药物等级植物药的制作方法

专利名称：药物等级植物药的制作方法
本申请系共同未决的，于1996年4月15日提交的U.S顺序号08/632,273的部分继续，而后者系于1995年4月14日提交的，因受惠于1997年2月4日提交的U.S顺序号08/774,550而放弃的U.S顺序号08/421,993的部分继续。
1. 发明领域本发明总体上涉及植物材料和将这些材料转变为医药上有用的和药学上可接受的形式的方法。更具体地，本发明涉及植物材料加工中使用组成和活性指纹图谱以产生具备药物等级(pharmaceutical grade)组合物品质的植物药，其适用于临床治疗和/或缓解疾病，紊乱和/或病症。
2. 发明背景制药生产基于每批产物的组成和生物活性的控制。这种标准化和控制在可预测的和一致性的病人治疗中提供了可重现的材料。由植物材料产生的植物药为期望药品所要求的控制，再现性和标准化的生产者提出了一个独特的难题。这个问题首先归因于草药中所含成分的多样性，和组成及效力的巨大差异。而所述多样性和差异是由原料生长和收获条件造成的。
植物是而且将一直是种类众多的医药化合物的来源。多个世纪以来，多种植物衍生的材料被用于治疗难以计数的不同的疾患。植物材料通常以由一种或多种植物或植物的部位制成的粉末或由来源于整株植物或选择的植物部位的提取物的形式存在。这些粉末和提取物构成了生物活性和非生物活性的化合物的复杂混合物的绝大部分。
虽然植物粉末和提取物广泛用于医疗，但是有大量问题与这些药物的使用相关。例如，植物材料的复杂化学性质使得难以以任一种可控的和可预测的方法使用植物材料。由不同的植物采集物获得的不同批的材料的化学组成的潜在差异使得这样的材料不适用于临床。
从正面角度来说，典型地发现于植物材料的生物学活性的复杂集合提供了协同生物活性形貌的潜在可能。然而，由于这种复杂材料的未知性质，这种在医药效能上的潜在的提高是不可预知的。
上述与植物药的固有的化学复杂性相关的问题导致了试图从多种具有重要医药意义的植物材料中分离生物活性成份的多方努力。与化学分离和分析技术的进展相随，这一研究领域迅速扩展。一经分离和纯化，就可以将多种活性成分用于临床以确立某一特定成分的药效。某一成分从植物材料中的分离和纯化是这一类药物开发过程的奠基石。一经纯化，就可以将所猜想的活性成分一般地与药用载体混合，进而接受实验动物研究，最终进行人体临床试验。一经证实临床效力，认为这类药物是药物等级的，因为它们含有单一的，或最多是很少数目的被充分表征的化合物，它们是以已知量存在的。
药物等级药是具有优势的，因为它们使治疗方案中，严谨地示踪各个化合物的作用成为可能。而且，药的剂量可被严格控制以提供相对可预测的医药作用。这样的药物等级药相对的纯净的一个不利之处是由于药物从其天然环境中分离出来，由天然存在的植物材料提供的复合及协同的生物学活性的潜能被削弱。这种分离的产品的研究由于敏感的生物学/植物学复合物的破坏而出现假象。许多工业专家相信，由这种协同活性带来的潜在的益处被与使用这种在临床环境下尚未被很好表征或控制的复合植物材料相关的临床风险超出。
虽然从植物材料中分离和纯化单个化合物是药物研究和开发的常见的形式，但仍有兴趣研究复合植物提取物以表征其医药品质。例如，如下面所讨论的，详细研究了槲寄生提取物。
槲寄生属于槲寄生属(桑寄生科)，该属包括许多种发现于全世界的半寄生植物。槲寄生是一种寄生植物，它生长于多种落叶树木，包括苹果，樱桃，橡树，灰山楂，酸橙，橡树子。许多世纪以来，将槲寄生及槲寄生的提取物用于广泛的治疗环境。槲寄生作为治疗许多病患的药品的疗效是大量的民间故事，迷信和神秘传说的主题。虽然槲寄生的许多早期用途更多地基于幻想而不是基于事实，但是槲寄生作为一种灵验的万应灵药的声誉是当之无愧的，因为这种寄生植物含有大量复杂的，具有药理学效力的成分。
自本世纪初开始，槲寄生和槲寄生的提取物的药理学性质经受了严密的科学考查。具体地说，建议将槲寄生提取物用于治疗一些具体的疾病包括心血管疾病，特别是高血压和动脉粥样硬化，癌症和关节病。建议将以商品名ISCADCR_，HELIXOR_，和PLENOSOL_为标注的发酵槲寄生提取物用于治疗多种具体疾病。将ISCADOR_和HELIXOR_皮下注射而将PLENOSOL_皮内和静脉内施用。这三种可商购制剂来源于由欧洲发现的槲寄生，欧寄生。
自1980年起，关于槲寄生的研究力度加强，原因是其免疫调节性质和治疗HIV和癌症的潜在用途。见国际癌症研究治疗杂志-癌症学43卷增刊1，1986。槲寄生研究者面临的一个主要问题是槲寄生及其提取物中药理学活性成分的分析，鉴定和标准化。这一问题被下一事实加重取决于槲寄生的种类。植物生长的场所，采集植物时的年份，具体的宿主树，所用提取方法和多种其他因素，发现于槲寄生提取物的多种复杂组分在其种类和数量上有很大变动。
发现的具有药理学活性的槲寄生的一类主要组分包括phenylpropanoid，外源凝集素，苯基丙烷，粘毒素，生物碱，类黄酮，木酚素，胺，苯基羧酸和多糖。虽然鉴定了一般出现在槲寄生中的主要几类药理学上重要的化合物。但研究者们在以下方面远未成功将多种可得的提取物标准化，以确定一种或几种组分是否可导致观察到的生物活性，以及具体的组分是共同起作用，还是单独有效力，槲寄生提取物的极其庞杂的性质和提取物组合物的固有的可变性使得使用提取物以完成临床研究极其困难。
以上有关槲寄生的讨论是关于正在详细研究中的植物材料的技术现状的例证。还存在许多有效力的，但相对不可预测的医药学性质的许多其它复杂植物材料和提取物。绝大多数这样的材料不能用于临床，因为这涉及了将未经充分表征的材料治疗病人的固有的风险，这些材料不具有确定的批次稳定性，因此在其组分上有很大变动。因此，需要提供用于标准化这样的复杂的植物学材料的方法，这样，它们能够更有效地用于临床研究和病人治疗。
3. 发明简述本发明提供了一种用于制备药物等级植物药的方法。该方法是“药物指纹图谱识别”工艺。在一实施方案中，该方法包括以下步骤提供包含多种具有特定生物学活性的成分的植物材料；从植物材料中移取一代表性的等份试样；将等分试样分离成多个标记级分，其中标记级分之每一包含至少一种活性成分，就每一标记级分确定给定生物活性的程度，以提供该等份试样的生物活性指纹图谱，以及将该等份试样的生物活性指纹图谱与已经就药物等级植物药确立的生物活性指纹图谱标准相比较，以提供一生物活性指纹图谱比较，从而基于生物活性指纹图谱比较确定该植物学材料是否是一药物等级植物药。
本发明还提供了包括以下步骤的方法提供具有给定生物学活性的植物材料，所述植物材料包含多个成分；将植物材料的代表性等份试样分离成多个标记级分，其中至少一个标记级分包含至少一种活性成分；就每一标记级分确定给定的生物学活性的水平以提供代表性等份试样的生物活性指纹图谱；将代表性等份试样的生物活性指纹图谱与已建立的药物等级植物药的生物活性指纹图谱标准相比较，确定植物材料是否是药物等级植物药。
在一实施方案中，一个或多个标记级分含有一种活性成分。
该方法还可能包含下列附加的步骤确定每一标记级分的活性成分的量以提供该等份试样的定量组成指纹图谱，并将定量组成及生物学活性指纹图谱与定量组成及生物学活性指纹图谱标准相比较，以确定该植物学材料是否是药物等级植物药。该方法还可以包含下列附加步骤，确定该植物学材料的等份试样的总的生物活性，并将其与一种已被确定为药物等级药的标准物的总生物活性相比较。
本发明还提供了一种制备药物等级植物药的方法，其包括以下步骤提供包含多个具有给定生物学活性的成分的植物材料，而且其中每一活性成分具有标准化生物活性形貌(profile)，从植物材料中移取代表性等份试样；将等份试样分离成多个标记级分，其中至少一个标记级分含有至少一种活性成分，测定出现在每一标记级分的每一活性成分的量。基于出现的每一活性成分的量和标准化成份生物活性形貌计算每一级分的生物活性以提供等份试样的计算的生物活性指纹图谱；将该等份试样的计算的生物活性指纹图谱和已建立的药物等级植物药的生物活性指纹图谱标准比较，以提供生物活性指纹图谱的比较，从而基于生物活性指纹图谱比较而确定植物材料是否是药物等级植物药。
本发明的方法可用于从任何植物材料中制备药物等级植物药。所述植物材料具有给定的或所需的生物学活性，优选地，植物材料是从植物材料制备的提取物，例如水或有机溶剂提取物例如醇提取物，或者超临界二氧化碳提取物。可选地，植物学材料可以是粉末状植物材料，种子油，芳香油或蒸汽蒸馏的产物。优选地，植物材料是均匀的材料。
植物材料可以是任何植物材料。合适的植物材料包括但不限于通常被称为芦荟、复盆子、黑“可霍喜”、春黄菊、Chaste tree、板栗、紫松果菊、晚樱、小白菊、大蒜、姜、银杏、人参(亚洲)、白毛茛、绿茶、Guggulipid、山楂、常春藤、卡瓦胡椒、甘草、Milk Thistle、西蕃莲、南瓜、臀果木、迷迭香、西伯利亚人参、Saw Palmetto、元宝草(St.John′s Wort)、荨麻和缬草等的植物的材料。植物材料还可以是包括但不限于植物材料例如Saw Palmetto和南瓜籽；紫松果菊和白毛莨；元宝草和缬草的植物材料的混合物。
本发明中活性成分可以是下列化学品之一种多聚乙酰，生物碱，碳水化合物，类胡萝卜素，肉桂酸衍生物，脂肪酸，脂肪酸酯，类黄酮，糖苷，类异戊二烯，大环抗生素，核酸，盘尼西林，肽，酚，聚乙炔，聚酮化合物，多酚，多糖，蛋白质，前列腺素，甾体和萜。
植物材料的生物活性/临床适应症可与人或其它动物的任何疾病，失调或病症相关。因而该方法可以用于生产治疗和/或缓解和/或预防人类和/或脊椎动物疾病，失调或疾病的药物等级植物药。例举的适应症包括，但不限于，过敏性/炎性疾病，心血管疾病，癌症或中枢神经系统疾病，胃肠道疾病，代谢疾病，恶心或由微生物或病毒诱导的疾病。
在这些方法中，可将等份试样分成生物学活性和无活性组分。而且，标记级分可包含一类相关组分。
本发明还提供了一种制备一药物等级药的指纹图谱的方法。而且，本发明还提供了由上述方法制备的药物等级药。3.1定义本说明书所用术语“药物等级”意味着在植物药中的某些指定生物学活性和/或非活性成分必需在某些指定的绝对和/或相对浓度范围内和/或当用某些疾病，失调或病症-特异性生物学活性试验进行测定时，该组分必需展示出一定的活性水平。这些疾病，失调或病症可以折磨人或动物。
在此所用“组分”意味着天然存在于植物药中或者被加入到植物药中的分离的化合物(即化学品)，以制备具有在限定的生物活性范围和/或组成范围之内的组分的药物等级植物药。
在此所用“活性成分”意味着一种或多种成分，其单个组分在疾病特异性生物学试验中的活性之总和占观察到的植物材料的生物学活性的基本部分。优选的，活性成分的活性总和占观察到的生物学活性的大部分或多于50％。
在此所用“级分”意味着一组成分或一类结构相似成分，其具有确定的参数例如溶解度，分子量范围，极性范围，吸附系数，结合特征，化学反应性或选择性可溶性。最常见的成分是色谱分离技术的产物，即，闪式色谱，制备型高效液相色谱(HPLC)，制备型气相色谱，制备型薄层色谱，亲和色谱，分子大小排阻色谱，液-液色谱，例如，逆流色谱或向心色谱。
本发明可通过参见下述内容而被更透彻地理解发明详述，在下面部分中的具体实施方案之实施例和附图。
4. 附图简述

图1.是本发明的步骤的图解，该步骤用于建立标准化学和/或生物活性指纹图谱，在制备药物等级药的过程中，后继加工的植物材料与该指纹图谱进行比较。
图2.是本发明的方法的图解说明，该方法用于将植物材料加工成药物等级药。
图3.是用于分离不同种类的生物学活性组分的方法的图解说明。
图4.显示了来自商购产品的Saw Palmetto的级分分析的结果。纵轴是以重量/重量百分比形式出现的。这两个轴是多种脂肪酸和脂肪酸酯和溶剂系统的级分。
图5.展示了Saw Palmetto提取物#3的增加的浓度的特异性3H-DHT结合的抑制。假定活性组分的分子量是200，计算活性组分的摩尔浓度。
图6.展示了月桂酸乙酯的增加的浓度的特异性3H-DHT结合的抑制。
图7.展示了通过亚油酸乙酯的增加的浓度的特异性3H-DHT结合的抑制。
图8.展示了5种不同的商购Saw Palmetto产品的化学分析。纵轴是以重量/重量百分比形式出现的。另一轴是脂肪酸和脂肪酸酯和来源材料。
图9.展示了槲寄生提取物的分析的色谱步骤。
图10.展示了元宝草的级分分析。纵轴是以重量/重量百分比形式出现的。水平轴是级分和化学组成成分。
图11.展示了元宝草的化学分析。纵轴是mg每10ml产物，其它轴是化合物和商购来源。
图12展示了姜的级分分析。纵轴是以重量/重量百分比之形式。其余轴是级分数和具体化学成分。
图13.展示了5种可商购姜产品的化学分析的结果。纵轴以毫克/胶囊的形式。水平轴是姜组分和商购来源。
5. 发明详述5.1 药物指纹图谱识别方法本发明提供了一种用于生产可分类为药物等级的植物药的方法。该方法被称为“药物指纹图谱识别法”。由本发明的方法制备的药物等级植物药特别适用于临床研究，而且，更重要的适用于治疗病人。该方法保证了当药物用于具体治疗方案时，药物将是质量恒定的并且恒定地适于用作人类及脊椎动物的预防剂及治疗剂。
本发明提供了精细地控制植物提取物及其它植物材料，例如植物提取物和哺乳动物组织衍生的生物制剂的质量，剂量和临床效力的能力。本发明的一方面涉及就多种生物学材料建立了化学和/或生物学活性指纹图谱标准。一经建立，将指纹图谱标准用于药物生产工艺以保证植物材料合乎药物等级的要求。就多种植物材料给出已经建立的具体的定量和生物学指纹图谱是本发明的另一方面。这些指纹图谱可以用于确定一个具体的植物材料就一具体的治疗方案而言，是否合乎药理学活性和组成要求的水平。这一测定对保证用该植物材料进行临床研究和治疗病人是基于恒定的和可证实的提取物组分参数十分重要。
本发明可用于提供被充分表征，其组成在不同批次是恒定的，因而被精确剂量，有效用于临床的植物材料。在此描述的方法提供了这样一种保证临床试验的结果是可重复的。
最初，获得感兴趣的植物材料的样品。许多植物性药材是可作为原材料或经加工的提取物而商购的。它经常是被试图用作药物的植物提取物或其它组合物。经加工的材料可能包含展现一给定生物学活性的多个活性组分，和不直接展现该感兴趣的生物活性的无活性组分。在一实施方案中，从该植物材料中移取一份等份试样并进行质量安全或标准化工艺处理。优选地，该等份试样是均匀植物材料的代表性等份试样。该步骤包括将植物材料的等份试样分成多个标记级分，其中标记级分之每一都含有至少一个活性成分或者在某些情形下是无活性成分之一种。测定每一个标记级分中的活性成分或无活性成分的量，以提供等份试样的定量指纹图谱。同时也测定每一个标记级分的生物学活性的程度以提供该等份试样的生物学活性指纹图谱。然后将该等份试样的化学和/或生物学活性指纹图谱与已建立的、药物等级药物的相应指纹图谱进行比较。如果该植物性药材的指纹图谱与标准指纹图谱匹配，那么将该植物性药材确定为药物等级植物药。如果不匹配，那么将该植物性药材加工以匹配标准指纹图谱，或者弃置。
5.1.1. 用于建立药物指纹图谱的方法当已知一系列推定的活性成分时，用于建立一植物性药材的药物指纹图谱的方法开始于文献的回顾。这涉及该植物性药材的化学文献，生物学文献，发表的生物试验和临床数据的回顾。特别有用的信息来源是Norman Farnsworth博士编纂的NAPRALERT计算机数据库，药物科学的合作研究项目。伊利诺大学，芝加哥；Leung和Foster，食品，药品和化妆品中常用天然成份百科全书第二版John Wiley和Sons纽约，NY，1996草药和植物药，N.G.Bisset编CRC出版社BoCa Raton，FL，1994；Duke，生物活性的植物化学品及其活性手册，CRC出版社BoCa Raton，FL，1992；Tyler和Foster在非处方药一书中的“草药和植物药产品”Berardi等编，United Book出版公司华盛顿特区，1996。对于一给定的适应症，必须研究文献，确认推定的活性成分确实与该疾病状态相关。另外，如果已知有关该推定的活性成分和已知有关该适应症的任何生物试验，该生物试验应当与该适应症和推定的活性成分相一致。合适的生物试验与临床相关目的紧密相连。生物学试验应当在一广泛浓度范围内定量进行。一般地，绘制IC50曲线(50％抑制浓度)或合适的Ki曲线。然后进行植物性药材的推定活性成分和色谱级分的全面的化学和生物学分析。分析该结果，以进行样品中每一化学成分的生物学活性的定量分析。然后，将样品的生物学活性作为整体和单个组分的生物学活性进行比较。这时单个的化学组分可与临床相关目的相联。类似的方法论还可以用于测定刺激效应的生物试验。
基于单个的组分的活性、并已知总活性，当合用时，这些组分将占生物活性的大部分份额。一般地，合用活性将占总活性的至少25％。
优选地，单个活性组分活性的总和占观察到的生物学活性的大部分或多于50％。更优选的，分离的单个组分造成了多于70％的活性。更加优选的，分离的单个组分造成了多于80％的生物学活性。
另一考虑是选择尽可能少的活性成分作为药物指纹图谱的一部分。较少的活性成分对于原材料的选用和生产的实际考虑是重要的。本发明中，在相关化学成分和生物活性之间建立了对映关系。一旦建立了一个满意的对映关系，不必对每一样品进行生物学指纹图谱识别。对于合适的成分和/或标记级分进行化学分析。当然，感兴趣的植物性药材的每一样品足以占生物学活性的大部分份额，且确定一给定的植物样品是药物等级的。
在一实施方案中，本发明可以涉及下述步骤之一。如图一所示的一种工艺中，涉及建立一给定的药物等级植物药的组成和生物活性指纹图谱标准。一经建立指纹图谱标准，便可以如图2所示将植物性药材实际加工成药物等级药。
建立一给定植物性药材的化学和/或生物活性指纹图谱的起始步骤涉及将提取物或粉末由图1中步骤1所述分离成一个或多个小组。这些小组基于其作为标记物的效能(其可能包含或不包含活性组分)就其指纹图谱分离出来和鉴定，该指纹图谱是为该加工的植物材料而建立的。被选择和鉴定用作效力标记物的推定的组分或组分群将随所加工的植物性药材和药用用途而有很大变动。就每一植物性药材应当至少有两个推定的标记物。就复杂的植物提取物或粉末而言，效能标记物可以多于五个，可能高达15至20或更多。多数情况下，效能标记物基于其就一给定的药物学应用的潜在生物学活性或其对生物活性的贡献而被选择和鉴定。对于不同的适应症，可将同一植物性药材用不同的提取方法来制备提取物，以最优化具体的生物学活性组分。可将其自身不具明显生物活性的标记物分离出去，也可包括用作指纹图谱中的标记物。当标记物的出现，指示为提供植物药的总体观察的生物活性的绝大部分所必需的其它组分的存在时，这些“代理”标记物用作内标是合意的。
最初将植物性药材分离成多个推定标记物小组通过传统分离技术完成，这些分离技术从简单的提取到复杂的亲和层析，包括凝胶过滤层析，闪式硅胶层析，和反相层析。一旦就一给定的植物性药材鉴定了推定的标记物，按图1中步骤2之所述测定每一标记物的生物学活性。具体的用于测定植物性药材生物学活性的生物试验基于植物性药材的预想的用途。优选的，生物学试验提供推定的标记物的关于将用该植物性药材治疗的病症或适应症的生物学活性。
将在步骤2中获得的生物学试验的结果用于鉴定具有所需生物学活性的组分(步骤3)，和那些活性较低或基本无活性的组分(步骤4)。在步骤3和4中鉴定的每一小组然后经定量分析，以确定每一小组中每一成分的含量。然后，如图1中步骤5所描述，将生物测试和定量组分测试的结果用于绘制该植物性药材的生物测试指纹图谱和/或化学测试指纹图谱。作为建立植物性药材的指纹图谱的一部分，确定可接受范围的生物活性和/或化学组成。这首先基于就每一提供所为整体的加工材料的所期望的药理学活性的标记物建立生物活性定量的量的可接受范围。
另外，可以评价活性和无活性标记级分的不同组合，以确定由活性和无活性级分组合造成的，所需生物活性的潜在的增加。
在步骤5中建立的生物测试和定量指纹图谱为植物性药材提供了精确的鉴定，该植物性药材可用于建立临床应用所必需的剂量方案和治疗计划。剂量方案和治疗计划的建立通常采用研制一种新药时常规所用的传统临床方法。用于确定剂量和治疗进程的加工材料必须匹配和符合步骤5中建立的指纹图谱的要求。该方法保证了剂量和治疗进程是有效的和可重复的，因为在剂量和进程研究中所用的加工材料都具有按照本发明的同样的指纹图谱。
将由如图1所示常规步骤而测定的生物测试和定量指纹图谱用作生产药物等级植物药的生产步骤的一部分。将指纹图谱用作质量保证或标准化步骤的一部分以保证一给定的植物性药材含有合适的化合物，并被正确加工，以提供与按照图1给出的步骤标准化和测试的材料具有相同的临床表观的植物药。
图2中图示了用于制造本发明的药物等级植物性药材的一例举性步骤。感兴趣的植物性药材21首先通过提取，磨成粉或其它加工步骤以形成经加工的植物材料22。然后，分析经加工的植物材料22的样品以确定它是否匹配在图1的标准化步骤中所建立的指纹图谱要求。这一质量保证或标准化步骤在图2的23中描述。如果加工的材料符合先前建立的某一具体材料的指纹图谱要求，证明那么它为如步骤24所表示的药物等级。如果材料接近，但并不十分匹配标准物指纹图谱，那么将它修饰，如匹配指纹图谱标准所要求的(步骤25)，修饰加工过的材料以符合指纹图谱标准可以通过多种方法完成。进一步加工植物性药材的方法可以包括植物性药材的附加的提取，选择性提取，选择性加工，不同批号的重组(如混合高和低剂量的批号以制备药物等级材料)，或者如果需要，加入多种化合物。如果该植物性药材基本上处于生物活性标记和定量标记的指纹图谱范围之外，那么将该批号弃置(步骤26)。
在一实施方案中，用于确定一给定植物性药材是否是药物等级的质量保证标准化步骤23涉及获得一均匀的样品，优选同源的样品，或待测植物性药材的等份试样。样品应当包括造成了材料的观察到的生物学活性，产生了先前确定的标准的生物活性和/或化学指纹图谱的活性成分。样品也会包括一种或多种无活性成分。无活性成分是那些可能不具备直接可测的生物学活性的成分。无活性成分包括以下类具有的活性太低以至不能占活性大部分份额的成分；其出现表明了其它生物活性成分的存在，并可用作这些成分的代理标记的成分；在相关测试中是化学或生物学无活性的无活性成分。优选地，样品仅是待测生物材料的小的等份试样。因此，获得为整批材料的代表性的均匀的样品，优选同源的样品是重要的。
图3中展示了一个更详尽的说明，图3展示了植物性药材水提取物中出现的不同成分的最初的分离。通过顺次提取和沉淀分离水或有机相中的活性成分。图3中的方案特别适合于从植物性药材例如槲寄生中分离一类水溶性的活性成分。
图3中图解了一例举性的用于将植物分离成主要类别的化学成分的方法。首先，应当采用新鲜植物(包括叶，根，花，浆果和茎)。如果需要，可采用植物的特定部位，如叶，花，茎或根。
特定部位或整株植物可在液氮温度下冷冻。这便于研磨，而且保持了活性成分的完整性和效力。
将研磨的粉末用蒸馏水反复提取。如果需要，提取可以用热水，醇，其它有机溶剂，醇的水溶液，稀释的乙酸或其任意组合进行。实际选择温度优选地靠近或处于水的沸点。优选地，将水提取物的整体生物活性在起始时测定。将合并的水提取物进行特定的生物测试，例如，如果将该药用作杀菌剂时，抑制培养皿中细菌生长的测试。或者是，假如试图将该药用作抗癌药时，优选地进行针对癌细胞的细胞培养的测试。从这些数据计算每毫升提取物中所含的生物活性单位(生物活性单位被定义为在测试系统中，抑制细菌或癌细胞50％生长时所需的该提取物的稀释的倍数)。类似地可以计算刺激性效应、例如免疫刺激的生物活性效应的生物活性单位。
为建立根据本发明的指纹图谱，根据图3所示步骤提取植物，以将其分离为主要成分(例如，皂草苷，萜类化合物，类脂类，生物碱，核酸，蛋白和碳水化合物)。成分的每一分离的小组就其所需生物活性进行测试。这可能指明活性(例如，在欧寄生的蛋白质和生物碱级分中)。一个或多个化合物的活性类群可经亲和层析，高压液相色谱，或气相色谱进一步分离成单个成分。基于重量和特异生物活性单位测定主要引起生物学活性的成分。这些成分提供了指纹图谱以确定始草本植物提取物的药理学要求。每ml药物等级提取物的生物活性单位提供了建立临床研究的精确剂量的方法。
样品一经分离成单个标记级分，且至少一个级分有至少一个活性成分，分析每一级分以确定其中的活性成分的含量，并提供样品的定量指纹图谱。可使用任何一种已知的定量分析方法来完成每一级分的定量分析。例举的定量方法包括重量分析法，光谱分析法或使用定量检测器，例如那些用于气相色谱或高效液相色谱和其它分离系统的检测器。其它合适的定量分析方法包括酶促反应，放射测量，比色，分光光度测量，荧光或磷光法和抗体测试如酶联免疫吸附测试(ELISA)或放射免疫测试(RIA)的分析法。
