专利名称：复方肾保护氨基酸组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属涉及一种新型复方氨基酸组合物，尤其涉及肾保护支链氨基酸组合物，及该组合物在治疗肾功能障碍的制药领域中的应用。
近年来关于应用药物预防和治疗急性肾功能障碍时的细胞损伤和促进细胞修复与再生的报道日益增多。常见有腺嘌呤核苷酸类药物、氧自由基清除剂、钙离子阻滞剂、钙镁锌等两价阳离子、血管紧张素转换酶抑制剂、前列腺素。
氨基酸对肾功能保护作用的机理尚未阐明。若甘氨酸、丙氨酸用量过高(125umol/kg·min)，GFR下降32％，说明甘氨酸、丙氨酸用量过高有潜在肾毒性。低至中剂量的氨基酸可引起肾血管扩张及GFR的增加。Weinberg JM等发现存在甘氨酸和L-丙氨酸增加肾近端小管细胞耐受缺氧损伤，保护作用不依赖细胞内的ATP的水平，和氨基酸的代谢无关。认为高度的特异受体和配体的作用在维持细胞的完整性起关键作用。Paller Ms等发现甘氨酸和丙氨酸对培养肾近端小管细胞的缺氧再供氧有保护作用。Silva p等2mM的甘氨酸加入离体灌注大鼠肾模型中，甘氨酸能保护髓攀粗升支的缺氧损伤，丙氨酸也有同样作用，与NO和降低细胞活动无关。Baines AD等发现在离体灌注肾模型中检查氨基酸的保护作用发现甘氨酸和丙氨酸等中性氨基酸的保护不需代谢，和它们稳定膜蛋白的三级结构有关。
现临床使用的复方肾病用氨基酸，主要通过给予必需氨基酸以纠正慢性肾时必需氨基酸血浓度下降，同时作为急性和慢性肾功能衰竭时营养支持。有高含量的赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等非支链氨基酸，对急性肾功能障碍无保护作用。如剂量过大具有潜在地肾毒性。
本发明的目的是通过下述方案实现的一种新型复方肾保护氨基酸组合物，其组合物及各组分的重量比为
本发明优选的各组分的重量比为
本发明最优选的各组分的重量比为
本发明的另一个目的是该组合物应用于制备预防和/或治疗由属于顺铂类和缺血导致的急性肾功能障碍的药物，包括注射剂，粉剂，片剂，胶囊等多种剂型。
本发明由于采用上述方案，因而具有以下优点1.本发明的组合物对顺铂类所致急性肾功能衰竭具有保护作用。
实验研究表明本发明的氨基酸组合物能增加顺铂所致急性肾功能衰竭时肾小球滤过率；保护肾小管细胞中线粒体的氧化磷酸化，改善线粒体呼吸障碍；保护肾小管细胞中溶酶体和线粒体等多种细胞器损伤，改善Na，K的排泄异常。
2.本发明的组合物对肾缺血再灌注损伤具有保护作用。
实验研究表明本发明的氨基酸组合物能增加缺血性肾功能障碍时的肾小球滤过率，尿流率；减缓血肌酐和尿素氮升高；减轻肾小管细胞损伤程度；减少肾小管细胞的凋亡；促进肾小管细胞热休克蛋白HSP70和Bcl-2蛋白表达；减低肾脏内皮素水平。
3.本发明的组合物可以避免单种甘氨酸或丙氨酸用于预防和/或治疗急性肾功能障碍时甘氨酸、丙氨酸用量过高存在潜在肾毒性。
4.本发明的组合物的氨基酸可以为肾脏损伤修复与再生提供所需的各种氨基酸，同时也为肾衰病人提供营养支持和能量代谢保证。
5.本发明使用的各种支链氨基酸是人体组成天然氨基酸，来源丰富，价格实惠。
6.本发明的氨基酸组合模式合理。
实施例1本发明的组合物配制称取甘氨酸5.5克，L-丙氨酸7.5克，L-苏氨酸0克，L-丝氨酸7.5克，L-缬氨酸5克，L-亮氨酸5克，L-异亮氨酸2克，L-脯氨酸5克，用500ml 0.45％NaCl溶解，用NaOH和HCl调节溶液PH值6.5。
