚烷基。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物选自巯基乙基胍、巯基丙基胍、S-甲基-巯基乙基胍、S-甲基巯基丙基胍、和胍基乙基化二硫。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物的量足以治疗通过抑制环氧酶来治疗的病症。
11.如权利要求10所述的组合物，其中，所述病症选自循环性休克、系统性炎症应答综合症、用细胞因子的治疗、用细胞因子诱导药物的治疗、器官移植、移植器官排斥、局部炎症应答、系统性炎症、自体免疫疾病、成人呼吸窘迫综合症、关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病、回肠炎、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎、气喘、牙周炎、肾变病、神经系统的慢性脱髓鞘疾病、多发性硬化、与AIDS病有关的并发症、阿尔茨海默氏病、局部缺血心脏病、心肌病、肾上腺缺乏、血胆甾醇过多、动脉粥样硬化、与骨吸收增加有关的骨疾病、惊厥前期、惊厥、尿毒并发症、慢性肝衰竭、中风、脑局部缺血以及癌症。
12.如权利要求10所述的组合物，其中，所述病症选自系统性炎症应答综合症和循环性休克。
13.如权利要求1所述的组合物，其配制成口服、直肠、鼻腔、局部、颊部、舌下、阴道、非胃肠道、肌肉内、皮下、静脉内、吸入或吹入给药的剂型。
14.如权利要求1所述的组合物，其配制成口服给药的剂型，所述载体包括选自由粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂、润湿剂、惰性稀释剂、表面活性剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、食用油、调味剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
15.如权利要求1所述的组合物，其配制成在口腔内局部给药的剂型，所述载体包括选自由调味剂、蔗糖、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、甘油以及它们的混合物组成的组中的成分。
16.如权利要求1所述的组合物，其配制成鼻腔给药的剂型，所述载体包括选自由分散剂、增溶剂、悬浮剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
17.如权利要求1所述的组合物，其配制成吸入给药的剂型，所述载体包括推进剂。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，所述推进剂选自二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳以及它们的混合物。
19.如权利要求1所述的组合物，其配制成吸入或吹入给药的剂型，所述载体包括选自由乳糖、淀粉以及它们的混合物组成的组中的成分。
20.如权利要求1所述的组合物，其配制成非胃肠道给药的剂型，所述载体包括选自由抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、悬浮剂、增粘剂、盐水、水以及它们的混合物组成的组中的成分。
21.如权利要求1所述的组合物，其配制成直肠给药的剂型，所述载体包括选自由可可脂、聚乙二醇以及它们的混合物组成的组中的成分。
22.如权利要求1所述的组合物，其中掺入选自由抗菌剂、免疫抑制剂、防腐剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
23.如权利要求1所述的组合物，其给药剂量为每日约5mg-17.5g所述的化合物。
24.如权利要求23所述的组合物，其给药剂量为每日约5mg-10g所述的化合物。
25.如权利要求24所述的组合物，其给药剂量为每日约100mg-3g所述的化合物。
26.抑制哺乳动物中环氧酶的方法，包括向哺乳动物给药有效抑制哺乳动物中环氧酶的量的化合物或其盐，所述化合物具有以下通式
或
其中，R1是H、烷基、链烯基、苯基、亚烷基、alkenylene或苯基亚烷基或它们的取代衍生物；R1是亚烷基或alkenylene时，R1可任选地连接在上述包含R1的通式中的脒基Ns、Z或X上，形成5-、6-或7-元杂环，其条件是，在R1连接于Z上时，Z是亚烷基或alkenylene或它们的取代衍生物，而在R1连接于X上时，X是CR5或N；R2、R3、R′2和R′3相互独立地是H、低级烷基、链烯基、亚烷基、alkenylene、氨基、苯基或苯基亚烷基，或者是它们的取代衍生物；R2或R′2为亚烷基或alkenylene时，R2或R＇2任选地连接在位于邻近脒基C上的亚氨基N上，形成5-或6-元杂环；Z和Z′相互独立地是亚烷基、alkenylene、环亚烷基或环alkenylene或者是它们的取代衍生物；R2、R3、R′2或R′3是亚烷基、alkenylene时，R2、R3、R′2或R′3任选地连接在相邻的Z或Z′上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，所述杂环任选地为低级烷基、烷氧基、卤素、羟基或氨基所取代；X是N、NR4、O、CR5或CR4R5；X′是N、NR′4、O、CR′5或CR′4R′5；Y是S；R4和R＇4独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基；R5和R＇5独立地是H、烷基、亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基、硫酯亚烷基、氨基或羧基；以及如果R4或R＇4是亚烷基、alkenylene、硫代亚烷基或硫酯亚烷基时，R4或R＇4任选地连接在R2、R3、R′2或R′3上，形成5-或6-元杂环，该杂环包括N、C、以及不超过一个的O或S原子，其条件是，R2、R3、R′2或R′3独立地为亚烷基、alkenylene、氨基、苯基、苯基亚烷基或者是它们的取代衍生物，其中取代衍生物是低级烷基或卤素。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述R1的取代衍生物选自烷氧基、卤素、羟基、氨基和硝基的一种或多种。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述R2、R3、R＇2或R′3的取代衍生物相互独立地选自低级烷基和卤素。