在一实施方案中，将每一级分的定量分析结果用于绘制该样品的定量指纹图谱。指纹图谱由每一标记级分的成分的量和成分的认定组成。该定量指纹图谱然后与已建立的已知标准物指纹图谱相比较，以考虑该材料是否为药物等级。如果样品的定量指纹图谱落入了药物等级指纹图谱给出的量的范围，那么该材料可能被鉴定为药物等级。
作为质量保证测试的一部分，单个标记级分可经生物学测试。用于测试不同级分的生物学测试与那些用于标准品指纹图谱的测试应当是相同的，而且应取决于该材料倾向的具体临床用途。
将该材料的生物活性指纹图谱与已建立的已知标准品生物活性指纹图谱相比较，以考虑该材料是否为药物等级。如果样品的生物活性指纹图谱落入了药物等级指纹图谱给出的生物活性范围；那么将该材料鉴定为且证实为药物等级。
5.1.2. 建立药物指纹图谱的另一可选方法当推定的活性成分未知时，绘制植物性药材药物指纹图谱识别的方法亦开始于文献回顾。这涉及回顾关于该植物性药材和具有相关活性植物性药材的可能得到的任何化学文献，生物学文献，发表的生物测试或临床数据。基于疾病状态，选择一系列相关生物学测试。生物测试中分析了总的样品或提取物的活性。将这些展示活性的生物测试然后用于分析其推定的活性组分尚未知的植物性药材的级分，级分分离基于常规方法，例如，借助于介电常数，极性，大小或吸附力进行分离。然后分析级分以确定哪个级分造成了活性。假如发现了活性，将每一活性级分再进行级分分离以分离出单个推定的活性成分，即，纯化学化合物。在知道了单个化学化合物和知道了它们定量生物活性的基础上，可绘出定量的效力曲线，并且可以测定每一单个化学成分的50％抑制浓度(IC50)。如果推定的活性成分是激动剂，那么需要其它参数(结合，激活，响应)。一般情况下，生物测试由成分，级分或全提取物的刺激或抑制效应的合适的测试组成，然后对这些效应进行合适的定量评价。最可能的(或典型的)，其中标准的(或放射标记的)激动剂引起可测量效应的测试中、受试材料引起的抑制一般通过测量IC50值，或其它合适的测量(如Ki)来测定和表达。然后，将单个推定活性成分的活性相加，将其和与未经级分分离的植物性药材样品的活性相比较。如果这些成分占活性的绝大部分份额，那么人们将获得其活性成分未知的植物性药材的“活性成分”的起始指纹图谱。
5.1.3. 建立药物指纹图谱的方法的其它改动以上概述的，其推定的活性成分未知的植物性药材的药物指纹图谱识别的普通方法有一些改动，这些改动将在分析过程中造成一些难题。一种改动发生于单个级分的总和未占植物性药材生物学活性的绝大部分份额的情况。这种情况下，有几种可能的原因造成了单个成分的减低的活性，一，活性成分的分解或降解或，二，协同效应。在另一可能的方案中，可能从任何一个级分中看不到明显活性，但是在生物测试中，全植物性药材或提取物显示出活性。
确定在测试过程中活性成分是否分解是相对简单的。人们可以仅加合所有的级分。将加合的级分的活性与粗制品的活性相比。假如活性基本丧失，那么问题可能是分解。为确定哪一个活性成分可能分解，将粗制植物性药材的色谱分析与合并的级分的色谱分析相比较。消失的，或者大小减少的峰表示该组分分解。有许多方法克服分解。一般地，采用温和提取/级分分离方法，如液-液色谱(逆流色谱)或超临界二氧化碳提取或色谱。
单个级分的活性未占预计总活性的绝大部分份额的另一解释是，在一个或多个活性成分间存在的协同效应。为证实协同效应确实发生，需要分析配对重组级分。如果合并级分显示出比单个级分更多的活性，那么两个或多个单个级分可能协同地起作用。例如，你具有三个级分，每一级分造成10％的生物活性(它们未合并时的加合的生物活性是30％)，但是合并的级分造成100％的活性。这种情况下，级分是协同地起作用。通过重复配对的级分合并或观察较大级分，将发现任何协同活性。一旦两个级分显示出协同，将它们如上再次进行级分分离，研究单个级分对或分离成分对以发现起协同作用的单个成分。也可以研究单个成分或级分的三种方式比较。
如果在植物性药材显示了活性的生物测试中，级分没有活性说明了什么？解释包括分解，协同，或者许多许多活性成分象这样单个级分未显示出活性。第一步是将第一起始级分分级分离，且观察生物测试中的活性成分是否出现。如果这一步确未成功，那么应该合并级分，并分析以确定活性成分是否被分解。如果分解了，那么应该进行上述的合适的测定。如果没有分解，那么试一试级分分离的其它方法。最终，足够大的，或合适大小的，或选择的级分将显示出活性。如果存在着协同的疑虑，那么进行上述协同部分的步骤。
5.2 植物材料的类型根据本发明，可以加工的植物材料的不同类型的例子包括但不限于来自高等植物的材料。植物性药材的例子包括Leung和Froster，1996；Bisset，1994；或Tyler和Foster，1996参考文献中发现的品种。在详述中例举的植物性药材具体例子包括下面的羊荆(AgnusCastos.)，芦荟，亚洲人参，覆盆子，黑“可霍喜”，春黄菊，栗树，彩绒革盖菌，紫松果菊，晚樱，小白菊，大蒜，姜，银杏，白毛茛，绿茶，Guggulipid，山楂，常春藤，卡法胡椒，甘草，Milk Thistle，槲寄生(美洲，亚洲和欧洲变种)，西番莲，南瓜，臀果木(Pygeum)，迷迭香，西伯利亚人参，Saw Palmetto，元宝草，荨麻和缬草。另外，对于一种或多种植物材料例如紫松果菊和白毛茛的组合，可以按照本发明进行加工。
5.2.1 加工和提取植物材料的方法可以加工植物材料以形成整株植物或其选择部位的水或有机提取物。植物材料可以整株或部分加工形成粉末。许多感兴趣的植物材料可作为粉末，水提取物，有机提取物或油商购。在一实施方案中，优选植物材料的提取物，因为它们易溶于液体药用载体。然而，粉末状植物材料很好地适用于那些药物以固体形式，例如，片剂或胶囊的施用方式。这些方法是本领域技术人员熟知的。此外，许多植物材料和/或提取物是可商购的。下面实施例中提供了加工和提取植物性药材的例证。另外的例子在下面详述中提供。
就一典型的根而言，可将它切片，冷冻或研成粉末。成粉末后，将其与合适的溶剂一起振荡和过滤(Tanabe等，1991，ShoyakugakuZassi.45(4)316-320)。或者是，采用以下方法将根匀浆，丙酮提取和过滤；汽馏植物性药材以获得精油，馏出液溶于丙酮-水或合适的溶剂；或者冷冻和/或冷干切利的根，并且用丙酮-水提取形成的粉末(Tanabe等，1991，Shoyakugaku Zassi 45(4)321-326)。其它加工植物性药材的方法是用100℃的水进行水提取(Yamahara等，1985，J.Ethnopharmacology 13217-225)。可将上述方法得到的起始溶剂提取物进一步用合适溶剂进行液/液提取。在两步中植物性药材可以分别用极性和非极性溶剂提取。然后蒸发溶剂合并级分(Nagabhusan等，1987，《癌症通讯》(Cancer Let.)36,221-233)。植物性药材亦可加工成可蒸煮的糊或粉末(Zhang等，1991，《食品科学杂志》(J of Food Science)59(6)1338-1343)。
许多溶剂可用于提取干的植物性药材，如丙酮，乙腈，二氯甲烷，乙醇，异丙醇和超临界二氧化碳(Sipro等，1990.《国际食品科学和技术杂志》Int.J.of Food Science and Technolgy)25566-575，在此作为参考文献)。
其它植物性药材例如Saw Palmetto，医药产品是种子油或干浆果。典型的制备方案中，是制备已烷或超临界二氧化碳提取物。许多制品是可商购的，如PermixonTM或TalsoTM。植物性药材的超临界二氧化碳提取物的例子见Indena，欧洲专利号0250953B1。或者是，将植物性药材压碎和在索格利特萃取器中用合适的溶剂(90％)提取(Elghamry等，1969，Experienia25(8)828-829)。植物性药材可用乙醇提取(Weisser等，1996，《前列腺》(The Prostate)28300-306)。
可以用许多种冷干方式制备干材料，包括通过微波干燥，用液氮冷冻和研成粉末，真空下于70℃干燥10小时，或背阴处风干(List和Schmidr，Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis，SpringerVerlag纽约，1993，1973-79；Araya等.，1981，《比较病理学杂志》(Journal of Comparative Pathology)，135-141)。茶的稀释水提取物，亦被称为煎剂，可在60-80℃水中制成(Nosel和Schilcher.1990)。当颗粒大小小于.25mm时，提取更充分(List和Schmidt，《植物药技术》(PhytopharmaceutiCal Technology.)CRC Press.BoCa Raton，FL，1989)。
有多种制备油提取物的指南。植物性药材可在45℃油中浸渍10天，其它推荐方案是于70℃浸渍10天(Hobbs，1989，HerbalGram18/1924-33；Smith等，Quality Valdation Laboratory-HerbPharmWillams，OR，1996)。例如报道元宝草，在提取过程中将制品暴露于日光将引起以栎精计算的类黄酮含量增加四倍(Maisenbacher和Kovar，1992)。另外，据报道对于元宝草，当材料进一步用乙醇提取，并与油混合时，金丝桃素增加了两倍(Georgiev等，1983，Nauchni Tr.-Vissh Inst.Plovid.30175-183)。
另一种选择是，制备植物性药材的醇-水制备物(Dyukova，1985，Farmitsiya3471-72；Geogiev等，1985，Nauchi Tr.-Vissh Inst.Plovid 32257-263；Wagner和Bladt，1994，Kowalewski等.，1981，Herba Pol.27295-302)。根据HagersHandbuch，植物性药材的酊剂，例如元宝草，通过使用药或冷冻乙醇浸泡，过滤且在棕色瓶中保存来制备(List和Horhammer，1993)。
某些植物性药材，例如元宝草，是温度和光敏感。对于这一类植物性药材，材料可以和制冷剂一起包装，或在冷东条件下运输，且保护其免于光和空气损害。当贮存于60℃(140°F)多于6星期时，在元宝草的粉末状提取物，片剂和汁制品中金丝桃素含量明显下降。发现贮于20℃的干提取物至少一年稳定(Adamski等，1971，Farm.Pol.27237-241Benigni等，HyperiCam.Piante MedicinaliChimiCa，Farmacologiae Terapia，MilanoInverni和Della Beffa；1971)。发现于油制剂的元宝草的其它成分，金丝桃素和adhyperforin是高度不稳定的。特别是暴露于光时，可在短至14天内降解(Meisenbacher等，1992，《植物药》(Planta Med)351-354)。对于乙醇提取制品，稳定性(无空气时)增加到6个月。类似地，最多可达4种呫吨酮，和几种类黄酮包括栎精和I3′，IL8-二芹菜苷配基的发现提示了这些可能存在于外提取物的活性成分中(Bystrov等，1975，《四面体通讯》(Tetrahedron Letters.)322791-2794)。
5.3 级分分离一旦制备了样品提取物和/或作为选择，购买了可商购提取物，一部分需经受级分分析。如果指纹图谱已经建立，将样品或等份试样被分离成标准品指纹图谱中出现的同样多的标记级分。每一标记级分将包括一个或多个活性或无活性成分。标记级分建立于待测的每一植物材料的单独的基础上。某些材料仅需要很少的标记级分。而其它许多复杂材料，可能有许多标记级分。例如槲寄生，欧寄生蛋白质提取物，优选的蛋白质标记级分是那些基于其与级分的糖结合亲和性而分离的级分。然而，用于将材料鉴定和分离为标记级分的不同参数可基于出现在植物材料的成分的类型而确定。可用任何传统的分离技术包括液相色谱和提取方法来完成样品至标记级分的分离。可以使用用于建立标准品指纹图谱的同样步骤。因为，多种级分可用于生物活性测试，优选地，采用非破坏性分离技术。液体柱层析是一种有用的分离技术，特别是使用基于化合物(如碳水化合物和靶酶)的特异结合能力的亲和层析。
级分分离后，弃去溶剂，将材料溶于适于生物测试的介质中。合适的介质实例包括DMSO，乙醇，多种去垢剂，水和合适的缓冲液。溶剂的选择将基于待分析的成分的化学性质和与测试体系的相关性。
5.4 建立合适的生物测试例举的生物学测试可包括任何细胞增殖测试。例如，L1210细胞抑制的测定。免疫活性，与特异性疾病相关的关键酶的抑制。其它可用于生物测试的转化细胞系的例子包括HDLM-3何杰金氏淋巴瘤和Raji Burkitt氏淋巴瘤，肝癌细胞系，原代或建立的人/动物细胞系培养物，其携带特异的细胞受体或酶。
将生物学测试的结果用来进行该材料的生物活性指纹图谱识别。指纹图谱可以简单到两个选定标记级分的测试。相反地，指纹图谱可以包括在多种不同级分上进行多种不同的生物测试。同一测试可在不同的标记级分上进行。而且，不同的测试可在同一标记级分上进行。生物测试的组合取决于给定植物材料的复杂性和它倾向的临床用途。生物测试和那些在建立标准品材料的生物活性指纹图谱时完成的相同。
5.4.1 基于酶促和受体的测试在本发明的实施中基于酶促和受体的测试是优选的。选择的测试或者基于一种临床疾病所接受的酶促测试，或者由于一给定的临床疾病的相关测试而入选。选择合适的生物测试是重要的。理想地，生物测试应当是严格的、能够在长时间内再现，并在一宽浓度范围里显示出定量剂量反应。活性成分未知的植物性药材面临的一个问题是选择相关生物测试。这时，将人类治疗用途用作指南以选出基于可能作用机制的本领域已知的测试。作用机制应当与临床相关目的一致。有许多基于酶促活性，抗体结合活性，细胞培养活性，针对组织的活性和整体动物体内活性的临床相关测试。
这一节将讲述酶促和抗体结合测试。有许多关于酶促或受体测试的书，例如，《酶学方法》，学术出版社或Boyers，《酶》，“生物活性天然产物、检测、分离和结构测定”，S.M.Colegate和R.J.Mdyneux，CRC出版社(1993)，亦讨论了特定的生物测试。“细胞免疫方法”，R.Rafael Fernandez-Botran和V.Vetvicka.CRC出版社(1995)描述了免疫细胞激活测试和细胞因子受体测试。“出于新药理论和实践考虑而筛选微生物代谢产物”描述了发现药物的其它方法(Yarbrongh等(1993)《抗菌素杂志》(J.Antibiotics)46(4)536-544)。还有许多商业合同研究商品包括PanlabsTM和NovascreenTM。
例如，对于一可用于治疗神经性疾病的植物性药材，这一系列生物测试可能包括以下测试肾上腺素能受体，胆碱能受体，多巴胺受体，GABA受体，谷氨酸受体，单胺氧化酶，氧化氮合成酶，阿片受体或血清紧张素受体。对于心血管疾病来说，这一系列生物测试可能包括以下测试腺苷A1激动和拮抗；肾上腺素能α1，α2，β，激动和拮抗；血管紧张肽I抑制，血小板凝集；钙通道阻断；回肠；心脏心律失常；心脏变力性；血压；心率；变时性，收缩性；缺氧，低气压，缺氧，KCN；门静脉，去极化钾；门静脉，自发性激活；或血栓烷A2、血小板凝集。代谢失调可采用下列生物测试胆固醇，血清HPL，总血清；血清HPL/胆固醇比；HDL/LDL比；葡萄糖，血清所含葡萄糖；或肾功能，钾尿排泄，尿食盐排泄和尿体积改变。对于变态反应/炎症疾病可用以下生物测试变态反应，被动皮肤过敏性；缓激肽B2；收缩性；气管组胺H1拮抗；角叉菜聚糖引起炎症，白三烯D4桔抗；神经激肽NK1拮抗；或血小板激活因子，血小板凝集。对于胃肠道疾病可采用下列生物测试胰酶分泌素CCKA拮抗；胆碱能拮抗，外周血；胃酸，五肽胃泌素；胃溃疡；乙醇；回肠电刺激调节；回肠电刺激痉孪或血清紧张素5-HT3拮抗。对于抗微生物，抗真菌，抗滴虫疾病可采用下列生物测试，白色念珠菌，大肠杆菌，肺炎克雷白氏杆菌，蛙分枝杆菌，普通变形杆菌，绿脓假单孢菌，金黄色葡萄球菌的甲氧苯青霉素抗性株，牛毛滴虫，须发癣菌。对于其它适应症，本领域技术人员可选择一系列相关的生物测试。
基于酶或受体的测试的具体例子包括下列羟醛还原酶；血管紧张肽转化酶(ACE)；大鼠雄激素受体；CNS受体；环加氧酶1或2(Cox1，Cox2)；DNA修复酶；多巴胺受体；雌激素受体；血纤蛋白原；GABA A或GABA B；β-葡糖醛酸酶；脂加氧酶，如，5-脂加氧酶；单胺氧化酶(MAO-A，MAO-B)；血小板激活因子(PAT)；前列环素；前列腺素合成酶；血清紧张素测试，如，S-HT活性或其它血清紧张素受体亚型；血清紧张素再摄取活性或血栓烷合成活性。具体酶促测试可从多种来源得到，包括PanlabsTMInc(Bothell WA)和NovascreenTM(Baltimore，MD)。其它测试包括“ATPase抑制，苯并芘羟化酶抑制，HMG-CoA还原酶抑制，phosphodientrase抑制，蛋白酶抑制，蛋白生物合成抑制，酪氨酸羟化酶抑制，睾酮-5α还原酶和细胞因子受体测试。
5.4.2 细胞培养和其它测试酶促测试之外还有其它生物学测试。优选地，这些测试在细胞培养物上进行，但亦可在整体生物体上进行。细胞培养物测试包括培养的肝细胞和肝细胞瘤的活性(就其对于胆固醇水平，LDL-胆固醇受体水平，和LDL/HDL胆固醇比的影响)；针对L1210细胞的抗癌活性，PC12人成神经细胞瘤细胞的调节受体的水平，促黄体素(LH)，促滤泡激素(FSH)或促乳素的细胞培养物活性；Ca2+流入肥大细胞；吞噬作用，淋巴细胞活性或TNF释放酶的细胞培养物测试；血小板凝集活性或针对HDLM-3何杰金氏淋巴瘤和Ruji Barkitt′s淋巴瘤细胞的活性。抗有丝分裂活性，感染细胞中抗病毒活性，抗细菌活性(细菌细胞培养物)和抗真菌活性，可以采用组织或整体动物测试，包括抗炎性小鼠耳皮炎，大鼠足肿胀；肌肉收缩测试，血管舒张测试；或整体动物碳廓清测试。这些测试可从多种来源得到，包括PanlabsTM(Bothell.WA)。
5.4.3. 抗癌活性药的抗癌效应可在一系列细胞培养物体系中进行研究；这些包括小鼠白血病，L1210，PS88，L1578Y等。人源的肿瘤细胞系如KB，和Hela细胞亦可采用。在一典型的测试中，肿瘤细胞生长在合适的细胞培养基，如含10％胎牛血清的RPMI-1640上。取决于细胞系的生长周期，将对数期生长细胞用不同浓度的测试材料处理14-72小时。在培养的终结，通过计数未处理和经处理的小组的细胞来评价细胞生长。可通过台盼蓝内含物实验或通过由线粒体脱氢酶引起的四唑染料的还原来确定细胞学活率。药在培养物中抑制细胞生长的能力可能提示了它可能的抗癌效应。将这些效应在作为人类疾病模型的患瘤小鼠中鉴定(khwaja.TA.等(1986)《(肿瘤学》(Oncolagy)，43(附刊1)42-50)，最经济的评价一种化学剂的抗癌效应的方法是研究它对于肿瘤细胞在补充了10％胎牛血清的最小必需培养基(MEM)上的生长的影响。暴露于药剂的细胞(一式两份)于湿润的CO2孵箱中于37℃温孵2-4天，这取决于肿瘤细胞的数量倍增时间。在温孵结束时，计数细胞，由通过与在同一条件下生长的未处理的对照细胞相比较，计算细胞生长抑制率。取决于具体的需要，所用的细胞系的类型在不同的实验室亦不同。美国的国立癌症研究院推荐使用KB细胞(一种人鼻咽癌)来评价体外抗癌药。通过评价药物处理和未处理的对照中蛋白质含量(Lowry法)来测定细胞生长抑制程度。NCI也推荐使用小鼠白血病P388的悬浮培养物来评价植物提取物和相关天然产物的抗癌潜能。
我们日常使用生长于微滴度板的小鼠白血病L1210细胞来体外测试抗癌活性。白血病L1210的数量倍增时间是10-11小时，采用药剂暴露时间为48h(对数生长的3-4代)，来评价共抗肿瘤活性。本文报道的生长抑制研究，所有的贮存液和稀释液都用无菌0.9％ NaCl溶液配制。在微滴度板中，就每一抑制浓度，细胞培养物都以2-5×104细胞/ml，一式两份接种(0.18ml/孔)。每一情况下，抑制剂以0.02ml体积加入以达到1∶10稀释。复盖的微滴度板在含5％ CO2的空气的湿润CO2孵箱中温孵48h。在温孵结束时，每一孔的等份试样被加至测量体积的等张盐水中，用电子细胞计数仪计数。因为高浓度槲寄生引起快速细胞片段化，在细胞计数之前，日常镜检微滴度板，这样使结束不受损害。通过苔盼蓝排除来测定细胞存活率。结果由以细胞生长抑制百分比(与盐水处理的对照的细胞浓度相比)对药物浓度对数作图而计算，并表达为由图所测定的引起细胞生长50％抑制的浓度。
亦可评价药物对于肿瘤细胞系的细胞毒效应，但这些实验需要更长的时间也更昂贵。在这些研究工作中，药物处理的细胞被洗涤至不含药物，然后种到软琼脂或其他合适的培养基中，通过存活细胞增殖形成显微镜下可见的集落的能力来评价细胞存活率。一定药物浓度下获得的细胞集落数与由未处理的对照获得的细胞集落数相比，评价细胞杀伤或细胞毒活性，我们关于槲寄生提取物的研究中，我们采用了EMT-6细胞(一种小鼠乳腺腺癌)的悬浮培养。这些细胞生长于生长在含有10％透析胎牛血清和抗生素的Eagle′s MEM(F14)培养基中。将细胞悬浮旋转沉降(spin)，将沉淀重悬于补加了10％透析胎牛血清的Spinner在培养基中(70细胞/ml)，种到塑料培养皿中，温孵2小时，使细胞贴壁。这时将细胞暴露于各种浓度的提取物2-24小时。然后去除细胞培养物并核上不含药物的培养基，将培养皿温孵5-7天。用亚甲基蓝染迈集落(0.33％于0.01％KOH中)，用自动集落计数器计数。EMT-6细胞的种值率(plating efficiency)是46％(Khwaja等1986，癌症，43(增刊)174250)。
5.4.4. 抗病毒活性不同药物的抗病毒活性可在人细胞系如Hela或H9淋巴瘤细胞中评判。用病毒感染细胞并且让这些病毒在细胞培养物中增殖。病毒引起细胞裂解的能力或细胞病理效应被视为终级目的。因而H9细胞的HIV感染造成了多核细胞的产生。如果一定浓度的药物降低或撤消了细胞病理效应，那么表明了它作为抗-HIV药剂的潜能。这些结果可以通过评估细胞培养物中的病毒酶。如，通过研究病毒反转录酶的表达量来证实。病毒酶的表达的降低将支持该药治疗的抗病毒效应。(Khwaja.T.A.美国专利号5,565,200；J Levy等1984，科学225840)。
5.5 用于分析化学成分的分析方法有许多分离和分析单个化学成分的方法，包括气相色谱(GC)，质谱分析(MS)，GC-MS，高压液相色谱(HPLC)，HPLC-MS，薄层色谱(TLC)，凝胶色谱和反相色谱(RPC)。这些色谱方法可以分析规模亦可以制备规模进行。为确定未知成分的实际化学结构，核磁共振(NMR)和质谱片段化分析是通常采用的。
取决于最可能造成生物活性的化学成分而确定色谱的类型。例如，如果生活活性是脂肪酸造成的，酯化脂肪酸然后在GC上分析酯。对于具有醇基的有机化合物，将其改性以制备醚，甲硅烷基衍生物或其他极性较小的功能基团。这样，这些衍生物适于用GC分析(Steinke等，1993，植物药Planta Med.59.155-160；Breu等.，1992，Arzneim-因/Drug Res42(1)547-551)。如果活性最可能归因于类黄酮。那么HPLC是所选的方法。反相HPLC被用于分析来自很多植物的类黄酮，特别是山楂，西蕃莲，春黄菊、银杏(Pietha等。1989，Chromatographia27(9/10)509-512)。就大蒜而言，植物成分通过TLC(Vanhaelen和Vahaelen-Fastre，1983，J.Chromatography281263-271)和MS-分析而被室量测定。关于“脂质分析”CRC色谱手册，K.D.Mukherjee，“甾体分析和表征”H.Lamparczyh，J.Sherma.和“肽及蛋白质的高效液相色谱”，C.T.Maat示，R.S.Hodges是可买到的而且描述了柱和溶剂系统。
5.6 级分分析在一个另选的实施方案中，人们不是基于已知生物活性的独立化学成分的指数，而是基于限定的级分或一类化合物建立指纹图谱。植物性药材中的一些化学成分形成了如此复杂的密切相关组分的混合物，以至于从实际的观点看来，需要基于级分或一类成分而不是单个成分的指纹图谱。这一类成分的例子是外源凝集素(糖结合蛋白)或糖蛋白。有许多级分分析的例子(凝胶色谱原则和方法Pharmacia Biotech，Rahms；LundSwedea；Utsumi等.，1987，生化杂志101.1199-1208。