实施例2氨基酸合剂对顺铂所致大鼠急性肾功能衰竭的保护作用实验模型选用体重250-350g雄性SD大鼠，分4组，对照组(n＝16)静滴0.9％氯化钠2ml，以后2ml/h速度维持；顺铂组(n＝12)静滴0.9％氯化钠2ml以后接受10mg/kg顺铂(10mg/ml)，氯化钠溶液继续2ml/h静滴；顺铂+氨基酸组(n＝10)静脉滴注8种L-氨基酸合剂2ml后，给予10mg/kg顺铂，继以氨基酸2ml/h；氨基酸组(n＝16)静脉滴注8种L-氨基酸合剂2ml后，以2ml/h维持。以戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉，体温维持在37C.一侧股静脉插入双通道静脉输液器，用于注射液体。切开腹中线进入腹腔，于肾血管平面下插动脉导管进入腹主动脉，与描记器相连，记录平均动脉压，实验中维持在100-120mmHg。经膀胱壁插入硅胶导管，每30分钟收集尿一次用于测尿流率，尿肌酐及钠钾浓度。体内实验完成时从门静脉抽血2ml测定血肌酐浓度；分离结扎肠系膜上动脉及肾血管平面上下的主动脉，经动脉导管用4度灌注液冲洗一侧肾脏后取下。对侧肾脏作形态学研究。肾小管线粒体呼吸功能的测定先分离肾小管线粒体，以极谱法在25度测定呼吸功能，极谱仪反应池容积为0.45ml，通过Clark氧电极与描记器相连。测定时反应池中加入0.45ml含5mmol/l苹果酸及5mmol/l谷氨酸的线粒体混悬液，加0.5mmol/lADP后测定的氧耗率称为状态3呼吸，ADP耗尽时的氧耗率称为状态4呼吸。线粒体悬液中加入2nmol/l对三氟甲氧基腙羰基氰化物(FCCP)以测定FCCP解偶联呼吸。
结果如下1.增加肾脏的肾小球滤过率，氨基酸合剂静脉滴注3小时，与对照组(1.87±0.08)ml/min相比，GFR增加85％(3.45±0.21)ml/min，p＜0.01。
2.改善尿钠钾排泄异常。顺铂作用30min，肾小管细胞功能受损，尿钠浓度增加56％，尿钾浓度增加2.6倍，氨基酸合剂注射后尿钠浓度迅速恢复正常，甚至低于对照组62％-71％，p＜0.01；尿钾浓度恢复至对照组水平。
3.氨基酸改善肾小管细胞线粒体呼吸功能。顺铂作用后3小时，鼠肾小管细胞线粒体电子传递及ADP磷酸化和ATP功能均受抑制，状态4呼吸增加1倍。状态3呼吸、呼吸控制率(RCR)及FCCP解偶联呼吸分别减少46％、74％及47％。同时应用氨基酸合剂使状态4呼吸恢复至正常水平；受抑状态3呼吸、RCR及FCCP解偶联呼吸明显改善，受抑百分比分别降为对照组的16％(p＜0.05)，22％(p＜0.01)，21％(p＜0.01)。氨基酸对鼠肾小管正常线粒体呼吸功能无影响。
实验结果可知，本发明的组合物能增加顺铂所致急性肾功能衰竭时肾小球滤过率；保护肾小管细胞中线粒体的氧化磷酸化，改善线粒体呼吸障碍；保护肾小管细胞中线粒体损伤，改善Na，K的排泄异常。对顺铂类所致急性肾功能衰竭具有保护作用。
实施例3氨基酸合剂对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用。
1.本发明的组合物配制称取甘氨酸7.5克，L-丙氨酸5.5克，L-苏氨酸2.0克，L-丝氨酸7.5克，L-缬氨酸5克，L-亮氨酸2克，L-异亮氨酸0克，L-脯氨酸6.5克，用500ml 0.45％NaCl溶解，用NaOH和HCl调节溶液PH值6.5。
2.实验方案健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体重(230±18)g。随机分A组假手术组，B组对照组，C组治疗组。每组8只。2％戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉。左股静脉插管，接微泵持续输注生理盐水(A、B组)或氨基酸合剂(C组) 液体输注速度1ml·100g-1·h-1。膀胱造瘘，接以预先称重1.5ml微量离心管，收集尿标本，计算尿流率。输注液体60min后，行腹部正中切口，无损伤动脉夹阻断双肾蒂45min。假手术组不上夹。于再灌注30、60、90、120、150、180min留取尿标本。3h时断尾取血0.5ml。
再灌注24h时，取门静脉血3ml，切取双肾。血标本离心后-20℃冻存。测定血清肌酐、尿素氮、钠浓度；尿肌酐、钾、钠浓度。计算出180min内生肌酐清除率，排钠量、排钾量、尿流率。肾脏标本10％中性甲醛固定，HE(苏木素—伊红)常规染色，常规光镜检查。按Paller标准评分。免疫组化检测HSP70和BCL-2蛋白的表达。新鲜肾标本制作单细胞悬液，用流式细胞仪检测溴化丙啶染色和Anenexin法的肾小管细胞凋亡情况。称取100mg肾皮质用放射免疫法测定内皮素(ET-1)含量。