29.如权利要求26所述的方法，其中，R4、R5、R′4或R＇5硫代亚烷基具有[-(CH2)n-SH]的通式，其中n独立地是1-4。
30.如权利要求26所述的方法，其中，R4、R5、R′4或R′5硫酯亚烷基具有[-(CH2)n-S-R6]的通式，其中R6独立地是低级烷基，而n独立地是1-4。
31.如权利要求26所述的方法，其中，所述Z或Z′的取代衍生物独立地选自烷氧基、卤素、羟基、氨基和硝基。
32.如权利要求26所述的方法，其中，R1选自H或低级烷基；R2是H；R3是H；R′2是H；R′3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4和R＇4独立地选自H、甲基和乙基；而Z和Z′独立地是亚烷基。
33.如权利要求26所述的方法，其中，R1是H；R2是H；R3是H；R＇2是H；R′3是H；X是NR4；X′是NR′4；R4是H；R＇4是H；而Z和Z′独立地是C1-6亚烷基。
34.如权利要求26所述的方法，其中，所述化合物选自巯基乙基胍、巯基丙基胍、S-甲基-巯基乙基胍、S-甲基巯基丙基胍和胍基乙基化二硫。
35.如权利要求26所述的方法，其用于治疗通过抑制环氧酶来治疗的病症。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述病症选自循环性休克、系统性炎症应答综合症、用细胞分裂药物的治疗、用细胞分裂诱导药物的治疗、器官移植、移植器官排斥、局部炎症应答、系统炎症、自体免疫疾病、成人呼吸窘迫综合症、关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病、回肠炎、溃疡性结肠炎和节段性回肠炎、气喘、牙周炎、肾变病、神经系统的慢性脱髓鞘疾病、多发性硬化、与AIDS病有关的并发症、阿尔茨海默氏病、局部缺血心脏病、心肌病、肾上腺缺乏、血胆甾醇过多、动脉粥样硬化、与骨吸收增加有关的骨疾病、惊厥前期、惊厥、尿毒并发症、慢性肝衰竭、中风、脑局部缺血以及癌症。
37.如权利要求35所述的方法，其中，所述病症选自关节炎和胃肠道炎性疾病。
38.如权利要求26所述的方法，其通过选自以下的方法给药所述化合物口服、直肠、鼻腔、局部、颊部、舌下、阴道、非胃肠道、肌肉内、皮下、静脉内、吸入或吹入给药。
39.如权利要求26所述的方法，其是口服给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由粘合剂、填料、润滑剂、崩解剂、润湿剂、惰性稀释剂、表面活性剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、食用油、调味剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
40.如权利要求26所述的方法，其是口腔内局部给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由调味剂、蔗糖、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、甘油以及它们的混合物组成的组中的成分。
41.如权利要求26所述的方法，其是鼻腔给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由分散剂、增溶剂、悬浮剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
42.如权利要求26所述的方法，其是吸入给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括推进剂。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述推进剂选自二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳以及它们的混合物。
44.如权利要求26所述的方法，其是吸入或吹入给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由乳糖、淀粉以及它们的混合物组成的组中的成分。
45.如权利要求26所述的方法，其是非胃肠道给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、悬浮剂、增粘剂、盐水、水以及它们的混合物组成的组中的成分。
46.如权利要求26所述的方法，其是直肠给药在药物学上可接受的载体中的所述化合物，所述载体包括选自由可可脂、聚乙二醇以及它们的混合物组成的组中的成分。
47.如权利要求26所述的方法，其中，所述化合物包含选自由抗菌剂、免疫抑制剂、防腐剂以及它们的混合物组成的组中的成分。
48.如权利要求26所述的方法，其中，所述化合物的给药剂量为每日约5mg-17.5g。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述化合物的给药剂量为每日约5mg-10g。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述化合物的给药剂量为每日约100mg-3g。
全文摘要
本发明涉及用于抑制哺乳动物中环氧酶的药物组合物,该组合物包含巯基衍生物以及药物学上可接受的载体。本发明还涉及抑制环氧酶、以及治疗各种通过抑制环氧酶来治疗的病症的方法。该方法包括向哺乳动物给药纯物质形式的或在药物学上可接受的载体中的巯基衍生物的步骤。
文档编号A61P1/02GK1212620SQ97192848
公开日1999年3月31日 申请日期1997年3月3日 优先权日1996年3月5日
发明者巴西利娅·津加雷利, 安德鲁·萨尔兹曼, 乔鲍·绍博 申请人:儿童医院医疗中心