5.7 一种药物指纹图谱识别的植物药的说明性例证以下例子给出了槲寄生的药物等级提取物的一般制备，其可以有效治疗AIDS和一些癌症。最初将提取物分离成不同类别的化学实体(成分)。发现主要生物学活性与其蛋白质级分相关(＞95％)。其残余活性在生物碱级分中分离到。定量指纹图谱以测量对多种糖具有不同结合亲和力的特定蛋白质级分为基础。标准药物等级定量指纹图谱要求级分含有0.01至1.0mg/ml Ca++依赖糖结合蛋白，该蛋白能结合乳糖，半乳糖，蜜二糖，N-乙酰-半乳糖胺或岩藻糖，且展示出低于大约0.50pg/ml的抑制浓度。此节所用“抑制浓度”是糖结合蛋白抑制一些癌性细胞系体外生长的能力的衡量标准。抑制浓度以引起具体癌性细胞系生长50％抑制所需的每毫升提取物溶液的糖结合蛋白的μg数表达。用于测量抑制浓度的优选的细胞系是称为L1210的白血病细胞系。具体的癌性细胞系可从多个商家购得。过去L1210被用作测试药物效力的筛选系统。许多学术论文中描述了L1210的培养和生长的细节(肿瘤学(oncology)434250和Experientia1980，36599-6007)。可以用于测定抑制浓度的其他细胞系包括KB细胞和其它证明能够产生可重复结果的快速生长细胞系。亦可采用其他的参数，如在给定细胞培养系中大分子合成的抑制程度。
将槲寄生提取物鉴定为药物等级优选地要求提取物的标准指纹图谱必须亦含有一个或多个非Ca2+依赖的糖结合蛋白质级分，这些级分能够结合乳糖，半乳糖，蜜二糖，N-乙酰-D-半乳糖胺，或岩藻糖。这些非Ca2+依赖的糖结合蛋白质的定量性水平应是每级分为0.1至2.0mg/ml。一种或多种非Ca2+依赖糖结合蛋白级分的抑制活性优选地低于0.5μg/ml。
5.7.1. 植物来源/提取方法按照任一已知的磨粉工艺制备槲寄生的粉末(加工的生物学材料)。可使用任何类型的槲寄生，但是为了将提取物的弃置率保持在低水平，优选地，槲寄生提取物从发现于南朝鲜的槲树上的Viscum alkum的Coloraiun种制备，或从发现于整个欧洲的Viscum albun.L种制备。而且，优选地，槲寄生在收获后马上快速冷冻然后在冷冻状态下研成粉末。优选地用液氮或类似的制冷液体快速冷冻。可用整株槲寄生植物制备粉末。优选的收获时间是浆果成熟时。由于槲寄生的所有复杂成分的性质的可变性和相对未知，优选地，应遵循以上列出的优选的步骤以最优化符合本发明的方法的提取制备物的数目。可以压榨槲寄生植物的新鲜柔软的部分(包括叶，茎和/或浆果以挤出细胞汁液，当用水或无菌生理盐水稀释时，将产生水提取物。
用基本纯的水溶液提取槲寄生粉末。提取液可以包含添加的成分以增进提取过程。提取物可以包括足以增进从槲寄生汁液中提取蛋白质的量的盐，如氯化钙或氯化钠。在约0.02M的盐浓度是优选的。亦可加入去垢剂，如TRITON_X-100以增进植物细胞壁中提取蛋白质。提取剂优选用0.02M Tris缓冲至大约7.8。提取工艺应当使用相于所提的槲寄生的量产生如下所述的蛋白质水平的量的提取剂。优选地，大约100至400克的槲寄生粉末将用大约1000至4000ml水溶液提取。粉末在溶液中混合，静置1至4小时。提取阶段后，通过过滤，离心或其他传统分离技术分离残留的粉末颗粒以制备槲寄生水提取物。
5.7.2. 级分分析在药理学分析其内容物之前，优选地，分析槲寄生提取物的总体生物学活性。该提取物的生物学评价基于它对于培养的小鼠白血病L1210生长的抑制。从最初的实验中，测定该提取物的IC50(引起与未处理的对照组相比，L1210细胞生长50％抑制的提取物的μg/ml浓度)。提取物的生物学活性以术语“活性单位‘(A.U.)表达。其表示提取物浓度(以μg提取物/ml表达)与其IC50值(μg/ml)的比。为通过这一最初步骤的提取物评价。1ml 1％提取物(10mg总提物)必须含有100或更多活性单位。低于100A.U.值的提取物被弃置，而那些具有通过级的提取物将被进一步分析，以如下所述确定其生活活性成分的特异值和比率。
优选地，通过如图10所图解的亲和柱色谱来将槲寄生提取物分离成其多个蛋白质级分。优选地，分离经两步完成，以将需要Ca2+来结合糖的蛋白质和非Ca2+依赖的蛋白质分离。用含有乙二胺四乙酸(EDTA)或其他螯合剂的缓冲液，从用感兴趣的特异的糖处理过的亲合柱上洗脱Ca2+依赖糖结合蛋白，所述糖如乳糖，半乳糖，蜜二糖，N-乙酰-N-半乳糖胺和岩藻糖。然后分析形成的级分来定量蛋白质含量。亦可使用基于类似色谱原理的其它亲和柱，例如甘露糖，鼠素糖，麦芽糖，asialofeutin，葡糖胺和n-乙酰-葡糖胺。提取物中的特异于这些糖的外源凝集素的合适的水平和活性通过测量提取物中的，符合上面提出的糖特异性外源凝集素的标准的水平而确定。
用含有EDTA或EGTA(乙二醇四乙酸)的缓冲液洗脱每一糖特异性亲合柱之后，将柱子用各自含有对应于各自亲合柱结合糖的糖的缓冲液洗脱。Sepharose_4B是优选的柱材料。由第二轮洗脱造成的多种级分含有非Ca2+依赖性糖结合蛋白质。定量测定这些级分之每一的蛋白质含量。用任意的传统定量分析方法进行蛋白质定量分析，包括基于水合茚三酮的测试，分光镜测试，和BioRad或Pierce分析。优选地，使用上述的多种缓冲剂，以测定每一类型蛋白质的总的含量。优选亲合柱色谱，因为它是一为本领域技术人员熟知的，而且适于基于其糖结合特异性从提取物中分离蛋白质的传统分离技术。只要能够精确测定每一所选的糖结合蛋白，可以采用其它分离工艺。
一种可选的，用于分析提取物中外源凝集素(糖结合蛋白)含量，生物碱级分和粘毒素水平的方法涉及使用硫酸铵。在该方法中，用70％硫酸铵沉淀槲寄生制备物的总蛋白。离心该制备物沉淀含有粘毒素和糖结合蛋白(外源凝集素)的混合物，并在酸水解的Sepharose 4B柱上分离。结合的凝集素可以用含有上述特异的糖的缓冲液从柱上洗脱。用于鉴定特异糖结合蛋白的亲合色谱亦可如上述步骤进行。初始时即从柱上流出的未结合的蛋白质含有粘毒素，其可用传统蛋白质定量分析来定量。
冷冻干燥含有生物碱级分的硫酸铵上清液，用氯仿提取生物碱。氯仿残余物含有总生物碱，它可以通过称量或其他传统方法来定量测定。
用于绘制指纹图谱的伍种Ca2+依赖和非Ca2+依赖的糖结合蛋白级分是那些与乳糖，半乳糖，蜜二糖，N-乙酰-D-半乳糖胺，或岩藻糖结合的蛋白质。每一糖结合蛋白(Ca+1依赖的和非Ca+1依赖的)的浓度在提取物总蛋白质含量的0.1至2.8百分比。表1给出了每一提取物为符合本发明的要求所必备的特异相对重量百分比范围。表2和表3分别给出了由欧洲和朝鲜槲寄生制备的药物等级提取物的重量百分比范围。
不管提取条件如何，相对于提取物总蛋白含量的每一糖结合蛋白的相对百比含量保持着相当的稳定。然而，取决于多种因素包括槲寄生的相对含量，和水性提取剂，提取时间的长短和温度，多种糖结合蛋白的实际含量在每一提取物中的改变。优选地分析提取物以确定多种具体糖结合蛋白的浓度水平，而且这些浓度水平应当用作确定一种提取物是否符合本发明药物等级要求的首选方法。然而提取物可以经稀释或浓缩达到落在优选的浓度范围之外的蛋白质浓度水平，条件是糖结合蛋白的相对百分含量就一般槲寄生提取物而言保持在表1给出的限度内，就欧洲和朝鲜槲寄生提取物而言保持在表2和3给出的限度内。提取物一经被鉴定为药物等级，可被脱水作为粉末贮存，以再水化在稍后用于治疗AIDS和癌症。
表1药物等级槲寄生提取物的通用定量指纹图谱总蛋白在提取物中重量百分含量Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-2.32. 半乳糖0.1-0.93. 蜜二糖0.1-0.64. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.1-1.65. 岩藻糖0.1-1.3非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-2.42. 半乳糖0.1-1.93. 蜜二糖0.1-2.24. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.1-2.85. 岩藻糖0.1-2.0
表2药物等级欧洲槲寄生提取物的定量指纹图谱总蛋白在提取物中重量成分含量Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 1.2-2.32. 半乳糖 0.1-0.93. 蜜二糖 0.1-0.64. N-乙酰-D-半乳糖胺0.5-1.65. 岩藻糖 0.3-1.3非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 1.4-2.42. 半乳糖 0.9-1.93. 蜜二糖 1.2-2.24. N-乙酰-D-半乳糖胺0.8-2.85. 岩藻糖 1.0-2.0表3药物等级朝鲜槲寄生提取物的定量指纹图谱总蛋白在提取物中重量成分含量Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.52. 半乳糖 0.1-0.53. 蜜二糖 0.1-0.54. N-乙酰-D-半乳糖胺0.1-0.55. 岩藻糖 0.1-0.5非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.52. 半乳糖 0.1-0.83. 蜜二糖 0.1-0.54. N-乙酰-D-半乳糖胺0.1-0.75. 岩藻糖 0.1-0.5
优选的提取物中Ca2+依赖糖结合蛋白的浓度水平在大约0.01至1.0mg/ml范围内。本发明的方法可以通过仅测定一种Ca2+依赖糖结合蛋白以确定该提取物是否在药物等级限定之内而完成。然而优选地测定两种或多种糖结合蛋白水平。如半乳糖，乳糖和/或N-乙酰-D-半乳糖胺特异性蛋白质。更优选地，分析提取物以测定是否所有5种Ca2+依赖糖结合蛋白的浓度水平都符合上述定量指纹图谱限度。该方法也可以通过测量3或4种特定的Ca2+依赖糖结合蛋白的多种组合而完成。在表4、5和6中给出浓度范围和抑制活性范围。
表4药物等级槲寄生提取物的定量和生物活性指纹图谱浓度(mg/ml) 抑制浓度(IC50)Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.5 0.01-0.52. 半乳糖 0.01-0.50.001-0.53. 蜜二糖 0.01-0.60.001-0.64. N-乙酰-D-半乳糖胺0.1-1.6 0.01-1.65. 岩藻糖 0.1-1.3 0.01-1.3非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.5 0.0001-0.52. 半乳糖 0.1-2.00.001-0.53. 蜜二糖 0.1-0.50.001-0.64. N-乙酰-D-半乳糖胺0.1-1.00.001-1.65. 岩藻糖 0.1-1.5 0.01-1.3
表5药物等级欧洲槲寄生提取物的定量和生物活性指纹图谱浓度(mg/ml) 抑制浓度(IC50)Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.3 0.01-0.12. 半乳糖 0.01-0.10.0001-0.013. 蜜二糖 0.01-0.1 0.001-0.014. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.1-0.3 0.01-0.15. 岩藻糖0.5-1.0 0.01-0.1非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.3 0.001-0.12. 半乳糖0.1-0.3 0.01-0.13. 蜜二糖0.1-0.30.1-0.54. N-乙酰-D-半乳糖胺0.05-0.3 0.001-0.015. 岩藻糖 0.05-0.30.1-0.5表6药物等级朝鲜槲寄生提取物的定量和生物活性指纹图谱浓度(mg/ml) 抑制浓度(IC50)Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.50.1-0.52. 半乳糖0.2-0.60.1-0.53. 蜜二糖0.1-0.50.1-0.54. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.5-1.00.1-0.55. 岩藻糖0.1-0.50.1-0.5非Ca2+依赖糖结合蛋白1. 乳糖 0.1-0.5 0.0001-0.0092. 半乳糖1.0-2.0 0.001-0.013. 蜜二糖0.1-0.5 0.001-0.014. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.5-1.0 0.001-0.15. 岩藻糖1.0-2.0 0.001-0.1
提取物中的非Ca2+依赖糖结合蛋白的浓度水平必须在大约0.10至2.0mg/ml范围内。本发明的方法可以通过仅测定一种非Ca2+依赖糖结合蛋白从确定该提取物是否在药物等级限度之内而完成。然而，如上所述，优选地测量两种或多种非Ca2+依赖糖结合蛋白水平，更为优选地，分析提取物以确定是否所有的伍种非Ca2+依赖糖结合蛋白的浓度水平都符合要求的浓度限度，最优选的方法涉及确定完整的蛋白质指纹图谱。即，所有10种糖结合蛋白质级分中的蛋白质浓度。在最优选的实施方案中，除非所有10种蛋白质级分具有要求的，如上述的浓度水平，不能将提取物鉴定为或认为是药物等级提取物，标准指纹图谱参数在表4、5和6中给出。
多种蛋白质级分的生物活性与其各自浓度水平结合使用以认定该提取物是根据本发明的药物等级。构成了Ca2+依赖糖结合蛋白群体之每一的多种蛋白质必须每一都显示了大约0.001至0.5μg/ml的抑制浓度。构成了非Ca2+依赖糖结合蛋白质群体之每一的多种蛋白质必须每一都显示了大约0.0001至0.5μg/ml的抑制浓度。
测定抑制作用的方法在多种科学文献包括上面提及的参考文献中给出。优选地抑制作用的测定是在体外用白血病L1210细胞进行。这种方法是优选的因为L1210细胞容易得到，在公知的培养方法中易于保持而且提供了可重复的结果。通过加入增加量的级分和当与对照培养物相比，细胞生长被抑制50％时进行测定，而测定每一糖结合蛋白级分的抑制浓度。优先地，测量每一糖结合糖蛋白的浓度水平和抑制浓度，且它们都处在表4、5和6给出的范围之内，这样，提取物将被鉴定为根据本发明的药物等级。
一旦确定了指定的糖结合蛋白质的浓度水平和/或抑制浓度，假如满足了上述限度，提取物被鉴定为药物等级。如果未满足一种或多种要求，即样品指纹图谱与标准指纹图谱不匹配，提取物将被弃置。被鉴定为药物等级的提取物被用于用于治疗AIDS和癌症疾病的治疗程序。药物等级提取物不仅可用于治疗AIDS，还可以用于治疗具有抑制的免疫系统的任何个体。如果提取物的蛋白质浓度高于上面给出的限度，应该按规定稀释提取物以使提取物蛋白质浓度低到确定的限度。如果提取物蛋白质浓度低于该限度，提取物将被弃置，不被认为是药物等级。
优选地，在开始严格地分析糖结合蛋白指纹图谱分析之前，首先就其整体活性进行筛选。发现那些不满足某些总活性水平的提取物也将不满足本发明的更具体的蛋白质指纹图谱要求。以与单个蛋白质级分同样的方式测定活性单位。唯一的不同是测试整个提取物。根据本发明，提取物应当具有大于100AU的活性。表7给出了最初筛选的结果。其中，筛选了多个不同的槲寄生提取物如上所述使用L1210细胞以确定其生物活性。可以看出，商售的制品如ISCADOR不符合起始筛选试验，因而不是根据本发明的药物等级。ISCADOR提取物也不符合本方法的更严格的特异的蛋白质指纹图谱要求。然而，不符合本发明的特异蛋白质浓度指纹图谱的提取物n-T4GEN和T4GEN都具有远远高于100AU最小值的生物活性。筛选步骤是优选的，因为它使非药用纹提取物较快地鉴定出来，不必进行更耗时的蛋白质指纹图谱识别。一旦一种提取物通过了起始筛选步骤，它还必须进一步符合蛋白质指纹图谱要求，以合乎本发明的药物等级标准。
表7以活性单位形式表示的槲寄生提取物生物活性样品名称 活性单位/ml(1％提取物)1. ISCADOR M，Arg.， 10％ 802. n-T4GEN， 40％ 4003. T4GEN， 5％2274. ISCADOR M， 5％ 305. ISCADOR M， 20％ 376. T4GEN， 1％1407. T4GEN， 10％ 2178. ISCADOR M， 20％ 269. n-T4GEN, 40％ 41610. n-T4GEN 19211. n-T4GEN 811每毫升活性单位＝μg/ml样品浓度IC50(μg/ml)还优选分析含有不与糖结合的蛋白质的提取物级分以提供用于鉴定提取物是否是药物等级的更详尽的指纹图谱。如图9所示，一含有非结合蛋白质的级分在糖结合蛋白从提取物中分离之后仍保留下来。这一未结合蛋白质级分含有“生物碱”级分和粘毒素级分。这两种级分可以使用Sephadex G-75构成等价物经柱色谱彼此分离，生物碱级分中的生物碱含量应为每毫升百分之一提取物中10至50μg。蛋白质级分中粘毒素含量应为每毫百分之一提取物中约10至40μg。如上所述，百分之一提取物是1克总起始非脱水植物材料用100ml水性提取剂提取。当每100ml所提取的植物材料的量增加时，粘毒素和生物碱的量将成比例增加。
在使用时，提取物可以原样使用，亦可以用合适的药用载体稀释后使用，并按已知的用于治疗AIDS和具体癌症的已知方法施用。治疗AIDS时，提取物优选地皮下注射，剂量范围是0.01至1ml 1％提取物。亦可使用更加浓缩的提取物，如2和5％的提取物。亦可取决于剂量要求使用浓度更高的提取物。优选地每周注射两次，亦可注射得更频繁。对于癌性肿瘤，提取物可直接注射到肿瘤上亦可皮下注射。
5.7.3 生物活性分析测试在此称为n-T4GEN的提取物以证明其抗HIV活性。分析n-T4GEN且发现其符合表6给出的糖结合蛋白指纹图谱，在生物碱和粘毒素级分中的蛋白质的量亦被发现处于要求的指纹图谱范围内。n-T4GEN提取物系由朝鲜槲寄生制备。n-T4GEN提取物以足以提供每ml测试溶液1.A.U.的1％提取物浓度的量加至培养孔中(即等价于10μg提取物/毫升测试溶液)。n-T4GEN抑制H9淋巴样人白血病细胞中HIV-诱导细胞病理效率的浓度伴随着感染细胞中病毒反转录酶水平的降低。
人免疫缺陷病毒(HIV)感染T4淋巴细胞。在H9人淋巴病细胞系中，病毒产生了巨大多核合胞细胞。病毒感染3-6天后，定量测量在待测药物存在或不存在情况下，相关于病毒生长程度的合胞体的数量。这些细胞病理效应和病毒反转录酶分析被用于证明n-T4GEN的抗-HIV效应。
使用1μg/ml 1％n-T4GEN提取物/ml测试溶液的抗HIV测试如下进行使用纯化的鸟类成髓细胞增多症病毒RT将HIV接种量就反转录酶(RT)活性标准化，并以0.02RT单位HIV/2×106细胞的接种量感染Polybrene处理的H9细胞。病毒于37℃吸附2小时，然后将细胞洗两次，并以2×105细胞/ml浓度重悬于补充了10％胎牛血清的RPMI1640中，并以1ml的小份分装到24孔板中(Falcon Division，BectonDickinson Co，Cockneyville，MD)。感染的5-6天可见合胞巨大细胞形成，该细胞病理效应(CPE)通过将0.1ml等份试样分装在0.1ml无水甲醇，并于显微镜检计数巨大细胞而定量测定。将用1.A.U.(10μg)的1％n-T4GEN提取物/1ml测试溶液抗病理处理的CPE抑制与未处理的，感染的H9细胞相比较。
使用1ml培养物等份试样测量反转录酶活性，该等份试样于600xg澄清30分钟，在10％聚乙二醇-0.13M NaCl中于4℃沉淀18小时，并于600xg离心60分钟。用甘油-Tris缓冲液(50％甘油，25mMTrisHCl pH7.5，5mM二硫苏糖醇，15mM KCl，0.025％Triton-X，和0.25mM EDTA)溶解沉淀。RT测试由发表的方法改进(Levy等，1984.科学225840；Ho等，1984，科学226451)，所用的终反应混合物含40mM Tris、HCl pH7.8)2.2mM二硫苏糖醇，10mMMgCl250mM KCl，0.03％Triton-x。25μCi3H-三磷酸胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，MA)，和50pg/ml多聚rA寡聚dT12-18(BRL，Gaithers-burg，MD)，使用多聚dA寡聚dT12-18作为核板测定平底计数，并从多聚rAdT引物cpm中减去平底以测定由RT活性特异性造成的胸腺嘧啶参入。
试验结果见表8表8槲寄生提取物对于HIV感染培养的H9淋巴瘤细胞的影响n-T4GEN*(μg/ml) 细胞病理(合胞细胞)5天 反转录酶(cpm)10天0.01++ 97,896(100)0.10++ 77,974(79)1.00++ 65,932(67.3)10.00 ±32,128(32.8)100.00 (toxic) 4,200在第1天，用HIV(1000,000RT计数)感染生长于补充了10％胎牛血清的RPMI-1640培养基的H9淋巴瘤细胞，并加入多种浓度的n-T4GEN提取物。第5天观察其细胞病理效应(合胞)，第10天分析RT活性。(++)表示大量的巨大细胞，(+)少量的合胞细胞。*表达为μg 1％提取物/ml细胞培养物的量。
结果表明n-T4GEN在无毒性浓度下抑制了对于H9淋巴瘤细胞的HIV诱导的细胞病理效应。在这些浓度下(10μg/ml)，也明显抑制了病毒反转录酶(67.2％)。一种在此称为T4GEN的提取物亦与n-T4GEN一起测试，以证实其抗癌活性。分析T4GEN，并发现其符合表5给出的糖结合蛋白指纹图谱。亦发现在生物碱和粘毒素级分中的蛋白质含量亦在要求的指纹图谱范围内。T4GEN提取物系从欧洲槲寄生中提取。
在荷有皮下接种C3H乳腺癌15/C的动物中研究T4GEN和n-T4GEN的抗癌活性。肿瘤作为肺传代肿瘤在C3H雌性小鼠中保种。在该实例中肿瘤(1×105Cell)被接种(皮下)到18-20g B6C3F1杂种雌性小鼠上。第2天，荷瘤小鼠被随机分成不同治疗小组(10只小鼠/组)。在治疗期间，只接受生理盐水的对照组有15只动物。接种后48小时开始治疗(i.p.)、并特续14天(每天注射一次)。于5、9和14天给动物称重以评价毒性效应。于接种后21和28天测量肿瘤，结果以公式(1×W2)/2(1＝肿瘤长度，W＝肿瘤宽度均以mm表示)来表达为肿瘤重量。
下面给出的结果表明，以等价于1ml 1％提取物/kg(20mg/kg)、q.d(1-14)的剂量安排的T4GEN提取物引起该肿瘤生长约98％的抑制。在同一实验中，n-T4GEN(5mg 1kg.qd1-14)引起了乳腺癌16/C生长的33％的抑制，然而，30％的处理动物由到实验结束(第93天)依然没有肿瘤。该动物模型是被接受的人乳腺癌模型。在下面表9中给出了结果表9在B6C3F1雌性小鼠中，T4GEN和n-T4GEN对于皮下接种的C3H乳腺癌16/C的生长的影响。
5.8. 药物指纹图谱识别(pharmaprinted)材料的使用方法建立了植物材料的指纹图谱图谱之后，分析单个样品以确定它们是否处于接受的标准之内。一旦样品被肯定，它将适用于人或动物相关的多种疾病。这样的材料是可用于临床实验的，以便为实验提供质量稳定的材料和精确剂量的配方。作出了药物指纹图谱图谱的材料亦可用于动物体内的毒理试验，这时，材料的一致性再次有利于定量毒理学分析。在许多情况下，它可以用作分析或生物学用途的参比材料。