结果如下1.尿流率的变化在再灌注30min时尿量3组无显著性差异。对照组在再灌注60min开始尿量明显增加，60、90、120、150、180min与假手术组比较有显著性差异。氨基酸合剂治疗组在60min开始尿量明显增加，高于其他组；90、120、150、180min时与对照组比较有显著性差异。见表1。
表1 大鼠急性缺血后尿量UV(ul/min)的变化组别 AB C30min6.1±1.5 5.5±4.6 6.1±2.960min6.1±1.1#19.6±11.832.6±14.390min5.6±1.7*24.3±7.7 63.6±15.2*120min 6.2±1.9*26.1±7.6 82.1±36.2#150min 6.1±2.0*28.0±9.6 91.7±35.2*180min 5.7±1.2*32.5±13.0111.0±59.1#与对照组比较，#p＜0.05，*p＜0.012.再灌注3、24h血肌酐、尿素氮浓度变化至3h时血肌酐3组无显著性差异。3h血尿素氮对照组高于假手术组，有显著性差异；氨基酸合剂治疗组高于对照组，差异有显著性。24h时血肌酐、尿素氮对照组高于假手术组，差异有显著性；氨基酸合剂治疗组血肌酐、尿素氮低于对照组，有显著性差异。见表2。
表2 大鼠急性缺血后血肌酐尿素氮和尿肌酐排出和内生肌酐清除率的变化组别 A B C3h Cr(umol/L) 116.7±27.8136.0±9.6119.8±23.73h B UN(mmol/L)7.4±0.9* 12.1±3.6 17.9±2.8#24h Cr(umol/L) 68.8±5.5* 112.7±19.5 85.0±7.7*24h BUN(mmol/L)7.1±1.1* 20.7±6.6 11.4±3.9#90min肌酐排出(nmol/min)46.8±6.2* 20.4±6.0 64.1±10.9*180min肌酐排出(nmol/min) 45.3±5.6* 31.4±4.0 57.9±12.4#180min肌酐清除率(ul/min) 469.0±55.4* 227.5 ±27.0 471.0±121.5*与对照组比较，#p＜0.05，*p＜0.013.尿肌酐排出、180min内生肌酐清除率变化90、180min时尿肌酐排出量对照组低于假手术组，有显著性差异；氨基酸合剂治疗组尿肌酐排出量高于对照组，有显著性差异。180min时内生肌酐清除率对照组低于假手术组，有显著性差异；氨基酸合剂治疗组内生肌酐清除率高于对照组，有显著性差异。见表2。
4.尿钠、尿钾排出变化90、180min尿钾浓度3组无显著性差异。90、180min时尿钾排出量对照组明显高于假手术组，有显著性差异。氨基酸合剂治疗组尿钾排出量高于对照组，有显著性差异。90分钟时尿钠浓度，90、180分钟尿钠排出量对照组高于假手术组，有显著性差异。氨基酸合剂治疗组90分钟时尿钠浓度，90、180分钟尿钠排出量高于对照组，有显著性差异。180分钟时尿钠浓度3组无显著性差异。见表3。
表3 大鼠急性缺血后尿钾与钠浓度和尿与钾钠排出量的变化组别 A B C90min钾浓度(mmol/L)57.8±113.655.1±21.1 52.2±14.090min钾排出量(nmol)310.8±555.0* 1259.0±253.8 3137.6±251.2*180min钾浓度(mmol/L46.9±76.8 57.3±15.8 42.6±30.4180min钾排出量(nmol) 284.5±469.6* 1554.7±421.9 3162.5±1191.9#90min钠浓度(mmol/L 45.3±23.6*92.2±29.0 117.3±25.3#90min钠排出量(nmol 285.4±86.9* 2152.6±598.6 7683.9±3258.9*180min钠浓度(mmol/L) 64.4±55.2 72.1±53.4 86.3±23.4180min钠排出量(nmol) 383.1±337.9# 2111.5±1547.6 9307.3±5240.9*与对照组比较，#p＜0.05，*p＜0.015.减少肾组织内皮素的升高，B组缺血45min，再灌注15min、3h时肾组织内皮素(ET-1)分别是7.3±2.5，10.1±2.8，13.0±2.7(pg/mg)，氨基酸合剂组再灌注15min、3h时肾组织内皮素(ET-1)分别是7.2±0.8，9.6±1.0(pg/mg)，差异有显著性p＜0.05。通过减低肾脏内皮素水平，改善肾脏的缺血再灌注时的微循环障碍。