药物指纹图谱识别的植物材料可用于与一种植物药相关的任何疾病状态。实例参见Leung和Foster，1996和《草药和植物药物》(HerbalDrug and Phytopharmaceuticals，1994。更具体的疾病或治疗适应症的例子包括AIDS，轻度到中度的抑郁，抗关节炎，抗癌症，抗腹泻，抗炎症通过GI抗恶心，抗风湿，抗痉挛，抗溃疡，抗细菌，抗突变，抗氧化剂，抗病毒，关节炎，哮喘，血压，良性前列腺增生(BPH)，支气管哮喘，支气管炎，镇静，脑循环障碍，胆固醇低，肝硬变，皮肤病性抗炎性，糖尿病，利尿剂，烈性导泻，痛经，消化不良，环境应激反应，祛痰药，自由基(free radical)清除剂，GI压抑，痔，肝炎，肝保护剂，高脂血，高促乳素血，免疫调节活性，升高血纤维蛋白溶解，细菌感染抗性、炎症，失眠，泌乳，肝保护，长寿，月经周期调节，偏头痛，肌肉疼痛，骨关节炎，疼痛，外周血管疾病，血小板凝集，PMS，提高月经流量，前列腺失调，降低甘油三酯，解除月经疼痛，呼吸道感染(RTI)视网膜疾病，风湿病，静定剂、催眠药，咽痛，刺激毛发生长，表层创伤愈合，耳鸣。局部湿疹(皮炎)，尿道感染(UII)，静脉曲张，静脉机能不全或创伤愈合。
以下给出的实施例目的仅在于说明而原本以任何方式限制本发明的范围。
6. 实施例SAW PALMETTO，原植物Serenoa repens，Serenoa serrulata，Sabal serrulata6.1 植物来源/提取方法Saw Palmetto是原产于美国的小的棕榈。以植物制品的形式，这种小的棕色浆果多年来用于治疗结肠和前列腺疾病。Saw Palmetto的提取物可以多种方法制备。典型地为己烷提取或超临界二氧化碳提取。这些提取方法在上面描述的加工和提取植物材料的方法中描述。也有可从Madaus，SA.商购的油脂提取物lipidic extract和可皂化提取物。
6.2 生产商/产品名称有许多Sabal serrulata提取物的生产商。所用名称如下IDSA90(Weisser等，1996，前列腺(prostate)28300-306)；Strogen Forte，TalsoTM，SG290 TalsoTMuno，可从Sanofi WinthropGmbH(Munich，德国)，亦可从Madaus S.A.(科隆，德国)购得。可从Centre de Recherches P.Fabre(Castres，法国)购得PermixonTM。可购得几种Permixon提取物，包括一种亲脂提取物，LSESr提取物，和PA109提取物。另一种可商购产品是ProstasereneTM，这是一种纯化的Serenoa repens，可从Therabel PharmaTM(比利时)商购。SawPalmetto亦可由下列公司加工NaturaLife Herbal Choice，BotaliaGold，Herd Pharm，PhytoPharmica。
6.3 减轻良性前列腺增生症状的临床用途在欧洲，植物材料几乎占用于良性前列腺增生(BPH)的处方的一半(Di Silverio等，1993，Minerva Urol.Nefrol.45143-9)(DiSilverio等)。一些更常见的被用作BPH的处方的植物提取物或植物药物获自Serenoa repens(Saw Palmetto浆果)，Pygeum africanum(PlumBark)和Cucurbita pepo(Pumpkin种籽)。迄今使用最广泛的治疗BPH的植物材料是Saw Plametto浆果的脂类提取物。Saw Palmetto浆果提取物(SPB-提取物)是无毒性的，在大量的临床试验中证明有极小或无不良副作用。SPB提取物的规模最大的临床试验在法国完成。在试验中使用SPB-提取物Permixon。该提取物从1982年可商购。据法国科学家称，Permixon是十分安全的，仅有小量证据说明其有不希望的副作用。今天，Permiox和许多其他产品可在全世界20多个国家商购。
近年来公布了用SPB提取物进行的多项临床研究。1984年，Champault等人报道在110个门诊病人中进行的双盲的，安慰剂对照的研究(Champault等，1984，英国临床药理学杂志(Br.J.Clin.Phar.18461-462))。在该研究中，55个病人接受了SPB提取物的治疗(160mg，一日二次)。55个病人接受了安慰剂治疗，为期30天，研究表明在夜尿症，排尿困难强度，尿流速度，和(夜尿后)(post-nicturition)残余有统计学显著提高。该报告亦记录了5个病人轻微副作用(如，头疼)。Di Silverio等报道了用SPB提取物StrogenForte(160mg.一日二次)对34位BPH患者的为期三个月的治疗(DiSilverio等，见上)。研究结果表明，有60％患者有主观的改善，包括50％的尿体积减少，53％的前列腺体积的轻微减小，血清睾酮水平的明显升高，以及前列腺内DHT浓度的降低。作者亦综述了1983-1985年的报道SPB-提取物Strogen Forte在BPH患者中的效力和耐受性的研究工作。1993年，Romics等人，报道了42个患者的为期一年的治疗研究。(Romics等，1993；Internat Ural and Nephrol 25(6)565-569)。该项研究报道了客观症状的明显改善，例如夜间排尿(68.4％)。残余体积(74.7％)和中断尿流和排尿后流滴(80％患病)。未报道副反应。在另一研究中，Vohlensiek等报道了用Sabal serrualta的SPB提取物进行的1334例门诊患者的12周的治疗研究。(Vohlensiech等，1993，Fortsch der Med，111(18)323-326)。在这项治疗中，残余尿降低了50％，尿频平均降低了37％，夜尿降低了54％。排尿困难疼痛的患者数量从75％降至37％。而且，他们还发现多于80％的病例中药效的“从良好至极好”，多于95％的患者耐受力的“从良好至极好”。
因而，Saw Palmetto可用于治疗和/或减轻BPH和/或泌尿功能不良。
其他研究者亦报道了治疗的组合。具体地，SPB-提取物与南瓜籽提取物(53例患者)(Carbin等，1990，)英国泌尿学杂志(Br.J.Urol)66639-641)或Urica提取物(2,080例患者)(Schneider等，1996，Fortsch der Meol，113(3)37-40)使用。所有这些研究都支持了SPB提取物在治疗BPH和/或泌尿功能不良中的效力。
6.4 Saw Palmetto的级分分离可商购的凝胶胶囊Saw Palmetto内容物的级分分离使用正相闪式色谱进行。这种方法被选作优选的制备型色谱技术是基于观察到的极佳的质量收率(＞90％)，选择的标准物(脂肪酸，其酯)的级分分离，以及级分分离其它同时存在的成分。使用的材料和方法详述如下。
广泛查阅关于Saw Palmetto(Sereno repens)的文献，表明植物甾醇(β-谷甾醇)，脂肪酸(棕榈酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，肉豆蔻酸和月桂酸)及其乙酯，是在一系列测试中具有最恒定的生物活性的SawPalmetto的成分(脂肪酸/酯5α-还原酶(Weisser，1996，见上)雄激素受体(Casarosa，1988)；植物甾醇(特别是β-谷甾醇。虽然小于雌二醇活性的10％)雌激素活性(Duke，1985))。
制备型CC方法大约5g含量的Saw Palmetto商购凝胶胶囊内容物溶于25ml CH2Cl2。生成的提取物载体于预先填充了SiO2的制备型闪式玻璃色谱柱。闪式CC(柱层折)条件如下柱-60μm SiO2，每一流动相体积＝2倍柱体积；收集具有下表所示流脱图谱的10个级分。总收率为4.77克，总物料衡算为92％。
分析型毛细管GC方法GC系统是装有Star数据处理软件的VarionGC/FID。使用1μl注射体积注射到毛细管柱上(Restek RTX-2330，30m柱，0.25μm，0.20μmdf)进行分离，且其温度梯度体系如下55℃，1分钟，7.5℃/min至260℃，持续5分钟。柱流速保持在1.0ml/min，注射分流比是1∶100。注射器和检测器温度是260℃。有许多SawPalmetto分析标准品的来源，包括Aldrich Chemical Co.，Inc(Milwaukee，WI.USA)。
大约5g商购SPB-提取物(凝胶胶囊中)溶于25ml二氯甲烷。使用该溶液进行闪式色谱。色谱系统由60μm硅胶和下列洗脱溶剂组成
从每一收集的流动相级分记录的干燥残余物的量如下1(～0.1g)，2(～2.5g)，3(～1.6g)，4(～0.1g)，5(～0.1g)，6-9(～0.0g)，10(～0.5g)。通过闪式色谱回收的总的干燥残余物被计算为4.77克，假定起始上样的提取物是5.15克，92％的提取物被作为干物质回收。
6.5. 生物活性分析基于文献回顾和根据本发明的方法的教导，选择以下范畴的生物测试来评测Saw Palmetto体外治疗BPH的生物学活性；抗-雄激素，抗-炎性，环加氧酶/酯加氧酶(CO/LO)抑制，肌肉收缩。在这一范畴中，具体的研究的测试如下S-脂加氧酶测试，环加氧酶-1-测试，环加氧酶-2-测试(Panlabs，WA)，以及如下由Georgia医学院建立的雄激素受体测试。
6.5.1 大鼠前列腺雄激素受体测试二氢睾酮竞争性核受体配体结合测试6.5.1.1 材料和方法动物60天龄(300-350g体重)雄性大鼠从Harlan(St.Louis.MO)处获取，并使之在空调，12小时光照/黑暗周期的光照控制房间内适应24小时。用Purina混合料块饲喂，并通过吸管喂水，任意取食。
所有进行的动物实验都由乔治亚医学院保护和使用研究教学动物学术委员会按照国立卫生研究院和美国农业部的指南批准。类固醇和试剂。
普通化学品(试剂级)，游离脂肪酸，脂肪酸乙酯和放射惰性类固醇获自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。3H-二氢睾酮(5α-雄烷(androstan)-17β-醇-3酮；60Ci/mmol)购自NEN Life ScienceProductc(Bostoa，MA)。在制备所有的抑制剂和放射惰性化学品的整个过程中使用100％乙醇。雄激素受体结合用睾酮(400μg/100g体重)腹膜内给药动物。1小时后脱颈处死动物，并快速取出腹前列腺放在冰冷“匀浆缓冲液”(10mM Tris.HCl，1.5mM Na2EDTA，0.5mM二硫苏糖醇，0.25M蔗糖，1mM苯甲磺酰氟，pH7.4于2VC)中。将前列腺剪碎并于冰上用Polytron匀浆器匀浆(定在4位)，每次处理10秒钟交替以30秒钟的冷却时间，组织-缓冲液比例是550mg/ml。匀浆物于4℃于800g离心20分钟。核沉淀物重悬于冰冷的“核缓冲液”中(10mM Tris 0.5mM二硫苏糖醇，0.25m蔗糖，2，5mM MgCl2，22℃时pH7.4，550mg组织/ml)。重悬的沉淀用玻璃Dounce匀浆器在冰上匀浆，直到悬液变得均匀为止。
核沉淀重匀浆后获得的核悬液的等份试样分装于12×75mm的玻璃试管中。试管中有10μl3H-二氢睾酮，加入或不加入5ml不同浓度的抑制剂，终体积为1ml。使用放射惰性二氢睾酮(10-5m)代替抑制剂来测定非特异性结合。试管于15℃温孵20小时。
温孵过夜后，加入1ml冰冷核冲液，然后于4℃，800g离心10分钟。通过重悬于1ml同样的冰冷核缓冲液混合并如上述条件离心洗涤核沉淀，共3次。弃去上清液后，向每一沉淀加入1ml 100％乙醇，然后涡流振荡。试管置于30℃水浴中40分钟，每10分钟涡流振荡，最后于800g离心10分钟。将乙醇提取物倾析到盛有4ml闪烁液(Ecoscint A)的小瓶内，振荡并计数。
化合物，提取物和级分以1×10-5的起始浓度，有时以2×10-5的起始浓度进行筛选。如果在2×10-5或更低时观察到大于50％抑制的活性，应作出完整的剂量响应曲线。在一分析结果在Saw Palmetto的总结表中给出。图4，5和6分别给出了全酸酯，亚油酸酯和3#提取物的K50移位。
两个浓度的推定活性成份的结果，以大鼠前列腺雄激素受体测试的3H-二氢睾酮结合的抑制百分数表达，在下列总结表中给出。
6.5.2. 5-脂加氧酶的测试5-脂加氧酶催化花生四烯酸至5-羟基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosatetraenoic acid)的氧化代谢，这是导致白三烯形成的生物合成途结中的起始反应。过程如下。使用大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-1)制备的粗酶制剂进行5-脂加氧酶测试。测试化合物在室温下与酶预保温5分钟，然后加入底物(花生四烯酸)启动反应。室温下温孵8分钟后，加入柠檬酸终止反应，通过5-HETE放免测试测定5-HETE含量。化合物于30μM进行筛选(Shimuzu等，1984，美国国立科学院院报81689-693)。
下列参比化合物被用于5-脂加氧酶抑制参比化合物，(IC50·Cμm)BW-755C，(6.6)；去甲二氢愈创木酸(NDGA)，(0.26)；芬尼定(30)。
化合物和级分以3×10-5的起始浓度进行筛选。如果在3×10-5观察到大于50％抑制的活性，那么应该作出完整的剂量效应曲线。分析的结果在Saw Palmetto总结表中给出。
6.5.3. 环加氧酶-1测试每测试管125单位环加氧酶(来自于公单精囊)与1mM GSH，1mM氢醌，1.25mM血红蛋白和测试化合物于25℃预温孵1分钟。加入花生四烯酸100mM起动反应，于37℃温孵20分钟后，加入三氯乙酸(TCA)终止反应。离心分离并加入硫代巴比妥盐，通过读出530nm处吸光率测定环加氧酶活性。(Evans等，1987，Biochem，Pharamac.362035-2037；Boopathy和Balasubramanian，1988，生化杂志，239371-377)。
下列参比化合物被用作环加氧酶，抑制参比化合物(IC50(μm))；阿斯正林，(240)；消炎痛，(1.7)。
化合物和级分从3×10-4起始浓度进行筛选，如果在3×10-4观察到了大于50％抑制的活性，那么应该作出完整的量效曲线。分析的结果在Saw Palmetto总结表中给出。
6.5.4 环加氧酶-2测试每测试管80单位环加氧酶(来自于公单精囊)与1mM GSH，1mM氢醌，1.25mM血红蛋白和测试化合物于25℃预温孵1分钟。加入花生四烯酸100mM起动反应，于37℃温孵20分钟后，加入三氯乙酸(TCA)终止反应。离心分离并加入硫代己比妥盐，通过读出530nm处吸光率测定环加氧酶活性。(Boopathy和Balasubramanian，1988，Euans等，1987，O′Sullivan等，1992，生化和生物物理研究进展1871123-1127。
下列参比化合物被用于环加氧酶，抑制参比化合物(IC50(μm))；阿斯正林，(240)；消炎痛，(2.4)。
环加氧酶2测试的结果在下列总结表中给出。
总结表SaW Palmetto提取物-生物活性测试结果成分/提取物级分 雄激素受体 Cox1Cox25-Lipo月桂酸阴性阴性阴性阴性亚油酸阴性阴性阴性阴性亚麻酸阴性233um 阴性12um肉豆蔻酸 阴性阴性阴性阴性油酸 阴性阴性阴性阴性棕榈酸阴性阴性阴性阴性月桂酯130nm 阴性阴性阴性亚油酯6um 阴性阴性阴性亚麻酯阴性阴性阴性阴性肉豆蔻酯 阴性阴性阴性阴性油酯 阴性阴性阴性阴性棕榈酯阴性阴性阴性阴性提取物#1 阴性阴性阴性阴性提取物#2 30nm*阴性阴性阴性提取物#3 3.5um 阴性阴性阴性提取物#4 未测阴性阴性阴性提取物#5 阴性阴性阴性阴性级分#1未测阴性阴性阴性级分#2阴性阴性阴性阴性级分#3阴性阴性阴性阴性级分#4未测阴性阴性阴性级分#5未测阴性阴性阴性级分#10 未测阴性阴性阴性级分6-9***未测未测未测未测β-谷甾醇 60％@10um 未测未测未测*见Saw Palmetto指纹图谱图谱讨论部分**干残余物0克。
6.5.5. 5-α还原酶测试6.5.5.1 从大鼠制备前列腺5-α还原酶在一典型的实验中，成年雄性Sprague-Dawley大鼠(10-20只)被脱颈处死，取前列腺并清除结缔组织。组织保存在0℃-4℃，并悬于3倍体积的缓冲液A(20mM磷酸钠pH6；0.32mM蔗糖；0.1mM二硫苏糖醇)切断，剪碎，用Polytron匀浆器匀浆。匀浆于10,000g离心60分钟，再将上清液于140,000g离心60分钟。合并两份沉淀，将其悬浮于2倍于沉淀体积的缓冲液B(2mM磷酸钠，pH6.5；2MNaCl；3mg/ml地高辛；0.1mM EDTA.，40％甘油和1mM二硫苏糖醇)，于0℃静置60分钟，悬液于150,000g离心60分钟，在加入5mMNADPH后，测量含有增溶的5-α-还原酶的上清液的蛋白质含量，并作为5-α-还原酶于-70℃贮存。
6.5.5.2 从人制备前列腺5-α-还原酶人前列腺组织从经受外科横向切除术的BPH患者身上得到。组织在冰冷的盐水中于60分钟内转移到实验室。清洗组织样品，切成1-3g的片，快速冻于液氮并贮存于-70℃。经组织学检测证实BPH。
融化前列腺组织并用小剪刀剪碎(或在液N2温度下研成粉末)，并在5倍体积缓冲液中(100mM Tris/HCl pH7.4，20％甘油，100mM柠檬酸钠，100mM KCl，1mM EDTA和15mMβ-巯基乙醇)，在4℃，用超声波发生器破碎30秒钟，匀浆。用玻璃棉过滤匀浆物以移去细胞碎片，然后于800g离心10分钟，以提取核沉淀物。上清液被分装成1ml等份试样，于120,000g离心45分钟，以提供含5-α-还原酶的微粒体沉淀，其贮存于-70℃或重悬于含有0.25mg/ml Lubrol PX或0.5mg/ml地高辛的缓冲液B中，通过一25号针头以产生一均浆物，该均浆物于120,000g离心45分钟。上清液微粒体5-α-还原酶(测定蛋白质含量)被用于测试或贮于40％甘油内，于-20℃保存而不丧失活性。
6.5.5.3 5-α还原酶活性测定通过下面的放射性标记的(3H)睾酮(T)于37℃还原成(3H)5-α-二氢睾酮(DHT)的反应来研究5-α-还原酶测试。装有1ml含100mM(柠檬酸钠，100mM KCl，20％(V/V)甘油，1mM EDTA，15mMβ-巯基乙醇，5mM葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和1μm-3(H)睾酮的Tris HCl(pH7.4)缓冲液的试管(一式两份)于37℃预温孵15分钟。在有或没有抑制剂(不同来源，不同浓度的SPB-提取物)的条件下，加入5-50ml 5-α-还原酶来启动测试。ProscarTM(finasteride)被用作阳性对照。加入1ml含有T，DHT，和3-α-雄甾烷二醇(androstanediol)各25μg的二乙醚终止反应，涡旋振荡，离心每一管，分离上层醚层。用氮气流使醚蒸发掉，残余物溶于20μl氯仿/甲醇(2∶1，V/V)中，上薄层层析板(硅胶60，E.Merek，5748-7，Darmstadt德国)。板用氯仿/乙酸乙酯(3∶1V/V)展开，于-70℃放射自显影18小时，切下放射活性带(对应于T，DHT和3-α雄甾烷二醇)，并在液闪计数器上计数放射活性。该方法用于计算Km和Vmax值，和在不同浓度的SPB-提取物的存在时，T转变成DHT的抑制百分率。
6.6 油酸，月桂酸，亚油酸，亚麻酸，棕榈酸，肉豆蔻酸的游离酸和乙酯的GC-MS，HPLC化学分析Saw Palmetto棕榈酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亚油酸甲酯，月桂酸乙酯，亚麻酸甲酯，肉豆蔻酸乙酯，己酸甲酯，棕榈酸乙酯，辛酸甲酯，癸酸甲酯，油酸乙酯，月桂酸甲酯，亚油酸乙酯，肉豆蔻酸甲酯和亚麻酸乙酯。
6.7. 指纹图谱图谱的建立定量分析5种商购Saw Palmetto提取物以测定每一提取物中出现的几种脂肪酸和脂肪酸酯的量。结果如图4所示。图中显示出出现在不同提取物中每一种成分的大幅度的变化性。
分析图4中每一脂肪酸和脂肪酸酯，即成分的4种如上所述的BPH临床症状相关的生物测试中的活性。没有成分显示出针对COX-2的活性。在其他3种生物测试中的纯化成分的活性IC50如下亚油酸(COX-1中233μM，5-LIPO中12μM)；亚油酸乙酯(雄激素受体测试中，6μM)；月桂酸乙酯(雄激素受体测试中130nM)；β-谷甾醇(雄激素受体测试中～10μM)。因为没有提取物在COX-1和5-LIPO测试中有活性，雄激素受体测试被选择用于如下所示的计算。
每一单独成分对于观测到的总的生物活性的贡献用下列因子计算(i)植物提取物总生物活性，(ii)出现在各提取物的各成分的量和(iii)各纯化成分的IC50。用商购样品#3和雄激素受体测试在下面举例说明该计算方法。样品#3的雄激素受体的总提取物IC50值是3，5μM(总生物活性)，假设成分的平均分子量是200。一个#3样品胶囊含有如下比例的月桂酸乙酯(0.036W/W％；228MWt)和亚油酸(0.115W/W％；308MWt)。月桂酸乙酯的雄激素受体活性相对于总提取物生物活性的贡献的百分比按下列公式计算提取物IC50生物活性(3.5μM＝3，500nM；平均MWt＜200)乘以出现的月桂酸乙酯的量(0.036％W/W)再除以观测到的月桂酸乙酯的IC50(130nM)乘以100，并就其分子量进行校正。(3.500nM×200MWt×0.0355×100)/(130nM×228MWt＝83.9％)。使用同一公式如下计算亚油酸乙酯的贡献百分比(3.5μM×200×0.1146×100)/6μM×308＝4.4％。因而，在该测试中，两个成分-月桂酸乙酸和亚油酸乙酯的组合占了观测到的体外生物活性的90％的份额，被定义为雄激素受体生物测试中的活性成分。1β-谷甾醇以～0.2％W/W出现于总提取物中。纯化的β-谷甾醇的活性(～10μM)。由于这些结果的初步的性质，β-谷甾醇未包括在该计算方法之内。2.基于化学和生物学测试的分析，提取物#2的功效不一致。提取物#2具有明显的雄激素受体测试活性，4倍强于测试的最好标准品(30nM/130mM，月桂酸乙酯)。然而，提取物#2含有非常少量的推定的成分。因而，提取物#2不是本分析的组成部分。
月桂酸乙酯和亚油酸乙酯的合并的生物活性被用于定义药物等级组合物的接受或弃置的生物学活性标准2。
如下所述，设立生物活性范围以确定一给定的植物性药材是否有资格作为药物等级植物性药材在一种计算方法中，要求是这样设立的，活性成分必须占基于上述的活性成分标准物的25％的份额。给出了要求的生物活性(标准物的25％)，并已知活性成分的生物活性计算法如下活性成分的重量百分比乘以要求的生物学活性的最小百分比，例如，就月桂酸来说，(0.036％W/W×25％＝0.009％W/W)。类似地，就亚油酸而言，必须占0.42％。另选的，要求是如此建立的两种酯的合用占观察到的生物活性的至少25％。
要求每一成分占生物活性50％的份额时，样品必须含有至少0.018％W/W的月桂酸酯或0.84％亚油酸酯。
要求每一成分占生物活性70％的份额时，样品必须含有至少0.025％W/W的月桂酸酯或1.176％W/W亚油酸酯。
要求每一成分占生物活性80％的份额时，样品必须含有至少0.029％W/W的月桂酸酯或1.344％亚油酸酯。
使用伍用的月桂酸乙酯和亚油酸乙酯或单独一种酯的生物活性，我们现在可以清楚地限定基于这些酯的％W/W而测试的五种商购样品之每一的药物等级组合物的接受或弃置的标准。就图4所示的五种商购样品而言，即使是使用最低严格度的要求，如25％，样品1，2，4和5由于每一样品中测定的这两种酯的含量，因为不适于作为药物等级组合物而被弃置。
7. 实施例朝鲜槲寄生7.1. 植物来源/提取方法获自朝鲜槲寄生的植物粉末(2.4kg)用300ml批量的水在掺合机中提取。提取物经奶酪包布装填的过滤床(cheese cloth-lined filterbed)过滤而除去纤维和水不溶性的残余物。终体积为0.03升，提取物的终浓度是39.8％(植物重量/体积)。
7.2. 级分分析隔绝空气的条件下，提取物于4℃静置2周(氮气吹扫)。这时，其他不溶性的残余物沉积下来。冷提取物经0.8μ滤膜过滤，在无菌环境下，用0.2μ滤膜进行最终无菌过滤。该半纯化的产品收集在500ml无菌真空容器中，被称为T4GEN。发现产品样品是无热源的。用无菌注射器以层流方式从烧瓶中移取样品，并以每ml样品含有400mg提取物为基准进行稀释(40％溶液)。
按照图9所图示的亲合层析系统分析提取物样品，该系统是用于建立标准品标记指纹图谱图谱的同一系统。用于分离蛋白质的柱是SepharoseTM4B.
柱如下制备SepharoseTM4B活化用双蒸水反复洗涤SepharoseTM4B(400ml)并在瓷漏斗上过滤。琼脂糖凝胶残余物用Na2CO3(0.5M，pH11)反复洗涤，然后悬于带搅拌料的2升量筒中的400ml Na2CO3(0.5M，pH11)中。用铝箔覆盖量筒，并向搅拌的SepharoseTM4B悬液中，于80分钟时间内滴加二乙烯基砜(48ml，避光)。反应物在室温下再搅拌30分钟。然后用约500ml Na2CO3(0.5M，pH10)用NaHCO3调节)将树脂在烧结玻璃漏斗上过滤(不要接触手或滤纸)。这时将树脂重悬于400ml Na2CO3(0.5M，pH10)，并用于制备糖-特异性亲合树脂，步骤如下半乳糖特异性SepharoseTM4B向380ml活化树脂(在5M NaCO3中)中，在搅拌避光条件下加入半乳糖(38g)。悬液搅拌过夜，然后在烧结玻璃漏斗上过滤。为失活反应的活化琼脂糖凝胶，用0.5MNaHCO3(pH8.5)洗残余物并然后悬浮于350ml NaHCO3(0.5M，pH8.5)和14ml 2-巯基乙醇中。搅拌的悬液于室温下保持4小时，然后在烧结玻璃漏斗上过滤。用0.2M PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤树脂，并最终悬于380ml 0.2M PBS，并加入少许结晶NaN3于4℃贮存。
乳糖特异性SepharoseTM4B制备方法与关于半乳糖的描述相同。在此将300毫升活化的SepharoseTM与30g乳糖反应，亲合树脂用300mlNaHCO3(0.5M，pH8.5)，12ml 2-颈基乙醇减活化，最终如上述制备方法所述悬于300ml PBS和NaN3中。
N-乙酰-D-半乳糖胺-特异性琼脂糖凝胶B如前所述用3g N-乙酰-D-半乳糖胺处理活化的Sepharose 4B(30ml)。反应用30ml NaHCO3(0.5M，pH8.5)和5ml 2-颈基乙醇终止。树脂于4℃保存在30ml PBS和少量结晶NaN3中。
岩藻糖特异性SepharoseTM4B活化的SepharoseTM4B(50ml)用5g岩藻糖处理。亲合性树脂用50ml NaHCO3和5ml 2-颈基乙醇处理以减活未反应的SepharoseTM。如上所述，树脂保存在50ml PBS和NaN3中。
蜜二糖特异性SepharoseTM4B活化的SepharoseTM4B(50ml)用5g蜜二糖处理。反应用50ml NaHCO3和5ml 2-颈基乙醇终止。树脂于4℃保存在50ml PBS和少量结晶NaN3中。
同一方法可用于提供不同的糖亲合特异性的柱。用过的柱用5M尿素洗脱，然后再用0.5M NaHCO3(pH8.5)洗脱而再生。使用前，柱子用0.02MTris/HCl缓冲液(缓冲液C)平衡。
用于提取和亲合色谱的缓冲液如下制备所有缓冲液以双蒸水(DD)配制。
A)含有NaCl(0.2M)，二硫苏糖醇(1mM)的Tris/HCl(0.02M，pH7.8)，在使用前加入苯甲磺酰氟(0.01mM)(缓冲液A)。
B)含有0.4M KCl，2％Triton X-100，1mM二硫苏糖醇和0.01mM苯甲磺酰氟(用前加入)的Tris/HCl(0.02M，pH7.8)(缓冲液B)。
C)含有1.25M NaCl，25mM CaCl2，0.05％Triton X-100和1mM二硫苏糖醇的Tris/HCl(缓冲液C)。
D)用4mM EDTA替代25mM CaCl2的缓冲液(C)(缓冲液D)。
如果需要，可用EGTA替代EDTA。
用2M Tris缓冲液将已知体积的槲寄生提取物调至pH7.8。将溶液吸附到一系列SepharoseTM4B亲合柱(1.6×7ml)上。用过量(200ml)的含有25mM CaCl2的0.02M Tris缓冲液(pH7.8)洗柱，以除以未结合的蛋白质(粘毒素和生物碱)。然后用含有4mM EDTA的Tris缓冲液(pH7.8)(缓冲液D)分别洗每一根柱，以洗脱其与特异性糖的结合需要Ca2+的蛋白质，即Ca2+依赖性糖结合蛋白(100ml样品)。然后，用Tris缓冲液(缓冲液C，200ml)洗柱，然后用含有0.5M相应糖的同样缓冲液(100ml)洗脱，以洗脱非Ca2+依赖性糖结合蛋白。未结合的蛋白质在SepharoseTMG-75柱(2.5×75cm)上级分分离，以从生物碱中分离粘毒素。透析所有级分以除去盐和其他缓冲液成分。使用DIAFLOTM超滤膜YM10(10,000阻断)用AmicaTM浓缩仪浓缩所有的透析级分。以牛球蛋白为标准品，通过Bio-Rad测试测量蛋白质浓度(每一分离的蛋白可以通过SDS PAGE凝胶色谱来表征其纯度和分子量)。
7.3 生物活性分析每一糖结合蛋白的抑制浓度(IC50)如下测定白血病L1210细胞在补充了10％(V/V)胎牛血清和1％(V/V)青链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃保持不同步的对数期生长。细胞数量倍增时间为11-12小时，细胞每48小时以1×104细胞/ml浓度传代，以保持细胞处于生长对数期中。
对于所有生长抑制研究来说，所有贮存液和稀释液用无菌0.7％NaCl溶液配制。细胞培养物以2-5×104细胞/ml，就每一抑制浓度一式二份接种于微滴度板(0.18ml/孔)。盖盖的微滴度板在空气中含有5％CO2的湿润CO2孵箱内温孵48小时。温孵结束后，每孔每份试样被加至测量体积的等张盐水内并在电子计数仪下计数，因为高浓度级分引起快速细胞破裂，在细胞计数之前，日常在光镜下镜检测试的微滴度板，这样不损害结果。通过台盼蓝排除测定细胞存活率。用细胞生长抑制百分数(与用盐水处理的对照细胞密度相比)。对从图中测定的引起细胞生长50％抑制的蛋白质(或特异级分)浓度(IC50)对致作图，从而计算结果。
分析的结果见表10和11所示，它们关于n-T4GEN盐和在本实施例中制备的去垢剂提取物的，从表10和11中可看出，来自朝鲜槲寄生的汁液和细胞壁的提取物具有的蛋白质水平和抑制活性都落入按照本发明被鉴定为药物等级提取物所要求的限度内。因此，这些提取物可用于针对癌症或AIDS的治疗的临床研究中，它们可以用于常规的患者治疗，因为它们和质量的效力按照本发明所要求的蛋白质指纹图谱图谱鉴定标准建立，
表10具有抗白血病-L1210活性-n-T4GEN的欧寄生(V.ALBUMColoratum)的各种成分的级分分离(40％提取物)。
(亲合法，盐提取物级分分离)级分名称 蛋白含量 总体积 总蛋白 ICa50(μg 总活性(mg/ml)(ml)(mg)蛋白质)单位盐提取物 7.63 3502673 0.11 2.4×107用EDTA缓冲液洗脱亲和柱Ca2+依赖1. 乳糖 0.31 20 6.24 0.38 1.6×1042. 半乳糖 0.39 20 7.91 0.25 3.1×1043. 蜜二糖 0.28 20 5.44 0.20 2.7×1044. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.70 12.5875 0.29 3.00×1045. 岩藻糖 0.28 18 5.04 0.36 1.4×104用相应糖洗脱亲合性非Ca2+依赖1. 乳糖 0.27 22 5.98 0.000272.2×1072. 半乳糖 1.40 9 12.600.00139.6×1063. 蜜二糖 0.32 10 3.200.00349.4×1054. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.66 1811.90 0.0177.0×1055. 岩藻糖 1.17 15 2.59 0.0191.3×105Sephadex-G75(未结合蛋白质)级分cI(12-50) 1.84 46 84.6 0.5 1.69×105II(51-70) 1.22 22.527.45 4.0 6.8×103III(71-100) 1.12 40 44.80 2.8 1.6×104IV(101-140)d-0- 50 -0- 13.5 1.6×104a. 抑制浓度被表达为引起培养的L1210细胞生长的50％抑制的μg蛋白质/ml。b. 活性单位被定义为当具体的级分被加入到L1210细胞时，引起50％细胞生长抑制所需要的稀释的系数。c. 总洗脱液为325ml时，取50ml上柱。d. 获自级分IV的31mg生物碱。
表11具抗白血病-L1210活性的不同成分的V.AIBUMColaratum的级分分离(40％提取物)(亲合法，去垢剂提取物级分)级分名 蛋白含量 总体积 总蛋白 ICa50(μg总活性(mg/ml)(ml)(mg)蛋白质) 单位去垢剂提取物 1.68 450 7560.27 2.8×106用EDTA缓冲液洗脱亲合性1. 乳糖 0.18 22 4.04 0.250 1.6×1042. 半乳糖 0.08 11.5 0.97 0.031 3.1×1043. 蜜二糖 0.16 20 3.12 0.054 5.7×1044. N-乙酰-D-半乳糖胺0.17 19 3.20 0.076 4.2×1045. 岩藻糖 0.12 6.5 0.78 0.100 0.5×104用相应糖洗脱亲合性1. 乳糖 0.35 95 3.23 0.0045 2.1×1062. 半乳糖 0.50 15 7.50 0.0055 1.3×1063. 蜜二糖 0.15 12 0.61 0.0084 0.07×1064. N-乙酰-D-半乳糖胺0.62 4 7.68 0.0035 2.1×1065. 岩藻糖 0.50 10 5.10 0.0500 0.1×106Sephadex-G75(未结合蛋白质)级分cI(9-35) 1.58 33 52.11.25 0.05×106II(36-55) 1.36 20 27.21.70 0.008×106III(56-120d)-0- 50 -0-14.00 0.002×106a. 抑制浓度被表达为引起培养的L1210细胞生长的50％抑制的μg蛋白质ml。b. 活性单位被定义为当具体的级分被加入到L1210细胞时，引起50％细胞生长抑制所需要的稀释的系数。c. 从420ml总洗脱液中取50ml上柱。d. 从级分III中获得22mg生物碱。
在L1210系统中具有生物活性的，获自SephadexTMG75柱(见表10)的含有蛋白质的级分(12-100)含有粘毒素混合物(1.019g)。合并级分(101-140)并用3×120ml氯仿提抽，过无水Na2SO4滤膜干燥氯仿层，在真空下蒸发滤出液，以获得201mg生物碱(表10中给出的粘毒素和生物碱重量被调整到对于获自亲合柱的未结合级分而言总计325ml)。因而1ml 1％提取物含有4.9pg外源凝集素；含有10至40pg粘毒素的72pg未结合蛋白质，14.3μg生物碱。
7.4 制备药物等级水提取物取已知重量的植物(100g)清洗，并在双蒸水存在的条件下进行压榨，以形成40％重量比的槲寄生溶液从而从朝鲜槲寄生制备提取物。优选地，植物被切碎，在压榨前，碎片放入塑料袋中并于液氮中快速冷冻，和蒸馏水合并。压榨以及冷冻材料和蒸馏水合并优选地在搅切机中于约2分钟内完成。生成混合物于10,000rpm离心65分钟以从不溶性残余物中分离提取物。残余物用已知体积(100ml)的水提取两次以移取所有提取物并离心。合并上清液。生成的提取物隔绝空气于室温下贮存2周。如常规所知，通过分步过滤而使提取物无菌化。
无菌提取物如前述进行初步筛选，以确定其关于L1210白血病系统的生物活性是否为100A.U.或更多。如果提取物通过了这个测试，那么它将经受如上述实施例所述的更严格的测试，以测定其糖结合蛋白质指纹图谱图谱。如果蛋白质含量落入了根据本发明要求的限度内，那么提取物被鉴定为药物等级。表11给出了如上制备的提取物的测试结果。可以看出，提取物的浓度水平和生物活性值落入了标准品指纹图谱图谱限度内，这是它被鉴定为根据本发明的药物等级所要求的。
表12来自VISCUM ALBUMC提取物(40％，FrF)(n-T4GEN)的不同生物活性糖结合蛋白的级分分离。
(亲合法，去垢剂提取物的级分分离)级分名称 总体积 总蛋白 ICa50ICa50总活性蛋白(mg/ml) (ml) (μg/ml)提取物(40％，FrF) 90 234 32,500 2.92×106用相应糖洗脱亲合柱1. 乳糖 8 2.24 208,000 0.001 1.66×1062. 半乳糖 11 2.68 68,000 0.0035 0.75×1063. 蜜二糖 6.5 0.965,600 0.025 0.036×1064. N-乙酰-D-半乳糖胺 4.5 0.81 49,000 0.0035 0.22×1065. 岩藻糖 5 0.33 10,500 0.0056 0.052×106Sephadex-G75未结合蛋白质FractionscI(9-35) 1.5833 52.11.250.05×106II(36-55) 1.3620 27.21.700.008×106III(56-120d) -0- 50 -0- 14.00 0.002×106未结合蛋白质和生物碱 168285 1,6001.250.27×106a. 每ml引起培养的L1210细胞50％抑制所需的稀释系数。b. 活性单位被定义为就具体级分而言，当其被加L1210细胞时，将引起细胞生长50％抑制所需的稀释系数。
7.5. 制备朝鲜槲寄生的药物等级总提取物一种朝鲜槲寄生的提取物通过取100g槲寄生，冷冻，并研成粉末而制备。然后融化冷冻的粉末并用200ml冷丙酮提取。提取混合物于10,000rpm离心60分钟。将沉淀用两个100ml等份冷丙酮洗涤并于10,000rpm再次离心60分钟。形成的提取物残余物用两份200ml等份缓冲液A(见实施例8)在掺合机中提取，每次2分钟。这两份提取等份试样于10,000rpm离心60分钟，合并上清。用额外的200ml缓冲液A最后一次提取该提取残余物。离心后，该终提取物与另两份等份试样合并以形成盐提取物。该提取物在脱盐后，按照本发明进行测试以确定其糖结合蛋白指纹图谱图谱是否合乎上面提出的药物等级要求。
在上述用缓冲液A提取后，仍然保留的提取残余物可以用去垢剂提取一缓冲液B(见实施例8)提取，以形成一种提取物，该提取物在除去盐和去垢剂后，亦可被测试以确定它是否符合本发明的药物等级要求。
8. 实施例欧洲槲寄生按照实施例7制备和分析一种欧洲槲寄生(Viscum album L)的提取物，除了仅分析了水性盐提取物的糖结合蛋白指纹图谱图谱外。提取物被称为T4GEN。指纹图谱图谱测定结果在表12中给出。T4GEN提取物合乎建立的标准品指纹图谱图谱的要求，因而有资格作为药物等级提取物。
表13给出了发酵的槲寄生提取物ISCADORTM的分析结果。该级分合乎一些，但不是全部标准品指纹图谱图谱的要求。例如，蜜二糖和岩藻糖级分的生物活性太低。
表14展示了T4GEN和ISCADORTM提取物的生物活性测试的结果，其中IC50被表达为每ml引起培养的L1210细胞50％抑制所需的稀释系数。表14从表12和13衍生而来，展示了与非发酵的欧洲槲寄生提取物(T4GEN)相比，ISCADORTM活性的普遍降低。
表13来自T-4GEN的生物学活性糖结合蛋白的级分分离(亲合法，盐提取物级分分离)级分名称蛋白含量 总体积 总蛋白 ICa50(μg 总活性(mg/ml) (ml)(mg)蛋白质)单位T4GEN(10％，FrF) 0.9 100 90 0.32 4.6×105用EDTA缓冲液洗脱亲和柱(Ca2+依赖性糖结合蛋白)1. 乳糖 0.236 7 1.652 0.03370.49×1052. 半乳糖0.040 9 0.360 0.00351.00×1053. 蜜二糖0.052 4 0.208 0.00420.44×1054. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.128 8 1.024 0.080 0.12×1055. 岩藻糖0.920 8 0.734 0.050 0.14×105用含相应糖的缓冲液洗脱亲合性(非Ca2+依赖性糖结合蛋白)1. 乳糖 0.15811 1.738 0.00792.2×1052. 半乳糖0.12810 1.280 0.01560.8×1053. 蜜二糖0.2008 1.600 0.345 0.4×1054. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.14010 1.140 0.00443.2×1055. 岩藻糖0.1489 1.332 0.360 0.36×105a. 抑制浓度被表达为引起培养的L1210细胞生长的50％抑制的μg蛋白质ml。b. 活性单位被定义为当具体的级分被加入到L1210细胞时，引起50％细胞生长抑制所需要的稀释的系数。
表14来自ISCADOR′M′的生物学活性糖结合蛋白的级分分离(20％)级分名称 蛋白含量 总体积 总蛋白 ICa50(μg 总活性(mg/ml) (ml)(mg) 蛋白质) 单位Iscador′M′，20％ 4.6 12 55 0.252.2×105来自G-75柱的级分 0.315 65 20.50 0.0782.6×105(21-65)用EDTA缓冲液洗脱的亲合柱1. 乳糖 0.203 10 2.08 0.0390.57×1042. 半乳糖 0.064 12 0.700.070.63×1043. 蜜二糖 0.182 12 2.200.901.20×1044. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.048 12 0.500.290.35×1045. 岩藻糖 0.151 9 1.360.280.80×104用含有相应糖的缓冲液洗脱的亲合性1. 乳糖 0.053 8.5 0.450.300.15×1042. 半乳糖 0.080 9 0.700.260.27×1043. 蜜二糖 0.009 7 0.060.035 0.17×1044. N-乙酰-D-半乳糖胺 0.066 12.5 0.820.027 3.00×1045. 岩藻糖 0.198 10.5 2.070.550.38×104未结合蛋白(在糖缓冲液洗脱后) 0.225 50 11.250.25 4.5×104a. 抑制浓度被表达为引起培养的L1210细胞生长的50％抑制的μg蛋白质ml。b. 活性单位被定义为当具体的级分被加入到L1210细胞时，引起50％细胞生长抑制所需要的稀释的系数。
表15发酵对于VISCUM ALBUM L的糖结合蛋白(植物凝集素)的生物活性的影响(ISCADORTM′M′)蛋白质 T4GEN ISCADORTM％改变(A.U.) (A.U)(±)(Ca2+)依赖性糖结合蛋白1. 乳糖 0.49×1050.02×105-95.02. 半乳糖 1.00×1050.12×105-88.03. 蜜二糖 0.44×1050.07×105-84.14. N-乙酰-D-半乳糖胺0.12×1050.01×105-97.15. 岩藻糖 0.12×1050.02×105-85.7(非Ca2+依赖性糖结合蛋白)1. 乳糖 2.20×1050.20×105-91.02. 半乳糖 0.80×1050.02×105-97.53. 蜜二糖 0.40×1050.06×105-85.04. N-乙酰-D-半乳糖胺3.20×1050.72×105-77.55. 岩藻糖 0.36×1050.01×105-97.3*ISCADOR′M′，20％和T4GEN(10％)被用作发酵和非发酵槲寄生临床制品的样品。活性被描述为在其他各处所描述的总活性单位。
9. 实施例元宝草，原植物、贯叶连翘Hypericum perforatum9.1 植物来源/提取方法有许多来源和许多形式的元宝草。它可以是干燥的(茎，叶，花，芽)。它亦可以是粉末提取物的形式。它可以被冻干。亦可制备压榨的花的油提取物。多种形式的浸剂(水性)，水浸渍液，或醇水提取物都是可得的。在以上的发明详述中讨论了加工和提取元宝草的方法。
9.2 生产商/产品名称有许多元宝草的生产商和元宝草的商购提取物，包括下面列出的JarsinTM，JarsinTM300(LI160)(Lichtuer Pharma GmbH，柏林)，PsychotonimTMM，PsychotonlnTMforte(Hersteller，Darmstadt，)HyperforatTM，ExtractTMI 90017，NeuroplantTM，NeuropasTM，EsbericunTM，RemotivTM(拜耳，德国)和SedaristanTM。以下公司亦生产商购元宝草PhytoPharmica，Nature′s Way，Herbal Choice，Botalia Gold和Herd Pharm。
有一种可商购的金丝桃素产品，称为VIMRxynTM可从VIMRxPharmaceuticalsTM购得。
9.3. 临床研究元宝草是许多关于其提取物和植物的本身的许多临床研究的课题。主要的临床适应症是减轻从轻度至中度抑制。其他临床适应症包括AIDS，抗细菌用途，抗癌症用途，抗致突变用途，抗病毒用途，和作为免疫调节剂和用于免疫抑制的用途。这些将在本节中下面内容中详细讨论。
9.3.1 轻度至中度抑制医师日常地开草药处方的德国，元宝草日趋流行。在1994年，66百万日剂量的元宝草被在德国开作用于治疗抑制的处方(De Smet和Nolen，1996，英国医药杂志313S41-247)。这种植物药目前被针对安慰剂和多种活性药物在3,000余位患者中进行测试(Hansgen等，1994，Nervenheikunde12285-289；Harrer等，1994，老年精神神经病学杂志(J.Geriatric Psychiatry Neurology)7S24-28；Hubner等，1994，老年精神神经病学杂志7S12-14；Martinez等1994，老年精神神经病学杂志7S29-33；Sommer和Harrer，1994，老年精神神经病学杂志7S9-11；Vorbach等，1994，老年精神神经病学杂志7S19-23；Woelk等，1994，老年精神神经病学杂志7S34-38)。
在德国临床试验中所用主要制剂在表15中总结。所有这些制剂根据金丝桃素含量标准化。
表15抑郁研究中所用主要元宝草制剂的描述
亦含有缬草提取物德国的研究者(与San Antonin Texas的合作者一起)最近发表了关于在总计1,757例轻度至中变严重抑郁症门诊患者身上进行的23次随机的元宝草的试验的数据统计。他们总结出该草药比安慰剂明显优越，而且与标准的抗郁制药有相似的效力，但产生的副作用较小(Linda，1996，英国医药杂志313253-258)。
包括在数据分析中元宝草在抑郁中的效力的对照研究是随机，或“近似随机”交替进行。对于草药单独使用，或与其他植物提取物伍用，与安慰剂和/或标准抗抑郁药进行比较。
23次试验中的20次是双盲的，1次是单盲的，2次是公开标记的。多数疗程是4-8周，每一研究的方法学质量由至少两个评论者进行评定，以确定其收入数据分析的资格。
在每一研究中，抑郁症状的改善具有interrater可信性的抑郁评定等级(scale)进行评价，最常用Hamiltom抑郁评定等级(HAMD)和临床全球抑制指数(BGI)。作为标准化参比物质的金丝桃素，或总提取物的每日剂量在不同研究中变动很大，分别从0.4，2.7mg至300和1000mg。
在13次研究中，将单一元宝草制剂和安慰剂相比较，55.1％(225)的接受了草药的病人得到改善。相对于22.3％(94)的患者对安慰剂作出响应。在与标准抗抑制药比较中，三次实验单一使用制剂，两次伍用，63.9％(101)的患者对单一制剂作出响应，相比于58.5％(93)的患者响应标准抗抑郁药，67.7％(88)响应于伍用的提取制备物(元宝草和缬草)，相比于50％(66)的患者响应于标准搞抑郁药。
研究者深知从相当杂乱的研究搜集的数据得出可靠结论所存在的问题。这些问题由不同研究之间使用的草药制剂的不同数量和金丝桃素可能不是唯一生物活性成分造成。
撇开这些局限性，Linde和同事发现有足够证据提出在治疗一些抑郁症中，元宝草比安慰剂更有效的结论。然而这些数据不足以评判它是否与标准抗抑郁药一样有效，虽然它看来副作用较小。他们认为这些初步的效力的指片保证了将几种剂量的不同的元宝草制剂与标准抗抑郁药相比较的长期控制试验的进行。
在伴有数据统计的独立的评注中，荷兰研究者Peter De Smet和Willen Nolen同意这些数据是富有前景的，但是还不足以接受元宝草作为有效的抗抑郁药制剂(DE Smer和Nolen，1996，英国医药杂志313241-247)。除了剂量标准化和足够实验长度之外，他们要求在严重抑郁的患者身上进行实验，并进行长期的研究以评价复发的风险和晚期副作用的出现(De Smer和Nolen，见上)。
在另一季节性情感失调(Seasonal Affective Disorder)患者中进行的单盲研究中(DSM-III-R标准)，观察到每日900mg元宝草与传统的光照疗法等效(Kapser等，1996，国际植物医药第二次大会，慕尼黑)。动物实验在几种基于作用于精神的活性的几个动物型测试一种商购元宝草提取物(PsychotoninTM)(Okapanji和Weicher，1987，Arzneimforsch3710-13)这些活性包括两个用于抗抵郁剂的小鼠水轮测试(waterwheel test)中增加的活性，和隔离的雄性大鼠的降低的攻击性。
在最近一次演示中，Butterwech等将元宝草提取物LI160，与一种合成的抗抑郁药安非他酮进行比较(Butterwesh等，第二次国际植物药大会，慕尼黑；1996)。作者发现两种药在尾悬浮测试(tail suspensiontest)(小鼠)和强迫游泳测试(大鼠)中引起了类似的效应。因为元宝草治疗被已知降低多巴胺功能活性的药物(氟哌啶醇，舒必利，χ-甲基酪氨酸和γ-丁内酯)拮抗，作者总结说元宝草通过多巴胺能激活而施加其活性。对于甲醇提取物的多种级分的研究揭示，不同的成分导致不同的活性。
报道了在小鼠中以500mg/kg剂量酸腹内给药时水/醇提取物的肝保护活性(ozturk等1992，)这一结论基于元宝草增加大鼠胆道流量降低巴比妥盐处理小鼠中CCl4-诱导的麻醉的能力。Muller等(1996)报道元宝草提取物LI160，在亚慢性处理之后(250mg/kg，2周)的大鼠额皮层中，引起了15％的β-肾上腺素能受体的减量调节。在同一研究中，作者发现了在类似剂量10倍于临床剂量的丙咪嗪处理后25％减量调节。
9.3.2 抗病毒活性金丝桃素目前作为抗病毒药在美国用于早期临床试验(Bombardelli和Morazzoni，1995，Meruslo等1988)。研究表明两种元宝草的两种主要成分，金丝桃素和假金丝桃素，抑制多种被膜病毒，包括单纯疱疹病毒(Weber等，1994)和与AIDS相关的1型人免疫缺陷病毒(Lavle等1989；Lopez-Bassochi等，1991，Meruelo等1988)。而后继的研究者断言金丝桃素和假金丝桃素展示了一种独特的效力非凡的抗病毒活性，Weber等(1994)推测这可能是因为与细胞和病毒膜的非特异性联结。亦报道了抗鼠巨细胞病毒，Sindbis病毒(Hudson等1991；Lopez-Bazzocchi等1991)。和马传染性贫血病毒(Carpenter和Kraus，1991)的活性。
抗病毒活性看来涉及一光激活过程(Carpent和Kraus，1991；Degar等1993；Kiaus等1990；Lopez-Bazzocchi等.，1991)，该过程形成纯氧并失活病毒融合体和形成合胞体(Lenard等.，1993；Thomas等，1992，Yip等1996)。虽然金丝桃素确实展示了体内(小鼠)抗病毒活性，这些光动力特性可能限制其作为抗病毒药的潜在用途(Stevenson和Lenard，1993)。然而，除了产生纯氧外，金丝桃素可以光还原氧为超氧化物基，在黑暗时可形成半醌基(Lauie等，1975)。后一作者推测这种形成半醌的能力可能造成了在整体动物中的抗病毒活性，并且他们保持了(从80年代初起金丝桃素的临床实用性，报道了金丝桃素抑制组织培养物的神经酸质瘤细胞的生长(Could well等，1994)。看来亦有光激活作用参预了其抗作用(Andreoni等，1994)。
发现金丝桃素和假金丝桃素抑制重要的调节酶，蛋白质激酶C(IC50＝1.7μg/ml，和IC50＝15μg/ml)(Takahashi等，1989)。金丝桃素亦抑制上皮长因子的受体酪氨酸激酶活性(de Witte等，1993)。后一效应与抗病毒和抗瘤活性均有关(Lauie等，1995，Parnossian等.，1996)。
9.3.3 愈伤效应历史上元宝草是最被依重的治疗创伤的植物性药材之一。这种活性部分由于元宝草的抗微生物活性，该活性用功于精油。类黄酮，间苯三酚(phloroglucinol)衍生物hyperforin和ad hyperoforin，和呫吨酮kielcorin亦被认为有功于元宝草的愈伤效应。
精油和一种醇提取物的水溶性级分展示了微弱的抗直菌和明显的抗菌活性。单宁和类黄酮灭活E.coli，于1∶400或1∶200的稀释度下(khosa和Bhatia，1982；Shakiroua等1970)。报道hyperforin和adhyperforin具有大于磺酰胺的抗菌效应(Negrash和Pochinoh，1972).