6.肾小管细胞凋亡的变化，在再灌注15min，凋亡和坏死的细胞白分率在A组5.4±1.1，B组9.0±2.2，C组16.5±3.2，氨基酸合剂有明显减少肾小管细胞的凋亡(p＜0.05)；7.肾组织学检查正常大鼠肾脏HE切片未发现明显的形态学改变。光镜下对照组近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死，肾小管腔扩张，内可见管型和坏死脱落的细胞损伤累及近曲小管所有细胞；可见明显管周血管的扩张淤血间质中性粒细胞浸润。氨基酸合剂治疗组近曲小管上皮细胞部分肿胀、颗粒变性和小空泡变性罕见细胞坏死和管型。Paller评分氨基酸治疗组低于对照组(108.7±5.7vs168.8±14.8)p＜0.01。
8.肾组织HSP70和Bcl-2蛋白的表达的变化。
用免疫组化技术检测发现，氨基酸治疗组抗损伤内在保护蛋白HSP70表达较对照组明显升高，同时发现氨基酸治疗组的抗凋亡蛋白Bcl-2也较对照组增加。本氨基酸合剂的保护机制之一可能是通过促进上述蛋白表达起保护作、尿素氮和尿肌酐排出和内生肌酐清除率的变化。
综上实验结果可知，氨基酸组合物能增加缺血性肾功能障碍时的肾小球滤过率，尿流率；减缓血肌酐和尿素氮升高；减轻肾小管细胞损伤程度；减少肾小管细胞的凋亡；促进肾小管细胞热休克蛋白HSP70和Bcl-2蛋白表达；减低肾脏内皮素水平。本发明的组合物对肾缺血再灌注损伤具有保护作用。本发明组合物具有良好的开发和临床应用前景。
从以上描述，本领域技术人员可容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
本发明涉及的部分参考文献1.刘平。急性肾功能衰竭。见王海燕主编。肾脏病学(第二版)。北京人民卫生出版社，1996，1341-1378.
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权利要求
1.一种新型复方肾保护氨基酸组合物及其应用，其特征是组合物及各组分的重量比为
2.如权利要求1所述的新型复合肾保护氨基酸组合物的应用，其特征是该组合物可应用于制备预防和/或治疗由属于顺铂类和缺血导致的急性肾功能障碍的药物。
3.如权利要求1所述的新型复合肾保护氨基酸组合物，其特征是组合物优选各组分的重量比为
4.如权利要求1和3所述的组合物，其特征是组合物最优选各组分的重量比为
5.如权利要求2所述的组合物的应用，其特征是该组合物制备的药物包括注射剂，粉剂，片剂，胶囊等多种剂型。
全文摘要
本发明提供了一种新型复方肾保护氨基酸组合物及其应用，该组合物包含甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、吉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等支链氨基酸。本发明提供的组合物适用于制备预防和/或治疗由顺铂类和缺血导致的急性肾功能障碍的药物，包括注射剂，粉剂，片剂，胶囊等多种剂型。本发明对接受顺铂类肿瘤化疗药物治疗的病人以及各种原因引起急性肾脏缺血再灌注损伤的病人，具有良好预防和/或治疗急性肾功能障碍的，可用于预防和/或治疗由顺铂类和缺血引起的肾功能障碍等疾病。
文档编号A61P13/12GK1439364SQ0311604
公开日2003年9月3日 申请日期2003年3月26日 优先权日2003年3月26日
发明者谢立平 申请人:浙江大学