一种通过用100g橄榄油于20℃提取5g鲜花10天而制备的烧伤软膏被用于治疗1，2，3级烧伤。一级烧伤在48小时愈合。二级和三级烧伤愈合而不留疤痕比用传统方法治疗快3倍或3倍以上。抑制了keloid形成(Saljic，1975)。发现一种可商购制品(Novoimamine；含有0.412％栎精(quercitin)可有效抗金黄色葡萄球菌感染(Negrash和Pochinok，1972)。关于这一点，其效应亦被类似地报道大于用磺酰胺进行的传统治疗(Aizenmell等)。
研究了一种元宝草的顺势医疗酊剂(1∶10)的愈伤性能，并与另一种广泛使用的愈伤草药金盏花(Calendula officinalis)比较。口服元宝草酊剂的效应，与局部施用Calendula酊剂在切口，切除和死空间伤(dead space wound)的愈合上更明显，这被表皮形成以及伤口抗拉强度的提高所证实(Gurumadua等，1991)(见表16)表16元宝草和金盏花的愈伤效应
>n＝71*P＜0.001(Gurumadhva等.，1991)9.3.4 多样效应报道元宝草可用于治疗许多其他病症。在一项研究中，元宝草原花青素(procyanidin)(PC)级分被用于测试一离体的豚鼠心脏制备物(Melzer，等，1989)并发现以相同于来自Crataegus(山楂)的原花青素的方式提高冠状动脉流量。同一研究者在猪离体冠状动脉中测试了原花青素级分。所有PC级分拮抗组胺或前列腺素F22-诱导的动脉收缩(Melzer，等1991)。在另一研究中，初步发现提示元宝草可用于治疗慢性紧张性头痛(Heirnze和Gokil，1996)。
9.4. 硅胶柱级人分析醇元宝草的酊剂的级分分离用正相柱色谱进行。这一方法基于其优选的质量回收(＞90％)而被选作预色谱技术，选择的标准品的分离(类黄酮芒果苷，芸香苷，heperoside，栎素，栎精；金丝桃素)，以及同时存在的其他级分的分离。所用材料和方法详述如下使用下列步骤选择元宝草的化学标记物，广泛查阅关于元宝草(Hypericum Perforatum)的文献表明金丝桃素，和一些它要的类黄酮(芸香苷，栎素，栎精)以及在一系列测试中具有最稳定生物活性的成分(类黄酮止痛药(Vasil chenko，1986)，镇静药(Berghrfer，1987)，MAO活性(Kitanov，1987)；金丝桃素抗病毒(Bysfrou，1975)。抗抑郁和抗焦虑药(Puke1992)支持了在欧洲用于治疗感染和抑郁的一般用途。这是在以下步骤中用不同小组进行测定的，以生物测试或者单个成分，或者富含一类化合物的级分，该级分含有大量的金丝桃素和类黄酮。
草药配料元宝草原材料的醇酊剂是商购的。
制备型CC方法大约14ml商购醇酊剂蒸发过夜至干燥，产生640mg残余物。生成的提取物用4份SiO2(硅胶)研制，并层叠到预装填了30g SiO2的制备型开口被璃柱中。CC(柱层柱)条件如下柱SiO2；流速133ml/hr，使用下列洗脱方式收集5个级分(200ml)CHCl3/MeOH82(两份级分由不连续的色带构成)；CHCl3/MeOH 7∶3，CHCl3/MeOH1∶1和100％MeOH。
液体提取物(SJ41，14ml)真空下蒸干产生0.64g残余物。干的残余物用4份硅胶研制(立即混合)并装到预填充了置于氯仿中的30g硅胶的玻璃柱的顶部。柱展开时间超过6小时，用氯仿甲醇分步梯度完成。在洗脱过程中，每一步用200ml溶剂体积，其比例变化是8∶2，7∶3，1∶1，最后是100％；甲醇，级分1和2。由两个不连续的色带构成，从比例为8∶2的CHCl3∶MeOH洗脱液获得。其它级分代表从每一梯度洗脱获得的级分。收集的级分真空蒸干，下面给出其收率
TLC分析TLC色谱显示了上述5个级分的教科书的分离。含有植物化学品的参比标准品没有共同进行色谱。级分的化学含量如图10所示。
9.5. 单胺氧化酶包物活性分析，血清素转运酶测试其它测试。
9.5.1 单胺氧化酶-A(MAO-A)单胺氧化酶(MAO，E.C.1.4.3.4.)是一很少鉴别的酶，只为它催化一个胺基团从多种底物上除去。包括内源性物质(去甲肾上腺素，肾上腺素，多巴胺，酪胺，5-羟色胺和许多是胺的药物。MAO作为重要的保护机制针对外源物，生物活性的胺起作用。至少有两种类型的MAO，它们展示了对底物的不同偏好，和对于选择性抑制剂不同的敏感性；他们最初由对氯吉灵(clorgyline)的敏感性和对5-HT(MAO-A)的偏好，和对司立吉林selegiline(deprenyo)的敏感性和对苯乙胺的偏好而定义。这两种类型的MAO看来是具有不同分子量的实体，以不同比例存在于不同组织中。MAO抑制目前在治疗中的用途是相当非选择性的，但选择性抑制剂在一些临床条件下可能提供了优越性。只有选择性的MAO-AZ抑制剂(如Clorgyline)看来能有效地治疗严重抑郁，而选择性MAO-B抑制剂可能对于帕金森氏症和运动障碍有益。
MAO酶活性在通过差速离心分离有大鼠脑的线粒体级分进行测试。在200mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的40μg膜蛋白质与测试化合物混合，反应通过加入95μM〔3H〕血清素(2-10mCi-mmol)起动。于37℃温孵20分钟后，反应通过加入5％HCl而终止。测定在一提取物中的〔3H〕血清素放射活性，化合物于10μm进行筛选(Meduedev等，1994，生化药理47303-308)。
单胺氧化酶活性抑制化合物 IC50(μM)Tetrindole Mesylate 0.046甲磺酸吡吲哚 0.016*氯吉灵0.00089*标准参比化合物单胺氧化酶结果在下列总结表中展示。
9.5.2. 单胺氧化酶B单胺氧化酶(MAO，E.C.1.4.3.4.)是一很少鉴别的酶，且它催化一个胺基团从多种底物上除去。包括内源性物质法甲肾上腺素，肾上腺素，多巴胺，酪胺，5-羟色胺和许多是胺的药物。MAO作为重要的保护机制针对外源的，生物活性的胺起作用。至少有两种类型的MAO，它们展示了对底物的不同偏好，和对于选择性抑制剂不同的敏感性；他们最初由对氯吉灵敏感性和对5-HT(MAO-A)的偏好，和对司立吉林(deprenyl)的敏感性和对苯乙胺的偏好而定义。这两种类型的MAO看来是具有不同分子量的实体，以不同比例存在于不同组织中。MAO抑制目前在治疗中的用途是相对非选择性的，但选择性抑制剂在一些临床条件下可能提供了优越性。只有选择性的MAO-A抑制剂(如，clorgyline)看来能有效地治疗严重抑郁，而选择性MAO-B抑制剂可能对于帕金森氏症和运动障碍有益。
MAOA酶活性在通过差速离心分离自大鼠脑的线粒体级分进行测试。在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的40μg膜蛋白质与测试化合物混合，反应通过加入140mM〔3H〕多巴胺(2-10m Ci/mmol)起动于37℃温孵20分钟后，反应通过加入5％HCl而终止。测定在一提取物中的〔3H〕多巴胺放射活性。化合物于10mM进行筛选(Egashira等1996.生化药理47303-308)。
以下参比化合物被用于单胺氧化酶B的抑制参比化合物，(IC50(μM))；N-(2-氨乙基)-4-氧代苯酰胺盐酸化物，(23)；N-(2-氨乙基)-3-碘代苯酰胺盐酸化物，(1.7)；和氯吉林，(0.0027)。
9.5.3 血清素转移测试该测试测量与血清素吸收相关的〔125I〕RTI-121与突触前位点的结合。在改性的Tris HCl pH7.4缓冲液中，用标准方法制备175±25g雄性Wistar大鼠的脑皮质膜。5mg等份的膜与10pM〔125I〕RTI-121于25℃温孵90分钟。在100μm氯丙咪嗪存在下测量非特异性结合。过滤膜并洗涤3遍。计数滤纸以测量〔125I〕RTI-121特异性结合。化合物于10mM进行筛选(Boja等，1992，Synase1227-36)测试参比数据Kd 1.1nMBmax 322fmol/mg蛋白质特异性结合 85％参比数据化合物 IC50(nM) Ki(nM) nH氯丙咪嗪 1,100 1,100 0.5马来酸喹哌嗪560 5500.86-NO-喹哌嗪3,400 3,400 0.7氯哌三唑酮 5,500 5,400 0.8米安舍林 6.4 2.1 1.0
MAO-B和血清素物移测试的结果在总结表中给出。
元宝草提取物-生物学活性测试结果标准品/提取物/级分MAO 5-HT血吸收金丝桃素 阴性4μMHyperoside阴性阴性芸香苷阴性阴性栎精 1.9μM 阴性栎素 阴性阴性Magniferin阴性阴性提取物#1 阴性阴性提取物#2 阴性阴性级分1 阴性阴性级分2 阴性阴性级分3 阴性阴性级分4 阴性阴性级分5 阴性阴性生物活性测试证实了栎精的MAO-A活性，和金丝桃素的血清素吸收活性，然而无论是提取物(图11)还是级分(图10)都不含有足够量的任一标准品(栎精，栎素)来测试这两种生物活性。因而不能计算每一成分的贡献百分比。
9.5.4 其他体外研究虽然先前研究报道金丝桃素以50g/ml浓度抑制MAO(如，Suzak等，1984，Planta Medica50272-274)。其他人未能证实这一效应(Bladt和Wangner，1994，老年精神神经病学杂志7S57-59；Demisch等，1989，Pharmacopsychiatry22194；Thiede和Walper，1994老年精神神经病学杂志7S54-56)，一种释解是Suzuki等人所用金丝桃素看来仅是80％纯度的提取物。很可能该制剂的剩余的20％部分中的一种或多种成分造成这种微弱的酶抑制。这种可能性被Bladt和Wagner(1994)证实，他们展示了元宝草的具有最高MAO抑制活性的级分含有最高浓度的类黄酮。元宝草成分的计算机模型亦提示类黄酮最有可能是MAO抑制级分(Holtje和Walper，1993，Nervenheilkunde12339-340)；在一相关物种(Hypericun brasiliense)中呫吨酮是活性最高的特别是针对MAO-A(Rocha等.，1994，Phytochemistry36)。
然而，元宝草所显示的MAO抑制未必是药理学相关的，因为它未能被证明在体内的活性。Bladt和Wagner(1994)报道在给大鼠施用300mg/kg元宝草后，未见来自体内的MAO抑制。这是由于活体成分的快速代谢还是其他原因，尚未有定论。然而，对于元宝草提取物LI160的药物动力学研究表明，在人类志愿者体内在单次给予300mg剂量时，金丝桃素血浆水平仅有1.5ng/ml，在稳定状态时是8.5ng/ml(Staffeldt等，1994老年精神神经病杂志7S47-53)。除非活性化合物经此金丝桃素大得多的数量出现，或集中在突触末端，其血液水平低于抑制MAO所需浓物的几个数量级。在超生理浓度(最高可达500μg/ml)时多种乙醇元宝草级分亦可显示出对另一降解儿茶酚胺的酶，儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)的抑制。
另一提出的机制涉及对血清素的影响，Muller和Rossel(1994)报道在50μM(～25μg/ml)时，元宝草提取物抑制血清素表达(根据这一方法，这些作者指一粗提取物时，使用术语“摩尔浓度”(molarity)〕，Perovic和Muller(1995)报道了血清素吸收的抑制(IC50＝6.2μg/ml)(Muller和Rossel，1994老年神经精神学杂志7S63-64；Perovic和Muller，1995，Arzneim-Forsch451145-1148)。前一效应所需浓度在整体动物体内肯定是永远不能达到，甚至后一浓度看来也不能。作为参照，Muller等报道了一合成抗抑郁药氯丙咪嗪的血清素吸收抑制IC50为0.9nM(～0.3ng/ml)(Muller等1996，第二届国际植物药学大会，慕尼黑，1996)。另外，Muller等亦报道了突触体GABA吸收的的抑制(IC50＝1μg/ml LI160)和GEBAA受体结合的抑制(IC50＝3μg/ml)。
另一新的提议是元宝草提取物(来提供浓度)降低了细胞因子表达(白介素6)(Thiele等，1994，老年精神神经病学杂志(增刊)7S60-62)。这一假设是，白介素能减轻敏感个体的抑郁(Smith，1991，Med Hypotheses，35298-306)。精神神经免疫学学科过于年轻，难以在不久的将来关于这一机制给出确定的答案，但抑郁和免疫之间的联系仍然吸引着人们的注意(Kook等，1995，Biol.Psychiatry.37817-819)。
在一个NIMH筛选条约(Contract)(Nova ScreenTM，Baltimore，马里兰州中)，一商购的来自Hypericun perforatum的新鲜花和芽的粗提取物(1∶1.5水一醇(40∶60)从开花的顶端Herb PharmTM)，该提取物含有-0.1％金丝桃素，真空干燥，然后溶于4％DMSO，稀释到5g/ml的起始浓度。用于39种受体，和2种酶体系的一组体外测试中。受体测试表明至少50％放射性配体的置换(或50％MAO抑制)被认为是“采样数”就这些采样数作出浓度一效应曲线。结果如表17所示。
表17用元宝草提取物进行的NIMH/Nova筛选受体结合(酶活性测试)(Herb Pharm)<
<p>元宝草的粗提取物对于腺苷，GABAA，GABAB，苯二氮_炎，三磷酸肌苷(IP3)和单胺氧化酶(NAO-A，MAO-B)有明显的受体亲合性，粗元宝草提取物对于MAO的抑制与先前的报导一致(Bladt和Wagner 1994，Suzuk；等1984，Planta Medica50272-274；Thiede和Walper，1994，)结果见表18。
*Ki＝IC50/1＋配体亲合力/配体浓度。然而，与粗提物不同，在最高可达0.1mM的浓度下，合成金丝桃素(95％)缺乏明显的MAO-A和MAO-B抑剂(表18)。金丝桃素只有对NMDA受体的亲和性(Ki-1M)，这可能在其报道的抗病毒活性中起作用，因为NMDA拮抗剂阻止gp120诱导的神经毒性(Diop等，1994，神经科学通迅，165187-190).
表19金丝桃素对受体结合/酶的抑制的影响
这些数据与最近的药理学证据一致，提示该植物的其他成分可能对于报道的精神治疗活性更重要。先前报道过一些这样的结果(COH，1995，Psychopham.Bulletin 31131-137；Cott，1996，Psychopharm.Bulletin 31745-791)。除GABAA和GABAB之外，就这些体外活性所需的元宝草的浓度不可能在口服之后的整体动物或人体内达到。可以想象，在此提供的元宝草提取物对于GABA受体的非常高的亲和性可能是重要的，除非在其进入全身循环之前。响应成分被代谢掉，可以预测血浆水平足以结合GABA受体。值得注意的是Muller等(1996)报道关于GABAA的IC50为3μg/ml。这一结果与本发明不同的原因不明。
GABA结合的意义目前未知，但有大量的文献论及GABA在情感失调(afreetive disorder)中的作用。发现在丙咪嗪治疗中，GABAB刺激提高受体的减量调节(Enna等，1986，在Bartholini等编GABA和行为失调实验和临床研究Raven出版社。纽约、NY，198623-49)。Nielson等报导了在抑郁门诊病人中，GABA-能药(酚加宾)(fengabnine)的抗抑郁药效应(Nielsen等，1990，Acta PsychitricaScandibnauica 82366-371)。Petty等报道在双极和单极抑郁中，GABA血浆水平低，而且苯二氮_炎(可提高GABAA活性)可以有效的作用抗抑郁药和抗焦虑药(Petty等1992.Biological Psychiatry32354-363；Petty等，1993，神经精神药理学(Neuropsychopharmacology)9125-132；Petty等，1995，Biologial Psychiatry38578-591)。GABA神经元系统亦调节多巴胺和多巴胺-诱导的行为(Coo等，1976，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.295203-209；Cotl和Engel，1977，J Neural，Transm，40253-268)。
9.6 文献中记载的元宝草的活性成分元宝草含有多种具有记载的生物活性的化合物。多数研究者认为其效应是由多种成分而非任何单一的成分造成。推测的最令人感兴趣的成分包括萘并二蒽酮，金丝桃素和假金丝桃素和广谱的类黄酮包括栎精，栎素，3′，8″-双-4′，5，7-三羟(基)黄酮和金丝机苷。报道两类化合物均对其抗抑郁药和抗病毒活性有贡献。间苯三酚，hyperforin和adhyperforin，精油，类黄酮和呫吨酮均对元宝草的愈伤特性有贡献。
9.6.1. 元宝草成分元宝草的主要活性成分是萘并二蒽酮衍生物(＜0.1-0.15％)(Deutscher Arzneimittel-Codex)，第三版附卷91，1986年编)；金丝桃素(0.02-1.8％)(Benigni等，Hypericun，Piante MedicinalChimica，Farmacologia e Terapia Inuerni和Della BeffaMilano，1971)假金丝桃素，异金丝桃素，大黄素蒽酮。在新鲜材料中亦出现了原金丝桃素和假异金丝桃素。暴露于光时，这些生物合成前体转化为金丝桃素和假金丝桃素。亦提及了环假金丝桃素，它是假金丝桃素氧化的产物(ESCOP 1996，Monograph元宝草EuroperanScientific Coperative for Dhyto-Medicines)。
9.6.2. 元宝草的金丝桃素含量最高浓度的金丝桃素发现于干燥的花里(Benigni1971)其次是蒴果和顶端叶(Benigni，1971；SouthWell和Campbell，1991，植物化学30475-478)。据报道具有相对较高数量的油腺的狭叶变种〔每mm6.2个油腺〕比阔叶变种每mm2.2个油腺有明显高浓度的金丝桃素(Southwell和Campbell，1991)。
以g％表示的H.Perforatum不同部位的金丝桃素含量
(Benigni等.，1971；List和Horhammer，1993)各部位中每百万金丝桃素含量(Benigni等.，1971)
(Benigni等1971；Southwell和Camphell 1991，)9.6.3 元宝草的类黄酮含量在233种测定了类黄酮含量的植物中，Hyericum perforatum的花是最高的，为11.7％(Tsitsina，1969，Tr.Bot，Sabov，Akud，Nauk，Kag，111-114)。在双类黄酮中，由双体，三体，四体和高聚物组成的原花青素(proanthocyanadin)占植物气生部分干重的12％。包括以下的黄酮醇；莰非醇，藤黄菌素，杨梅黄酮，栎精(2％)，黄酮糖苷；栎素(0.524-0.3％)，异栎素(0.3％)(Dorossiev，1985，Pharmazie 585-586；Kager，1972，Khimiya Prirodnykh Soedinea242-243)。金丝桃苷(0.7-1.1％ hyperoside)(List和Horhammer，1993)，I3′，II8-二芹菜配基(0.1-0.5％)(Berghofer和Holzl，1987，Phanta Medica216-219；List和Horhammer，1993)，阿曼托黄素(amenfoflavone)，I3′-II8-二芹菜配基(0.01-0.05％于花中)，芸香苷(0.3％)(Akhtardzhiev等，1984，Farmatsiyea(sophia)34 1-6；Berghofer和Holzl，1989Planta Nedica91kitanov，1987，Khimiya Prirodnykh Saebinenii2185-203)，龙胆(gentistic)酸，无色花青素(Benign等，1971)。
(Benigni等.，1971)据报道，在即将开花前的出芽期的花中，类黄酮和花青素原的浓度最高(11.71％)，其次是叶和茎(7.4％)。亦报道生长于高海拔的植物，和生长于北坡的植物的类黄酮浓度最高，在山北坡生长的植物比生长于阳面的植物轻(Brantner等，1994，Scientia Pharmaceutica 62261-276；Tsitsina，1969；Ihebeleva，1973，Rast，Resar 9402-404)。I3′，III8-二芹菜配茎的最高浓度发生于芽和花中，果实中浓度很低，茎和叶不见痕迹(Berghofer和Holzl，1987)。金丝桃苷在花中最高(3％)，其次是叶1.05-1.80％)在茎中仅有痕量(0.13％)(Maksytina和koget，1971，khmiya Prirodnykh Soedinemii，3363-367)。在叶和花中发现栎精(0.1-0.582％)，在绿色叶中有痕量红色叶中有较高含量，在开花期的叶中有最高含量，在开花时的叶(tops)有更高含量。在所有部分都发现了芸香苷，但出芽期的叶中含量较高(2％)，而花中仅有(0.095％)，生长在干燥环境的花生长于湿润环境的植物高，据报道在夜间收获芸香苷含量最高。
日晒浸渍的制剂比避光浸渍的制剂生成更高量的芸香苷(Benigni等，1971)。在一新鲜材料分析中，发现植物的顶部部分中的栎精含量比单纯的叶和单纯开花时的叶子(tops)要高(Smith等，1996，质量认证实验室-Herh PharmTMWillans OR，1996)。
Akhtardzhiev等.，1984；Genigni等.，1971；Berghifer和Holzl，1989；Brantner等，1994；Dorossiev，1985；Kitanov，1987；Koget，1972；List和Horhammer，1993；Smith等，1996；Tsitsina，1969)9.6.4.元宝草的精油精油主要由单萜(蒎烯)和倍半萜烯组成，且构成0.1-1％(Benighi，1971；ESCOP，1996)。主要的化合物包括饱和的烃甲基-2-辛烷(16.4％)和2-蒎烯(10.6％)，还有痕量甲基-2-癸烷，甲基-2-丁醇和十一烷，α和β蒎萜，α萜品醇，牻牛儿醇，痕量月桂烯，苎烯，石竹烯，律草烯，C16和C24正-烷烃，C24，C26和C28正-烷醇(Brondz和Greibrokk，1983，天然产物杂志(Journal ofNature Produets)46940-941；Brondz等；1983，植物化学22295-296Mathis和Ourisson，1964，植物化学337-38)。
茎中的精油含量很小，比成熟蒴果中高-些，开花之前的含量(0.26％)比花中(0.11％)含量要高。当茎被削去时，植物产生了平均035％精油。(Benigni等，1971)。
9.6.5. 元宝草中的间苯三酚hyperforin(间苯三酚的含异戊间二烯基的衍生物)，adhypeforin(类似于啤酒花的苦素，adhunalone)。在果实形成期间，hyperforin和adhyperforin水平显著升高，hyperfoin从在花中的2.0％升高至在果实中的4.5％(基于干重)，极性hyperforin样化合物从0.05升高至0.3％。adhyperin增加了10倍，从花中的0.2％，至蒴果中的1.95(Benigin等1971，Brondz等，1982，四面体通讯231299-1300；Bystrov1975，四面体能讯)322791-2794；Maisenbacher和Kouar，1992，Planta Medica291-293)。hyperforin是亲脂的，暴露于热和光时不稳定。
9.6.6 元宝草的杂集化合物胆碱，类胡萝卜素叶黄素，堇菜黄质，cis-throllixanthin，throllichromone，β-谷甾醇，果胶，栎鞣红，和rhodan；咖啡酸(0.1％)，绿原酸，异戊酸，月桂酸，肉豆蔻酸，烟酸(叶中0.12％)，棕榈酸和硬脂酸；氢基酸包括半胱氨酸，GABA(0.7mg/g)谷氨酰胺，亮氨酸，赖氢酸，鸟氨酸，脯氨酸，苏氨酸；莨菪亭，7-羟基香豆素；维生素C，xanthonolignoid(1.28mg/100g，kielcorin)Bennett和Lee，1989，植物化学20907-88；Karryev，1980Izv，Aked，Nauk，Turkm，sse，52-57；List和Horhammer.1993)。
9.6.7. 分析的分析方法两种感兴趣的化合物作为标记级分，包括两种天然色素，金丝桃素和假金丝桃素(萘并二蒽酮)。这些染料是该草药的特征性标记，很容易被萃取到甲醇中。它们都吸收可见光，并在588nm处有最大光吸收，在甲醇中是高度荧光的。这两种色素的吸收和发散谱是相似的，包括其吸光度。需要分离这两种色素以测定每一色素的浓度。类黄酮亦被认为是元宝草的一类重要的成分，提供了两类化合物的方法。
9.6.8. 金丝桃素和假金丝桃素的薄层制备样品制备反复用4份连续的10ml甲醇提取1.0g样品，从干燥的植物材料中的代表性样品制备金丝桃素提取物。所有4次提取物的全部内容物在带有刻度的烧瓶中稀释到50ml。在TLC或HPL分析之前，用0.45μM滤膜过滤该溶液。标准品制备合成的金丝桃素标准品(ICN BiochemicalTM，Cleveland OH，Ca2+1934243)以0.10mg/ml的浓度溶于纯甲醇中，并用0.45μM滤膜过滤。这一标准贮存液被用于TLC和HPL校准。标准品/样品溶液的稳定性如果避光保存，金丝桃素和假金丝桃素，以及从其制备的溶液都可稳定保存数月。终止试验在UV-365nm光下，上述提取物的一个小斑点在滤纸上将发出浅红色荧光，在UV-365nm光下，液体提取物溶液也含有浅红色荧光。色谱条件TLC色谱条件一般如下。硅胶(例如有或没有荧光指示剂的EastmanNo#16060-13181)用3∶6∶1的比例的甲苯∶乙酸乙酯∶冰乙酸展开。一般地，用毛细管加样1-5ml样品。用365nmUV光进行检测。金丝桃素色素亦含发生浅红色荧光用而可用可见光检测。金丝桃素的Rf值是0.71，假金丝桃素的是0.50。这一测试的检测限度是0.2mg。
9.6.9 金丝桃素和假金丝桃素的高效液相层析样品的代表物和标准品如上述TCL实验中所述。
HPLC参数如下。Waters Nava-pabTMC-18柱，3.9×150mm回流动相在isocrtic条件下展示，其中流动相是甲醇0.4％磷酸三乙胺(82∶17∶1)。流速是1.0ml每分钟，用可用光检测仪于588nm处检测。在室温下走柱，对于注射10-15μl样品，一般的走柱时间是12分钟。活性组分假金丝桃素和金丝桃素的洗脱速度分别是2.8和9.6分钟。定量和检测的限度检测的限度取决于仪器。我们所用的Waters ModITMHPLC系统具有Weters 991M Photodiode Array(POA)检测器，用558nm光检测。对于金丝桃素和假金丝桃素，检测限度大约都是2.5μg。加料回收的认证当加料样品的吸光值低于0.8AUFS时，加料回收一般为100％(+/-5％)。HPLC(类黄酮、金丝桃素和假金丝桃素)提取使用超声水浴和滤器，在过滤后，残余物用40ml丙酮于室温提取10分钟。合并甲醇和丙酮滤液，真空干燥，干物质溶于4.0ml甲醇并过滤。
类黄酮，金丝桃素和假金丝桃素的HPLC在下列条件下进行。
LichroCartTM反相(RP)18supersphere柱，4×2500，具有一反相(RP)8前置柱，在室温下以1ml/分的流速展开0-39分钟，40分钟后，是0.6ml/分。注射体积是20μl，用UV245mm检测。
使用三种不同流动相。为检测芸香苷，hyperoside和异栎素，使用乙腈∶水∶磷酸(16∶83∶11)走柱时间是30分钟。
为检测栎素和异栎精，使用下面系统，乙腈∶水∶磷酸132∶67∶1，走柱时间是75分钟。
I3，II8-二芹菜配基，amentoflavone，假金丝桃素和金丝桃素，条件如下。溶剂系统是乙腈∶甲醇∶水∶磷酸(55∶20∶24∶1)。走柱时间是75分钟。
保留时间(分)如下芸香苷(16.7)；hyperoside(18.5)，异栎精(19.2)；栎素(23.8)；luercetin(36.4)；I3-II-二芹菜配基(42.8)；amentoflavone(55.9)；假金丝桃素(59.7〕；和金丝机苷(68.4)。
芸香苷，hyperoside，异栎精，栎精和金丝桃素的标准品可从SigmaST.Louis，MO.USA商购，其余可从Roth购得，样品以25μg/ml，对甲醇中的外标用Karting等人(1996，Planta Mediea 6251-53)进行质量检定。
9.6.10 UV/VIS分光光度方法(金丝桃素/假金丝桃素)样品制备用3份25ml的二氯甲烷(CH2Cl2)提取1.0g粉末状草药样品，或直至溶液澄清而制备定量提取物。弃去二氯甲烷提取物。用丙酮彻底地提取干的残余物。真空蒸干丙酮提取物。残余物溶于3份8ml甲醇中，并转移至25ml体积的烧瓶中。加入足量补加的甲醇，补足体积至25ml。过滤10ml此溶液，弃去头2ml。在一新的25ml体积烧瓶中将5.0ml滤出液稀释至25.00ml。
9.7 元宝草成分hypersoide，芸香苷，栎精，栎素，金丝桃素，芒果苷的HPLC分析分析型HPLC方法如下。HPLC系统是WaterTMHPLC系统，由两个510 EF型泵，717型自动加样器，486型UV-VIS检测器，设定在254mm，以MilleniumTMVersion2.15系统控制和数据处理软件组成使用10ml注射体积上样到反相C-18柱(Beckman UtrasphereTM，ODS柱，5μum，250×4.6mm)。和一梯度洗脱系统进行分离。根据以下方式使用洗脱液A和B(A＝0.1M配制于0.05％TFA H2O中的NaH2PO4；B＝ACN)0-10分钟100-60％A，0-40％B；10-20分钟60-0％A，40-100％B；20-30分钟0-100％A，100-0％B。流速保持在1.0ml/分，于254nm监测峰。
测定了芒果苷，芸香苷，hyperoside，栎精，栎素和金丝桃素成分。5种商购样品结果如下
结果亦在图11中给出。
10. 实施例姜，原植物姜可以通过各种方法来制备姜。可以将它进行切片、冻干并研粉。可以对它通蒸汽并进行蒸馏以获得芳香油。可以对它进行溶剂提取。10.1. 植物来源/提取方法加工和提取天然姜的进一步方法可以在详细描述的加工和提取部分中的方法中找到。10.2. 商品提供者/产品名称在商业上可以从各种来源中得到姜，包括HauserNutraceuticals(Boulder，CO)、Herb Phyters(West Hollywood，CA)、Nature’s Fingerprint Triarco Industries，Inc.(以上这些厂家分布在GNC)、Natures Way(Springvale，UT)、Solaray(Ogden，UT)和Zintona(以色列)。Herbal Choice-Botalia，HerbPharm，Nature’s Resource也提供姜。10.3. 临床应用姜的临床应用是用于晕动病并治疗恶心和呕吐。可以认为姜通过对胃肠道起作用而不是通过中枢神经系统起抗组胺药的作用来使晕动病减轻。有些作者提出姜可以增加胃的运动、同时抑制胃肠道的反应以及随后反馈的恶心，其它作者没有发现论据(Mowrey和Clayson，1982，《柳叶刀》(Lacet)655)。
姜还可改善月经紊乱和与恶心或胃肠不适相关的其它疾病。姜的另一种应用是预防手术后的恶心和呕吐(Arfeen等，1995，《深度麻醉护理》(Anaesth.Intens.Care)23449-454)。其它作者报导姜具有抗血小板活性(防止粘膜损害)、低胆固醇血活性、心血管活性、强心活性、抗炎活性和解热活性(Mustafa等，1993，《药物开发杂志》(J.Drug Dev.)625-39)。Mustafa还报导了姜通过人体内的血栓烷B2水平起作用。其它的工作者已经研究了姜通过前列环素(PEG2)和血栓烷(TXA2)的部分起作用的活性。(Bakon，1986，《医学假说》(Med.Hypothesis) 20271-278)。
10.4. 制备型HPLC的级分分析使用反相制备型HPLC来进行姜的乙醇粗提物的分级分离过程。将这种方法选作一种优选的制备-色谱技术，该技术以所观察到的极佳的产量回收率(＞90％)、分离所选标准物(生姜酚和姜醇)以及分离其它同时出现的成分为基础。将所用原料和方法的详细描述记载在下面。
姜的化学标记物的选择以下列方案为基础。文献中记载的对姜(植物姜)的全面研究表明在大量不同的检测试验中，6-、8-和10-姜醇以及6-、8-和10-生姜酚是具有最一致的生物活性的成分[止痛药、止吐药、抗5-HT药、强心剂、前列腺素和血栓烷抑制作用(Duke，1992)]。前列腺素/血栓烷的生物活性证明了非CNS止吐药的临床表现，正如这种途径在内脏中起主要作用一样(调节酸的产生/吸收/膜再生)。通过以下不同的方法来测定这些生物数据通过对各个成分进行生物检测的方式、或者通过对姜的芳香油提取物(含有大量姜醇和生姜酚)进行生物检测的方式。
草药原料从Hauser Nutraceuticals获得一袋干姜粉(姜)原料并将其标记为LIMS157381。
制备型HPLC法将约150g干姜粉悬浮于500ml的95％MeOH/H2O中并混合过夜。将所得的提取物过滤并旋转蒸发至得到一种油状残余物，且将10ml残余物注射在制备型HPLC(SepTech Navaprep5000TM)上。HPLC的条件如下柱-Vydac C18，5.0×25cm ID；UV-检测器@282nm；流速100ml/分；在30分钟内的梯度为10％ACN-100％ACN，随后在100％ACN时保持10分钟。在第一个30分钟内，每3分钟收集一次级分(300ml)，接着在30-40分钟内收集1升级分，总计11个级分。
分析HPLC法HPLC系统是一种由L-4500A二级管阵列检测器以及D-6000界面、L-6200A智能泵和AS4000 IntelligentAutosamplerTM组成的Hitachi HPLC系统。使用装载在反相C-18柱(Alltech HypersilTMODS，5μm，4.6-260nm)上的10μl注射体积和依据下列安排的梯度洗脱系统、使用洗脱液A和B(A＝ACN；B＝99/1 H2O/MeOH)来进行分离0-5分钟55％ACN，45％MeOH/H2O；14分钟80％ACN，20％MeOH/H2O；20-25分钟55％ACN，45％MeOH/H2O；0-5分钟55％ACN，45％MeOH/H2O。将流速保持在1.0ml/分，在282nm处监测峰。这种分析法的再现性不应超过2.5％的相对标准偏差。
使用反相制备型HPLC来进行姜的乙醇粗提物的分级分离过程。将这种方法选作一种优选的制备-色谱技术，该技术以所观察到的极佳的产量回收率(＞90％)、分离所选标准物(生姜酚和姜醇)以及分离其它同时出现的成分为基础。将所用原料和方法的详细描述记载在下面。
将约150g干姜粉悬浮于500ml的95％甲醇/水中并混合过夜。然后将提取物样品旋转蒸发至得到一种油状残余物，且将10ml残余物注射在制备型HPLC上。HPLC的条件如下柱-Vydac C18，5.0×25cm ID；批号218TP101550；检测器-282nm；流速100ml/分；在30分钟内的梯度为10％乙腈-100％乙腈，随后在100％乙腈时保持10分钟。在第一个30分钟内，每3分钟收集一次级分，接着在30-40分钟内收集11级分，总计11个级分。
文献中记载的对姜(姜)的全面研究表明在许多检测试验中，6-、8-和10-姜醇以及6-、8-和10-生姜酚是具有最一致的生物活性的成分(止痛药、止吐药、抗5-HT药、强心剂、前列腺素抑制因子，参见Duke，1992)。通过以下不同的方法来确定对文献中化合物的选择通过对各个成分进行生物检测的方式、或者通过对姜的芳香油提取物(含有大量姜醇和生姜酚)进行生物检测的方式。
然后如上所述通过HPLC来分析级分以测定6-姜醇、8-姜醇、10-姜醇、6-生姜酚、8-生姜酚和10-生姜酚。根据对购自SigmaChemical Co.TM的辣椒碱标准物的响应度来对所有成分进行定量。用于姜的化学分析的标准物通过文献中的方法来得到。例如，有几个综述存在且出处可以在下列文献中找到(Gvindaragan，1982，CRC科学和营养学中的评论综述(Critical Reviews in Science andNutrition)17191-96，189-256；Van Beek等，1987，《植物化学》(Phytochemistry)263005-3010)。
将每个级分的结果列在表20中。将结果在附图12中表示。
表20姜分级分离的结果
在HPLC分析后将每个级分蒸发至得到一种油状残余物并测定残余物的重量。
10.5. 抑制血栓烷合成、前列环素激动剂的生物活性分析；PG合成酶抑制剂；血栓烷合成酶抑制作用的特异性生物检测试验10.5.1 血栓烷A2的生物检测试验血栓烷A2(TxA2)是一种有效的血小板激活物，它适于增强对弱的血小板激动剂诸如ADP、肾上腺素、以及低浓度的胶原和凝血酶的反应。TxA2从花生四烯酸通过环加氧酶而生成，它本身在细胞激活时由磷脂酶释放。通过TxA2合酶这样一种酶将所得不稳定的前列腺素内过氧化物(PGG2或PGH2)转化成TxA2。通过凝聚血小板而生成的内过氧化物和TxA2可以产生一种深度的血管收缩，这种收缩主要限于紧邻血小板栓塞的血管区域。在血小板凝结过程中生成的有效血管收缩剂可以产生与冠脉或脑梗塞相关的血管痉挛。TxA2的产生增加与各种血栓形成和局部缺血疾病的发病机理有关。TxA2生物合成的抑制剂应对治疗心脏局部缺血、脑梗塞和动脉硬化以及糖尿病具备有利的优点。
通过常规的离心法从家兔的血小板中分离栓测试验中所用微粒体级分中的血栓烷A2合酶。通过向装有试验化合物(或载体)、检测缓冲液和酶的试管内添加底物、前列腺素G2并在30℃下连续保温30分钟而引发反应，然后测定产生的血栓烷A2，将其快速转化成血栓烷B2。通过放射性免疫测定法对形成的血栓烷B2进行定量。在100μM下筛选化合物(Gresele等，1991，《药理学科学发展趋势》(TrendsPharmacol.Sci.)12158-163；Brownlie等，1993，《英国药理学杂志》(Beit.J.Pharmacol.)1101600-1606)。
血栓烷检测试验的结果如下姜提取物-生物检测试验结果标准物/提取物/级分 血栓烷6-姜醇 阴性8-姜醇 N.T.
10-姜醇 N.T.
6-生姜酚N.T.
8-生姜酚N.T.
10-生姜酚 N.T.
提取物 阴性级分#1 阴性级分#2 阴性级分#3 阴性级分#4 阴性级分#5 阴性级分#6 阴性级分#7 阴性级分#8 阴性级分#9 阴性级分#10 阴性级分#11 阴性N.T.＝未检测在血栓烷的检测试验中，提取物、标准物和级分的阴性结果表明这种检测试验非常不普遍(机理过于勉强)并且不是一种用于姜的指纹图谱绘制的合适的检测试验。用于探寻与前列腺素有关的姜提取物、级分和标准物的生物活性的更普遍的检测试验是前列腺素类FP检测试验。将这一整套检测试验的具体内容在下面进行描述。
10.5.2. 前列腺素类FP的检测试验使用从来源于Long Evans、体重为275±25g并通过脱颈椎处死的雌性鼠中获得的子宫剥离物。在32℃、1g拉力下将该组织放入装有磷酸缓冲盐水(pH7.4)的10ml浴器中。相对于对照组0.1μM的PGF2α诱导的反应来说，所记录的检测物质(30μM)因非等渗而诱导的收缩反应在5分钟内达大于50％，这一结果表明前列腺素类FP受体具有激动剂的活性。在检测物质的浓度下如果没有观察到显著的激动剂活性，那么使PGF2α诱导的收缩反应降低50％以上的这种能力表明前列腺素类FP受体具有拮抗剂活性。(Pettibone等，1991，《药理学疗法实验杂志》(J.Pharmacol.Exp.Ther.)256304-308；Vane等，1973，《英国药理学杂志》(Br.J.Pharmacol.)48629-639)。
激动剂 EC50(μM)*前列腺素F2α(PGF2α) 0.001210.6.用于6-姜醇、8-姜醇、10-姜醇、6-生姜酚、8-生姜酚、10生姜酚的HPLC化学分析由几个厂商提供的商品姜的化学分析结果如下。将结果在附图13中表示。
11. 实施例彩绒革盖菌11.1. 彩绒革盖菌成分的分离彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)是一种蘑菇。已将这种稀少的蘑菇的提取物用于恶性肿瘤的术后治疗。认为彩绒革盖菌的活性是由于免疫调制作用导致的。
将650mg彩绒革盖菌粗粉和多糖肽(PSP)(Landford，18个胶囊#941231)加入45ml缓冲液C(参见实施例11)并在4℃下搅拌过夜。第2天将该溶液进行离心(10,000r.p.m.，1小时)、取出上清液并使它通过一系列特异性糖柱(流速6ml/小时)。将该柱用缓冲液C洗涤以除去所有未结合的蛋白质。然后将每个柱用含有EDTA的缓冲液D(10个柱体积)(参见槲寄生部分)洗涤。分别收集这些洗脱液，且每一洗脱液均含有因结合特异性而需要Ca++的碳水化合物结合蛋白。
接下来将每个柱用缓冲液C进行洗涤，然后分别用含有0.5M糖(乳糖、半乳糖和蜜二糖)的缓冲液C进行洗脱。收集每一洗脱液，且每一洗脱液均含有因结合特异性而不需要Ca++的碳水化合物结合蛋白。
使用5K截断值超滤膜滤器浓缩所有6种洗脱液以除去盐和低分子量的成分。
使用与上述实施例中所用培养物中相同的白血病L12系统来检测未与柱结合的每种蛋白质和物质的生物活性。用Bio Rad检测每种样品的蛋白质含量并用6.5％的SDS凝胶来检测样品的分子量。
所分离的13.87mg蛋白质产率＝(13.87×100)/605＝2.29％将彩绒革盖菌样品的定量和生物活性蛋白质指纹图谱列在标21中。将确定为药物等级的标准物指纹图谱列在表22中。样品和标准物指纹图谱的比较证明它们是匹配的，从而将样品看作本发明的药物等级。
表21彩绒革盖菌样品的量和具有生物活性的指纹图谱级分本体 蛋白质含量 总体积 总蛋白质IC50a总活性单位b(mg/ml)(ml) (mg) (μg/ml)PSP 13.4 45 603 - -EDTA洗脱的蛋白质乳糖0.430 5.0 2.15 0.0600 3.5×104半乳糖 0.240 6.0 1.44 0.0210 6.8×104蜜二糖 0.480 6.5 3.12 0.0033 91.0×1040.5M糖洗脱的蛋白质乳糖0.370 8.5 3.14 0.028 11.0×104半乳糖 0.459 7.5 3.44 0.110 3.1×104蜜二糖 0.074 6.0 0.44 0.150 0.2×104未结合的糖 3.950136.0 537- -a导致培养物中50％的L1210白血病细胞生长抑制的抑制浓度(mg/ml)。
b将活性单位定义为当加入L1210细胞时导致50％生长抑制的所需特殊级分的稀释系数。
表22彩绒革盖菌的标准物的量和具有生物活性的指纹图谱
a导致培养物中50％的L1210白血病细胞生长抑制的抑制浓度(mg/ml)。
b将活性单位定义为加入培养物中L1210细胞、导致50％生长抑制的所需特殊级分的稀释系数。
12. 实施例芦荟，原植物芦荟(Aloe Vera)12.1. 植物来源/背景技术芦荟有两种主要的用途。一种是用于愈合创伤并用作抗炎药。第二种主要用途是作为一种刺激性轻泻药。将它称作芦荟或barbadnsis。用于愈合创伤的芦荟是一种从叶心获得的粘液胶汁。用作轻泻药的芦荟形式是从特殊细胞中获得的，所述的特殊细胞出现在位于植物叶表皮下的叶肉外和内层的边缘上。该形式的轻泻药由从干燥成微暗红团块的植物中获得的苦味的黄色树胶制成。两种芦荟的形式非常不同。
芦荟胶汁或芦荟提取物的另外用途是用于保肝、关节炎，用作抗炎药、用作止痒药、用作抗菌剂、用作抗溃疡剂。Leung和Forster(1996)以及Bisset(1994)在参考书中描述了芦荟。干燥胶汗形式的芦荟作为轻泻药的实验对象已经在德国E Monograph中得到证实(德国Commission E Monograph B Anz.No.154，注明的日期为1985年8月21日)。
商品提供者/产品名称芦荟有许多来源。它由Natures Way Products，Inc.(Springville，Utah)作为轻泻药形式进行商业销售。市售可得的胶汁制剂包括芦荟(Aloecorp)、AristoTM(Steiner，德国)、KrauterlaxTM(Dolorgiet，德国)和Dermaide AloeTM(DermaideResearch Corp.)。已经报道了稳定的芦荟胶体组合物(美国专利号3,878,197，Maret)。
12.3. 临床适应症上面讨论了芦荟的主要临床适应症，即愈合创伤、抗炎、保肝、抗关节炎、轻泻、抗菌和抗溃疡的活性。芦荟的另一种有效的应用是作为一种已经在体外得到证实的抗白血病药剂(Kupchan，1976，《天然产物杂志》(J.Nat.Prod.)39223)。其他人已经报道了它对消化器官溃疡的活性并且在最低限度的研究中还报道了它可以改善血液循环。FDA的研究认为芦荟可以治疗烧伤，但发现还没有足够的举证资料且没有足够的文献证据而将它作为一种产品批准。其它的研究已经证实在一般情况下芦荟可以加速创伤的愈合或用于患冻疮的病人(Fulton，1990，《皮外科肿瘤学杂志》(J.Drmatol.Surg.Oncol.)16(5)480；McCauly等，1990，《前列腺素药物》(Prostagrad.Med.)88(8)67)。然而，另一种研究发现芦荟可以延缓创伤的愈合(Schmidt和Greenspon，1991，《妇产科》(Obstet.Gynecol.)78(1)115)。
12.4. 级分分析如上所述使用凝胶过滤色谱法来进行芦荟碳水化合物成分的级分分析。
12.5 生物活性分析已经证实芦荟具有许多生物作用。已知它可以刺激蠕动、抑制胃分泌和扩张毛细管。芦荟还具有促有丝分裂活性、红血球凝聚活性和抗血栓烷活性。所用的主要检测试验是肝细胞酶、鼠外科创伤愈合模型、双加氧酶-1、双加氧酶-2和脂氧合酶的检测试验。如上述SawPalmetto部分中所述来分析双加氧酶和脂氧合酶的活性。如上述姜部分中所述来分析抗血栓烷活性。如美国专利号5,487,899(Davis)中所述来分析芦荟提取物和级分的创伤愈合能力，将啮齿动物创伤愈合模型用于分析芦荟的能力，为有助于愈合创伤。将芦荟单独或结合其它药剂来使用。
12.6. 化学分析芦荟中有许多公认的成分，包括芦荟苷、异芦荟苷、邻位苷、葡甘露聚糖多糖、缓激肽酶、单宁和乳酸镁。
通过HPLC和GPC进行化学分析。此外，还可以用气相色谱质谱联用计(GC-MS)来进行芦荟的化学分析。近来对芦荟成分进行化学分析的一个实例是由Yamaguchi在1993年完成的(Yamaguchi等，1993，《生物科学、生物技术和生物化学》(Biosci.Biotech.Biochem.)57(8)1350-1352)。其中他们研究了冻干芦荟的己烷提取物和丙酮提取物。
这种冻胶主要由几类多糖组成，包括酸性半乳聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、阿拉伯聚糖、和/或葡糖半乳糖甘露聚糖。多糖构成了0.2-0.3％的鲜冻胶。(Tyler和Foster，1996)这些成分包括作为一种前列腺素前体的花生四烯酸(aracedonicacid)(Afzal等，1991，《植物药》(Planta Med.)5738-40)。其它主要成分包括聚糖，这些聚糖包括酸性半乳聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、阿拉伯聚糖(arbinan)、和/或葡糖半乳糖甘露聚糖。多糖构成了0.2-0.3％的鲜冻胶。多糖含量由GPC来测定。Mandel和Das在1980年报导了从芦荟中分离葡甘露聚糖(Mandel和Das，1980，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)87249-256)。芦荟中具有化学活性的其它化合物包括植物凝集素样蛋白质，这些蛋白质具有抗癌和抗炎活性(Winters等，1981，《实用植物学》(EconomicBotany)35(1)89-95；Winters等，1995，《植物药疗法研究》(Phytotherapy Research)9395-400)。芦荟中的其它小分子成分包括各种脂肪酸和各种烃(Yamaguchi等，1993，《生物科学、生物技术和生物化学》(Biosci.Biotech.Biochemi)57(8)1350-1352)。)13. 实施例复盆子，原植物黑果越桔(Vaccinium Myrtillus)一般将它以浆果的果实形式或作为一种提取物入药。提取物一般符合36％花色素苷(anthocynosides)的标准，剂量为160mg，一天一次或两次。
13.1 商品提供者/产品名称有许多复盆子的商品提供者。有主要产权的产品之一是“TegensTM”，由Indena-Inverni della Beffa ResearchLaboratories(米兰，意大利)提供。MyrtocyanTM(Morazzoni等，1990，Fitoterapia，v LXI1)是来自黑果越桔的花色素苷(anthocynosides)复合物(一种TegensTM中的成分)的商品名。复盆子提取物还可以购自Natural Factors Nutritional Products，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)和Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)。胶囊形式的复盆子(25％anthocynosides)可通过Herbal Choice-Botalia、PhytoPharmica、Source Natural、Nature’s Way得到。
13.2 临床适应症复盆子的临床适应症有很多。主要适应症是下胶静脉缺血、静脉曲张、动脉硬化(atherosclersis)和视网膜退化疾病。认为这是由于毛细管硬化(strengghening)活性和血管收缩性增加所造成的。已经证实复盆子具有抗炎活性、抗腹泻活性、愈合创伤活性和保护血管的活性。可以将这种具有保护血管和抗炎活性的植物性药材通过局部或经静脉进行给药(Lietti等，1976，Arzneimittel-Forschung26(5)829)。
13.3 级分分析复盆子的成分包括单宁、花色素苷(anthrocyanins)、类黄酮、各种转化糖和果胶。通过HPLC、GPC或凝胶过滤法来分离复盆子的成分。层析柱的实例包括聚合物实验室用的PL-凝胶5m 500_聚合物、Toyopearl 8HW 40S柱，且还使用SephadexTMLH-20葡聚糖柱。将材料用乙基/乙酸酯-O2/2溶液进行分配，用水和/或醇和/或水和/或丙酮流动相进行凝胶过滤。使用反相柱层析法(RP-HPLC)、使用水和/或水和丙酮和/或水和醇作为流动相进行HPLC。对于GPC来说，使用带有或不带有缓冲液的水和/或水和醇和/或水和乙腈作为流动相。在SephadexTM柱上，使用乙醇或氯仿，乙醇作为洗脱液。
13.4 生物活性分析用于分析复盆子的静脉缺血适应症的主要生物学方法通过血管收缩性试验和血小板聚集试验来进行。对于抗炎活性来说，主要检测试验是环加氧酶-1和-2和5-脂氧合酶试验。如上述Saw Palmetto部分中所述来进行该实验。
如Morazzion和Magistretti所述进行血小板活化因子检测试验(1990，Fitoterapia 61(1)13-21)。测定体外血小板聚集情况、体内血小板聚集情况和活体外血小板粘着性。血管舒张药对静脉缺血临床适应症抑制作用的另一种检测试验通过研究冠状动脉节段对乙酰胆碱的收缩反应来进行(Bettini等，1991，6l(1)《植物药疗法》(Fitoterapia)15-28)。
13.5 化学分析使用HPLC来进行化学分析。主要成分是单宁、花色素苷、类黄酮、植物酸、转化糖、果胶。14.实施例黑“可霍喜”，原植物升麻(Cimicifuga racemosa)黑“可霍喜”是一种以干燥的根茎或根入药的药物。它属于毛茛科的植物。它生长在从Ontario至Tennessee以及远至西部的Missouri的可伐林中和茂密森林的边缘处。传统上将黑“可霍喜”用于治疗痛经、消化不良和风湿病。
14.2 商品提供者/产品名称有许多黑“可霍喜”的商品提供者。拥有主要产权的产品之一是Shaper和Brummer(Salzgitter，德国)的RemifeminTM。另一种欧洲产品称作KlimadynonTM(Jarry等，1995，Phytopharnaka Forsch.Klin.Anwend.-研论会科研报告集pp.99-112)。此外，仅作为WildAppalachian Black Cohosh Root ExtractTM销售的产品购自MurdockMadaus Schwabe(Springville，Utah)。
14.3 临床适应症德国Commision E Monograph记载了该药物治疗经前期不适和痛经的用途。一般以代茶饮、煎剂或以溶于乙醇中的酊剂的形式进行给药，每日剂量为40-200mg。黑“可霍喜”的临床适应症是经前期综合征、痛经、消化不良、风湿病、咽喉炎、支气管炎、起安神作用并作为一种月经周期调节剂。在一种临床研究中，发现它的乙醇提取物可导致选择性地降低垂体促黄体素(LH)的血清浓度(Bradley编辑的《英国草药概要》(British Herbal Compendium)第1卷，英国草药协会Dorset，英国，1992)。
14.4. 级分分析如上述元宝草部分中所述，使用反相HPLC进行黑“可霍喜”的级分(clinical)分析。
14.5. 生物活性分析用于经前期综合征临床适应症的主要生物检测试验是雌激素受体结合检测试验、促黄体素检测试验、FSH生物检测试验和催产素生物检测试验。
14.5.1. 雌激素受体使用几种雌激素试验法来测定体外结合的总物质级分和黑“可霍喜”的成分。一种试验是两种冷冻的小牛子宫雌激素受体结合试验。第二种试验是体外雌激素拮抗作用试验。第三种试验是鼠子宫雌激素受体模型试验。
对一组来自5个ICR、体重为13±1g、未发育成熟的雌性小鼠连续口服给予黑“可霍喜”(cohash)提取物和级分3天并在达到最终剂量后立即用苯甲酸雌二醇攻击(3μg/kg，皮下给药)。在给予最终剂量后24小时处死动物并测定每只动物子宫的湿重。使雌二醇诱发的子宫重量增加降低了50％或更多(≥50)这一结果证明了雌激素拮抗剂的活性。(Hirotsu等，1986，Arzneim.-Forsch.38(11)1410-1416)。化合物 ED50mg/kg皮下*他莫昔芬 0.1×3
*表示使用的标准参照剂。
如Jarry等在1985年所述进行总黑“可霍喜”提取物、黑“可霍喜”级分和成分与鼠雌激素受体结合的试验(Jarry等，1985，《植物药》(Planta Med.)4316-319)。
14.5.2. 催产素受体拮抗剂试验使用从来自Long Evans、体重为275±25g并经脱颈椎处死的雌性鼠中获得的子宫剥离物。在32℃、1g拉力下将该组织放入装有磷酸缓中盐水(pH7.4)的10ml浴器中。按30μM加入黑“可霍喜”和级分。相对于对照组的2nM催产素反应来说，所记录的因非等渗而诱发的收缩在5分钟内达到50％以上，这一结果证明了可能存在催产素受体拮抗剂活性。在检测物质浓度下，如果没有观察到显著的激动剂活性，那么使催产素诱发的收缩反应降低50％以上的能力证明了催产素受体拮抗剂活性。(Pettibone等，1991，《药理学实验疗法杂志》(J.Pharmacol.Exp.Ther.)256304-308)。
激动剂(#45900) EC50(μM
表示使用的标准参照剂14.5.3. LH降低试验如Jarry和Harnischfeger在1985年所述进行促黄体素(LH)检测试验(Jarry和Harnischfeger，1985，《植物药》(Planta Med.)146-49)。
14.6. 化学分析黑“可霍喜”中的成分包括甾类三萜(actein、升麻环氧醇苷(cimigoside)、27-deoxyactein、升麻素、单宁和生物碱)。在黑“可霍喜”中还存在异黄酮、包括forononetins。较少的成分还包括异阿魏酸和水杨酸。使用HPLC来分析它们。
15. 实施例春黄菊，原植物母菊(matricharia recutita)15.1 植物来源/背景技术药物春黄菊由德国春黄菊(母菊)的干燥头状花序组成。还有一种从不同于德国春黄菊的果香菊(Chamaelum noble)中获得的罗马春黄菊。在英国大量使用的是罗马春黄菊。在德国医疗专著中，还将春黄菊制剂用于治疗胃肠痉挛和胃肠道炎症疾病。使用的是典型的产品。
15.2 商品提供者/产品名称有许多春黄菊的商品提供者。拥有主要产权的产品之一是AstaMedica Ag提供的KamillosanTM(Frankfurt am Main，德国)。春黄菊的干燥提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)并符合含有1％总5，7，4’-三羟基黄酮和0.5％芳香油的标准。此外，仅在GermanChamomile FlowersTM下销售的产品购自Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)。
15.3 临床适应症春黄菊有许多临床适应症。主要用途是用作治疗GI痛苦的抗痉挛药和皮肤科的抗炎药剂。其它适应症包括治疗普通感冒、消化不良疾病、痤疮、口腔炎症和愈合创伤。据报导春黄菊具有杀细菌和杀真菌活性。一般来说，输注1或2克花或1至4毫升酊剂可治疗胃肠痉挛。传统用途包括治疗治疗胆酸过多、腹泻、消化不良、失眠、婴儿抽搐、牙痛、以及牙龈出血和肿胀。春黄菊抗微生物用途的一个实例是如美国专利5,244,885(Carle等)中所述的作为一种阴道冲洗液。
15.4 级分分析使用反相层析法、如与上述用于元宝草的类似方式进行春黄菊的级分分析。
15.5 生物活性分析有许多用于分析春黄菊生物活性的方式，包括酶检测法、组织培养测定法和共生生物体试验法。用于抗炎活性的酶检测法是环加氧酶-1和-2以及5-脂氧合酶的检测法。这些检测法如上述SawPalmetto部分中所述进行。
将肌痉挛组织培养测定法在分离的豚鼠回肠上进行。痉挛测定试验如Carle和Gomaa在1992年所述进行(Carle和Gomaa，1992，《当代药物》(Drygs of Today)28(8)559-565；Achterrath-Tuckermann等，1980，《植物药》(Planta Med.)3938)。还进行完整的动物试验，包括进入肥大细胞的Ca2+流量和小鼠耳皮炎以及鼠爪肿胀试验。小鼠耳部实验如下所述进行。
15.5.1. 小鼠耳部皮炎模型在对预先刮净的腹部表面施用噁唑酮(0.1ml的5％溶液)进行致敏作用前，对数组来源于5个ICR、体重为22±2g雄性小鼠腹膜内给予春黄菊提取物、油和级分(0.1、1、10和100mg/kg)，持续1小时。7天后，将噁唑酮(25μl的2％溶液)施用在右耳以攻击这些动物，将载体施用于左耳。24小时后，处死每只小鼠并用一种染色模型毫米标准尺测量耳的厚度。治疗组比用载体处理的对照组显著增加了30％或更多(≥30)且这证明了可能的免疫刺激活性。(Griswold等，1974，《细胞免疫学》(Cell Immunol.)11198-204)。
化合物 ED50mg/kg腹膜内
*表示使用的标准参照剂15.5.2 鼠爪肿胀试验如下所述进行鼠爪炎症实验。在对右后爪注射角叉菜胶(carageenan)(足底内给予0.1ml的1％悬浮液)前，给一组3个Long Evans、体重为150±20g的禁食过夜的雄性或雌性鼠口服给予春黄菊提取物、油和级分(100mg/kg)，持续1小时。给予角叉菜胶(carageenan)后3小时，后爪水肿减小达30％或更多(≥30)，这证明了显著的抗急性炎症活性。(Winter等，1962，《生物医学实验协会学报》(Proc.Soc.Exper.Biol.Med.)111544-547)。
化合物 ED30mg/kg口服
*表示使用的标准参照剂BW 755C＝3-氨基-1-[3-(三氟甲基)苯基]-2-吡唑琳。
15.6 化学分析使用HPLC进行化学分析。
成分包括α-红没药醇、红没药醇氧化物a和b、以及母菊薁。成分还包括类黄酮，诸如芹菜素(epigenin)、木犀草素(leutolin)、杨梅苷(myrricitin)、芹菜素(epigenin)7葡糖苷和erutin。
16. CHASTE TREE，原植物穗花牡荆16.1 植物来源/背景技术chaste tree浆果来源于Vitax agnus cultus1灌木的果实，它是一种生长在西亚和西北欧的小树并且还广泛分布在北美。使用chaste tree治疗月经疾病已经超过了2,000年，并且将它以20mg干果剂量的粉状果实的乙醇提取物的形式进行给药或作为煎剂的形式进行给药、每日剂量为30-40mg果实。
16.2 商品提供者/产品名称有许多穗花牡荆的商品提供者。一些产品是Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)提供的FemaprinTM；Madaus A.G.(科隆，德国)提供的AgnolytTM；和StrotanTM胶囊(汉堡，德国)。提取物还购自BionoricaTM(德国)。Femaprin-VitexTM胶囊剂(0.15％agnuside)通过Nature’s Way获得。
16.3 临床适应症chaste tree的临床用途有很多，包括对PMS综合征进行减毒和调节月经周期、抗感染活性和增加泌乳。公知的是有助于治疗乳腺痛和绝经症状并治疗泌乳不足。还将它用作抗痉挛药。
16.4 级分分析按照与上述Saw Palmetto类似的方式进行chaste tree的级分分析。用硅胶色谱法进行分级分离，用己烷展开且趋向于使用更为极性的溶剂、诸如乙酸乙酯。另一方面，使用一种C-18柱进行反相RP色谱法且使用乙腈-水作为溶剂系统。
16.5 生物活性分析chaste tree提取物、chaste tree浆果、chaste tree级分和特殊化合物的生物分析基于应用下列试验分析多巴胺拮抗剂活性、测定催乳激素分泌的抑制情况、增加促黄体素(LH)、减少促滤泡激素。已经证实chaste tree提取物具有抗微生物活性。
主要的检测试验是来自鼠垂体细胞的催乳激素分泌抑制情况的试验。(Sliutz等，1993，《激素代谢研究》(Horm.Motab.Res.)25253-255)。在这种检测试验中，对应用新近收集的鼠垂体的细胞培养物系统进行催乳激素释放的检测，以甲状腺素释放激素(TRH)作为阳性对照。其它工作者已经发现它在一种检测试验中的活性。
如上述黑“可霍喜”实施例中所述进行促黄体素(LH)的检测试验(Jarry等，1985)。
16.6 化学分析使用GC-MS或HPLC进行化学分析。使用公开的方法(Zwaving和Bos，1996，《植物药》(Planta Med.)6283-84)进行chastetree成分的GC-MS分析。
chaste tree的成分包括苎烯、桉树脑、桧萜、类黄酮、brantin和异牡荆黄素。
17. 实施例板栗-马栗，原植物齿栗，马栗树(Castanea dentata，Aesculus hippocastanum)17.1 植物来源/背景技术马粟是七叶树属树的果实，它生长有75英尺高并且常见于整个美国和欧洲。当外壳干燥时，坚果脱落。马粟是市售可得的，它由许多用途，包括治疗静脉曲张和痔疮。
17.2 商品提供者/产品名称由许多马栗的商品提供者。拥有主要产权的产品之一是由KlingePharma(慕尼黑，德国)提供的Venostasin retardTM。马粟的新鲜成熟种子的液体草药提取物购自Herb Pharm(Williams，Oregon)-这种提取物含有58-64％的乙醇和蒸馏水。马栗干燥提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)且符合含有以七叶素计算的20％三萜皂草苷的标准。此外，一种粉状提取物(最低含有20％七叶素)购自Znellig Botanicals(德国)的子公司Botanicals International，Inc.。
17.3 临床适应症马栗的临床适应症如下静脉缺血、痔疮、静脉曲张、湿疹、痛经和静脉炎。使用市售可得的马栗提取物VenostasinTM对22个病人进行一种临床研究。他们发现VenostasinTM通过降低毛细管通透性而对水肿形成有抑制作用(Bisler等，1986，Dtsh.Med.Wochenschr.111(35)1321-1329)。
另一种研究报导在绝经的妇女中促性腺的素释放增加。Duker等在1990年报导RemifeminTM(一种马粟的乙醇提取物)可减少促黄体素(LH)的分泌。在该研究中，在服用该提取物的病人中，LH水平、而不是FSH水平显著降低。马栗提取物对患有慢性静脉缺血的病人特别有效(Hitzenberger，1989，Wien.Med.Wochenschr.，139(17)1385；Diehm等，1992，《脉管》(Vasa)21188)。
17.4 级分分析有几种进行马栗提取物级分分析的方式。使用诸如丙酮这样的溶剂且趋向于使用诸如甲醇这样的更为有效的溶剂进行硅胶(get)层析。另一方面，可以使用乙腈和水作为溶剂系统进行反相层析。其它工作者还报导在SephadexTMLH-20柱上使用甲醇作为洗脱液进行成分的分离(Duker等，1991，《植物药》(Planta Med.)57420-424)。
17.5 生物活性分析用各种方式分析马栗提取物、级分和特异性化学标记物的成分，包括使用自发激活的鼠门静脉模型、分离的狗静脉模型、和鼠体内的淋巴水肿模型。马栗提取物级分在特殊化合物中的抗炎活性通过交叉胶水肿诱发的鼠模型和上述抗炎试验法、即环加氧酶-1和环加氧酶-2以及5-磷脂合酶模型来测定。
使用下列过程进行门静脉模型试验17.5.1 自发激活的门静脉使用从来源于Long Evans、体重为275±25g并通过脱颈椎颈处死的雄性或雌性鼠中获得的环状门静脉。在2g拉力下将该组织放入装有磷酸缓冲盐水(pH7.4)的10ml、32℃的浴器中并使其自发地发生肌收缩。当30μM的马栗粉、种子或级分以非等渗而诱发所记录的舒张在5分钟内达50％以上时，证明有显著活性(Hamilton等，1986，《药理学杂志概要》(Br.J.Pharmacol.)88103-111)。
激动剂 EC50(μM)Cromokalim 0.17*吡那地尔0.84*表示使用的标准参照剂使用公开的方法进行狗静脉模型试验(Guillaume和Padioleau，1994，Arzneimittleforschung4425-35)。
使用雌激素受体检测法分析马栗的甾类成分的抗炎活性，该检测法可确定[3H]雌二醇与雌激素受体结合的调制情况。使用标准技术、在改性的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中制备来自冷冻小牛子宫的胞质溶胶。在4℃下，用1.5nM[3H]雌二醇将100μg等份的胞质溶胶蛋白培养14-16小时。在有5.8μM己烯雌酚存在的情况下估计非特异性结合程度。通过吸附葡聚糖包裹的活性炭从游离的放射配体中分离结合的[3H]雌二醇。在低速离心后，从上清液中取出等份样品并进行计算以确定特异性结合的[3H]雌二醇。以假设的平均分子量200为基准，在10μM下筛选马栗样品。(McGuire等编辑《人体乳腺癌中的雌激素受体》(Estrogen Receproes in Human Breast Cancer)，Raven出版社，纽约，1975)。
检测参考数据Kd0.06nMBmax 42fmol/mg蛋白质特异性结合75％化合物 IC50(nM) Kd(nM)nH*己烯雌酚 0.650.025 1.017-α-雌二醇 1.1 0.041 0.7炔雌醇 0.0810.003 1.1*表示使用的标准参照剂使用上述春黄菊部分中所述技术方案后，使用鼠爪湿疹模型进行分析。另一方面，使用公开的技术方案(Duker，1991，《植物药》(PlantaMed.)57420-424；Senatore，1989，Boll.Soc.It.Biol.Sper.65(2137-141))。
17.6 化学分析使用HPLC进行化学分析。成分包括deic acid、酚酸、香豆素、环多醇、七叶素(aesain)、皂草苷、各种三萜(triterpens)、各种类黄酮、polypreinoids、单萜(monoterpines)、脂类和碳水化合物。
18. 实施例紫松果菊，原植物ECHINACEA ANGLUSTIFOLIA和紫松果菊(PURPUREA)18.1 植物来源/
背景技术：
一般每天给予900mg剂量的紫松果菊。通常以用50％乙醇制备的酊剂剂型进行给药。可以以片剂或胶囊的形式给予紫松果菊且剂量为每日1g、分三次。紫松果菊已经由德国Commision E Monograph批准(B Anz.No.162，批准日为1992年8月29日)。
通常称作紫色矢车菊的Echinacea angustifolia是炎症来源于北美的植物。当地的美国居民已经使用从这种植物得到的提取物来愈合创伤(作为抗菌素使用)并将它作为一种抗炎药剂。德国政府已经批准将从这种植物的叶和根所压榨的新鲜汁液用于治疗呼吸道和尿道的继发感染。已经证实当口服或非肠道给予紫松果菊液体制剂时，它具有免疫刺激活性。认为激活脾细胞可帮助该提取物提高粒细胞和噬细胞活性的这种能力。
为了按照本发明进行指纹图谱鉴定，在低于-100℃下将植物的绿叶和根进行切制并冷冻。然后将混合物磨碎并用一种公知体积的水进行提取。这一过程会更好地保留成分的最大含量。这些成分是挥发油、苷、酰胺和多炔的混合物。
18.2 商品提供者/产品名称紫松果菊是最易普遍得到的植物产品之一。
拥有主要产权的产品之一是EchinacinTM，由Madaus AG(科隆，德国)提供，且一种类似的产品是在美国销售的EchinaguardTM，由Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)提供。
此外，Echinacea angustifolia的粉状提取物(最少4-5％echinoside)可购自Zuellig Botanicals(德国)的子公司Botanicals International，Inc.。其它的供应商包括Trout LakeFarm、PhytoPharmica、Herbal Choice-Boatalia、Shaklee、BotaliaGold、Nature’s Herb，、Nature’s Way、Florg Laboratiories和Herb Pharm.。
18.3 临床适应症紫松果菊的临床适应症有很多。主要用途是增加上呼吸道对感染、感冒等的抵抗能力。其它用途是愈合表浅的创伤、治疗尿道或呼吸道的继发感染、单纯疱疹、抗炎活性和抗菌活性。
18.4 级分分析如上述槲寄生实验中所述、使用SephadexTM色谱法进行级分分析。另一方面，还可以使用反相C-18色谱法或GPC色谱法。紫松果菊中有两种主要类型的生物活性成分，用氯仿提取的是非极性物质且存在于乙醇或水级分中的是极性成分。非极性亲脂成分包括如Bauer和Foster所述的各种阴离子成分(Bauer和Foster，1989，《植物药》(Planta Med.)57447-449)。极性成分包括烷基酰胺和多糖(Bauer和Remiget，1989，《植物药》55367-371；Steinmuller等，1993，《免疫药理学杂志》(Immunopharmacol.)15(5)605-614)。
18.5 生物活性分析用一种测定[125I]肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与人体TNF-α受体结合的调节程度的检测试验来分析紫松果菊总提取物和级分的生物活性。使用标准技术、将U-937(人体组织细胞淋巴瘤)细胞用于在改性的Tris HCl缓冲液(pH7.4)中制备膜。在4℃下，用62pM[125I]TNF-α将200μg的等份样品培养3小时。在有50nM TNF-α存在的情况下估计非特异性结合程度。将膜过滤并洗涤3次，统计滤过物以测定特异性结合的[125I]TNF-α程度。在10μM下筛选混合物。(Maloff和Delmendo，1991，《药剂和作用》(Agents and Actions)3432-34)。
试验参考数据Kd37pMBmax 11pM mg蛋白质特异性结合65％化合物 IC50(nM) Ki(nM) nH


*表示使用的标准参照剂紫松果菊的另一种临床适应症是使用其抗炎活性。使用不同的方法来分析这种抗炎活性。所用的三种体外试验包括环加氧酶-1、环加氧酶-2和脂氧合酶试验，如上述Saw Palmetro部分中所述。另一方面，在进行Wagner等在1989年所述的方法(《植物药》(Planta Med.)55566-567)后可以分析花生四烯酸酯的代谢物。另一方面，如春黄菊部分或如文献中的制备方法(Tragni等，1985，《化学药物毒理学》(Chem.Toxic.)23(2)317-319)中所述进行体内试验、诸如鼠爪试验或小鼠耳部试验。
在下面的附图3中所列的程序后，将提取物分离成基本类型的成分。将每种类型的分离成分进行两类生物检测试验(与原始提取物一起)。第一种检测试验测定C57BL/6小鼠体内脾细胞的激活程度。用P815Y淋巴瘤使小鼠致敏并用不同剂量的无菌提取物或特殊成分处理小鼠。接种淋巴瘤细胞11天后，收集脾并将脾细胞用于攻击载有51Cr的P815Y淋巴瘤细胞。具有放射性的51Cr从肿瘤细胞释放这一过程可产生一定量(放射量)激活的脾细胞(试验系统)。
使用生长的大肠杆菌的浊度作为其生长的度量标准，将用于第二种临床适应症的生物检测试验(抗菌活性)在大肠杆菌培养基中进行。在给定的试验提取物或其成分存在的情况下，缺乏浊度表明具有抗菌活性。
18.5.1 激活巨噬细胞的生物检测试验紫松果菊提取物及其多糖可以刺激巨噬细胞的活性。在实验体系中，通过腹膜内给小鼠注射2-3ml、2％的淀粉或硫代甘醇酸酯可以得到巨噬细胞。4-5天后，用腹膜内注射5ml PBS的方法来收集小鼠腹膜细胞。用注射器抽去缓冲液，将采集的细胞通过离心进行收集，并37℃、含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行培养。1小时后，弃去未附着的细胞并将剩余的细胞用于检测。用不同浓度的紫松果菊提取物和紫松果菊级分在培养基中处理巨噬细胞，而由抗作为靶向物的载有51Cr的P815细胞的细胞毒性来确定激活程度(Stimpel等，《感染与免疫》(Infection and Imminity)46845-849)。
18.6 HPLC、GPC化学分析通过GC、GC/MS或HPLC技术将最与生物活性相关的成分(例如，类萜)分离成用于按照本发明提供指纹图谱的各个成分。
在氢化醇的制备过程中，发现了下列化合物海胆苷、阿拉伯半乳聚糖、杂木聚糖(活性由异丁基酰胺、菊苣酸强化)。使用公开的方法(Bauer和Foster，1991；Bauer和Reminger，1989；Bauer等，1989，Zeit.fur.Phytotherapia1043-48)进行紫松果菊化学活性成分的具体分析。
19. 实施例晚樱，原植物月见草(OENOTHERA BLENNIS)19.1 植物来源/背景技术药物晚樱是从种子中压榨出的油。它生长在北美地区而广泛适合生长在任何地区，且它属于晚樱科的植物。种子含有约14％含量的油，油中有顺式亚油酸(50-70％)。其次最普遍存在的成分是β-亚油酸(GLA)。认为主要活性成分是β-亚油酸(GLA)。对于GLA另外的治疗用途来说，每天给予600-6,000mg的剂量可以治疗异位性湿疹。剂量为每天服用250mg的胶囊两次。
19.2 商品提供者/产品名称有许多晚樱油的商品提供者。一种众所周知的产品称作EfamolTM或Evening Primose OilTM，由Scotia Holdings(Kentville，NovaScotia，加拿大)的子公司Efamol Research Inc.提供。另一种称作Health的产品是Sun Evening Primrose OilTM胶囊，由加拿大PGE提供(Saskatoon，Saskatchewan，加拿大)-用“不含己烷的提取法”制成。另外，EPO产品是EpogamTM和GammaoilTM。(Morse等，1989，《英国皮肤病学杂志》(Br.J.of Dermatology)12175-90)，通过美国健康协会得到Royal Brittany Evening Primrose0ilTM。
19.3 临床适应症应用晚樱治疗的临床适应症有许多，包括心血管疾病、癌症、类风湿性关节炎、经前期综合征、多发性硬化、异位性湿疹和其它局部疾病。较次要的适应症包括糖尿病、酒精导致的肝病的保护剂、自身免疫疾病、儿童机能亢进、治疗慢性炎症、治疗酒精中毒、治疗急性酒精脱瘾综合征、寻常性鱼鳞癣、硬皮病、斯耶格伦综合征、Sicca综合征、脆甲、乳腺痛、精神病综合征、迟发性运动障碍、溃疡性结肠炎、偏头痛和肝癌。所关注的主要临床适应症是治疗湿疹(Bordoni等，1987，《药物临床实验研究》(Drugs Exptl.Clin.Res.)14(4)291-297)。认为对湿疹有疗效是由于GLA所导致的。可以认为前列腺素、特别是PGE1涉及调节T淋巴细胞且湿疹患者一般具有低PGE1水平。
其它工作者已经报导晚樱油可有效地缓解乳腺痛(mastagyna)或乳房疼痛(Gateley和Manesl，1991，《英国药物简报》(BritishMedical Bulletin)47(2)284-294)。此外，已经报导晚樱油对糖尿病的实验模型有效(Stevens等，1993，《前列腺素、Leucotrins和必需脂肪酸》(Prostalandins，Leucotrins and essential FattyAcids)49699-706)。最近，已经报导晚樱油可用作免疫抑制剂(美国专利3,993,775和4,058,594，发明人均为Williams)。
19.4 级分分析如上述Saw Palmetto实验中所述、通过闪蒸色谱法进行晚撄的级分分析。
19.5 生物活性分析用两种方式进行生物学分析。第一种方法用来研究血小板活化因子结合的程度。第二种方法是使用来自家兔的血研完血小板的聚集情况。如下所述进行分析。
19.5.1 血小板活化因子，血小板聚集将从来自New Zealand、体重为2.5±3kg的雄性或雌性白化体家兔中获得的静脉血与十分之一体积的柠檬酸三钠(0.13M)混合并将220g样品在室温下离心10分钟。经分析，与37℃下由旋光聚集计量器测定的5nM血小板活化因子-acether(PAF-acether)相比，30μM的晚樱油和级分对上清液中血小板丰富的血浆诱发的聚集在5分钟内达到50％以上；诱发的聚集＞50％这一结果证明了可能存在PAF受体激动剂活性。在样品浓度下，如果没有观察到显著的激动剂活性，那么降低大于50％的PAF-acether诱发的最大不可逆聚集反应的能力这一结果证明了PAF受体的拮抗剂活性(Nunez等，1986，《欧洲药理学杂志》(Eur.J.Pharmacol)123197-205)。
激动剂(#46300) EC50(μM)

拮抗剂(#46301) EC50(μM

*表示使用的标准参照剂CGS-12970＝3-甲基-2-(3-吡啶基)-1H-吲哚-1-辛酸；CV-3988＝3-(4-羟基-7-甲氧基-10氧代-3，5，9-三噁-11-吖-4-磷杂二十九烷-1-基)-噻唑啉；L-652731＝2R，5R-二(3，4，5-三甲氧基苯基)-四氢呋喃；L-659989＝焦-2-氨基己二酰-组氨酰基-噻唑烷-4-羧基酰胺；WEB-2086＝3-(4-[2-氯苯基]-9-甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]-均三唑并-[4，3-a][1，4]-二氮杂草-2-基)1-(4-吗啉基)-1-丙烷。
19.5.2 血小板活化因子在本检测试验中，通过测定[3H]血小板活化因子(PAF)与PAF受体的结合程度来分析晚樱油和级分。使用标准技术、在改性的Tris-HCL缓冲液(pH7.5)中准备来自New Zealand、体重为2.5±3kg的雄性或雌性白化体家兔的血小板。在25℃下，用0.4nM[3H]PAF将50μg等份的膜培养60分钟。在有1μM PAF存在的情况下估计非特异性结合的程度。将膜过滤并洗涤3次，统计滤过物以测定特异性结合的[3H]PAF。在10μM下筛选样品。(Hwang等，1983，《生物化学》(Biochemistry)224756-4763)。
试验参考数据
Kd0.73nMBmax 4.6pmol/mg蛋白质特异性结合 93％化合物 IC50(μM) Ki(μM) nH*PAF 95.81.0WEB-2086 110710.8*表示使用的标准参照剂。
WEB-2086＝3-(4-[2-氯苯基]-9-甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]-均三唑并-[3，3-a][1，4]-二氯杂草-2-基)1-(4-吗啉基)-1-丙烷。
如上述芦荟部分中所述、使用前列腺素类FT检测法可以研究晚樱油的免疫活性。
19.6 化学分析使用用于亚油酸和其它必需脂肪酸的HPLC进行化学分析(Cisowski等，1993，《植物疗法》(Phytoterapia)64(2)155-162)。如上述Saw Palmetto实验中所述分析化学成分。
主要成分是必需脂肪酸、β-亚油酸、顺式亚油酸。
20. 实施例小白菊，原植物菊蒿(Tanacetum parthenium)20.1 植物来源/背景技术小白菊是来源于菊科的植物。它生长在欧洲、而目前在北美和南美均有生长。一般将该草药的干燥叶制成片剂或胶囊剂的形式来进行给药。一般的平均日剂量为125mg叶，叶中小白菊内酯(parthenolid)的最低含量为0.2％。
20.2 商品提供者/产品名称有许多小白菊的商品提供者。在美国拥有主要产权的产品之一是称作MygrafewTM的产品，由Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)提供。此外，一种小白菊草药的粉状提取物购自ZuelligBotanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International以及Natural Factors Nutritional Products，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)。Herbal Choice-Botalia、Herb Pharm、Nature’s Way、Herbal Harvest、Botalia Gold和HerbalLaboratories也提供小白菊。
20.3 临床适应症小白菊的临床适应症有偏头痛(局部)、湿疹、缓解痛经、哮喘、关节炎、传染病、视力疾病、疲倦和对光敏感。它治疗偏头痛的主要用途已经由法国和加拿大批准。加拿大官方已经批准标为“用作一种抗偏头痛的预防药”的专利。加拿大产品要求它含有0.2％的小白菊内酯(parthenolid)(Awang，1987，《药物杂志》(PharmaceuticalJoural)239487)。
还对小白菊进行了以治疗关节炎为主题的临床研究(Pattrick等，1989，《风湿性疾病年鉴》(Annals of Rheumatic Disease)，48547-549)。该研究发现在对照组与服用小白菊的组之间没有显著性差异，而在研究开始前所有病人均带有“无法充分控制的关节炎症综合征”且没有良好的反应。作者还注意到小白菊可能有助于治疗骨关节炎或软组织损伤。可以通过局部施用小白菊乙醇酊剂来治疗湿疹。
20.4 级分分析如上述元宝草部分中所述、使用反相色谱法来进行小白菊提取物的级分分析。
20.5 生物活性分析小白菊的生物学分析以上述提到的内容为基础，即抑制前列腺素合成、防止花生四烯酸形成、体外抑制血小板聚集和抑制5-羟色胺5HT1。如上述元宝草部分中所述进行5-羟色胺的检测试验。如上述晚樱部分中所述进行血小板聚集的检测试验。
还可以通过研究血小板和多形核白细胞中的颗粒分泌情况来分析小白菊提取物。通过既研究氯仿和甲醇提取物又研究水缓冲液提取物，发现小白菊可一贯地抑制血小板聚集而不抑制血栓烷合成。
20.6 化学分析如上述元宝草部分中所述、使用HPLC来进行化学分析。
小白菊的主要化学成分是倍半萜、特别是小白菊内酯(parthenolid)(0.12-1.27％)。叶部含有下列倍半萜artecanin、canin、chrysanthemolide、chrysanthemonin、10-表-canin、1β-hydroxyarbusculin、8β-hydroxyreynosin、3β-羟基小白菊内酯、magnoliolide、小白菊内酯(达到倍半萜含量的85％)、reynosin、裂叶苣荚菜内酯、secotanapartholide A、tanaparthin、tanaparthin-1α、4α-环氧化物、tanaparthin-1β、4β-环氧化物(Leung和Foster，1996)。
21. 实施例大蒜，原植物大蒜(Allium satiyum)21.1 植物来源/背景技术大蒜是百合科植物大蒜干燥或新鲜的鳞茎，它生长在世界各地并且已经有5,000年以上的栽培史。从大蒜中也可以得到芳香油。
21.2 商品提供者/产品名称有许多大蒜的商品提供者。一些主要产品是由WakanugaPharmaceutical Co.，Ltd.(Osaka，日本-Mission Viejo，Ca的子公司)提供的KyolicTM大蒜胶囊和由Enzymatic Therapy(Green Bay，Wisconsin)提供的Garlinase4000TM。大蒜粉的片剂购自LichtwerPharma，GmbH(德国)且大蒜胶囊购自Natural Factors NutritionalProducts，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)。Shaklee、Herbal Choice-Botalia、Nature’s Way、Sunsource、PhytoPharmica、Lichtwer、Bayer Consumer也提供大蒜。
21.3 临床适应症大蒜有许多临床活性。大蒜具有的许多活性包括抗菌、抗真菌、抗血栓和降血压活性。它还可以激活纤维蛋白溶解作用并是一种抗炎药。
还研究了大蒜治疗高血压、动脉硬化(atherosclerosos)、低血糖、消化失调、感冒、流感、支气管炎和降低血胆固醇和甘油三酯的活性(Foster，1991，“大蒜植物大蒜”，美国植物药审定委员会植物药系列311Austin Texas，Pg.1-7)。已经用鼠模型研究了它的抗低血糖症的活性(Kamanna和Chandrasekhar，1984，《印度药物研究杂志》(Indian，Med. Res.)79580-583)。此处仅在芳香油级分中观察到了大蒜抗低胆固醇血的活性。其它工作者在临床研究中报导大蒜可以减少血小板的聚集(Kiesewetter等，1991，《国际临床药物杂志》(Int J.Clin.Pharm.)29(4)151-155)。在本研究中病人服用800mg大蒜粉(4片200mg的片剂，LichtwerPharma，GmbH)。
21.4 级分分析使用超临界CO2色谱法或反相色谱法进行大蒜的级分分析。
使用带有5％苯基(pheny)甲基聚硅氧烷(poysiloxane)柱的SFC-FSETM等级的C2(Air Products and Chemicals Inc.；Allentown，PA)进行色谱法分析。
21.5 为测定胆固醇分泌而进行的血小板聚集、PAF、纤维蛋白溶解作用、肝细胞的生物活性分析如上述晚樱部分中所述、使用血小板活化因子测定法和血小板聚集测定法来进行大蒜的生物学分析。
21.6 GC-MS，HPLC的化学分析大蒜中的化学成分包括蒜氨酸、ajoenes和各种其它的含硫化合物。使用GC-MS或HPLC进行分析。使用公开的方法进行HPLC分析(Iberl等，1990，《植物药》(Planta Med.)56320-326)。还使用超临界流体色谱法-质谱法进行大蒜的化学分析(Calvey等，1994)。
大蒜含有0.1-0.36％(通常约为0.2％)的挥发油、蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜)、S-甲基-L-半胱氨酸亚砜、酶(例如，蒜氨酸酶、过氧化物酶、和硫葡萄糖苷酶)、ajoenes(E，Z-ajoene，E，Z，-methylajoene，和dimethylajoene)、蛋白质(16.8％，以干重为基准)、矿物、维生素(硫胺素、核黄素、烟酸等)、脂类、氨基酸、及其它。
挥发油含有蒜素(二硫化二烯丙基-S-氧化物；二烯丙基硫代亚磺酸酯)、烯丙基丙基二硫化物、二烯丙基二硫化物和二烯丙基三硫化物作为主要成分以及较小量的二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、烯丙基甲基硫化物、2，3，4-三噻戊烷和其它相关的硫化合物。其它存在的挥发性化合物包括柠檬醛、香叶醛、里那醇、以及α-和β-水芹烯。近来从均匀的大蒜提取物中分离出了前列腺素A2和F1a(Leung和Foster，1996)。
22. 实施例银杏，原植物银杏(Ginkgo bilboa)22.1 植物来源/
背景技术：
口服和静脉内剂型银杏是来源于植物银杏的干燥叶，它属于银杏科的植物。已经报导了银杏的传统用途是用作抗疟药、抗菌药、止血药、利尿药和补药。
22.2 商品提供者/产品名称银杏制剂可以从最普遍的植物产品中得到。由IPSEN研究室(巴黎，法国)提供的Egb761是一种在TeboninTM、TanakanTM和RokanTM的商品名下销售的商品提取物，并且已经广泛用于欧洲的各种临床实验。另一种由IPSEN提供的银杏提取物(LI1370)在Kaveri的商品名下销售。银杏的干燥提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)并且符合含有24％总银杏黄酮糖苷(ginkgoflavonglycosides)、6％银杏苦内酯和白果内酯的标准。该提取物还购自Natural FactorsNutritional Products，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)、Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)以及ZuelligBotanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International、Herbal Choice-Botalia、Thompson Nutritional、Hudson、NaturaLife、Botalia Gold、Nature’s Resource、Herb Pharm、PhytoPharmica、Nature’s Way、TeboninTM(Schwabe，德国)、RokanTM(Intersan，德国)和PhytoPharmica。
22.3 临床适应症银杏的日剂量为120-160mg的标准化叶提取物。也将它用于下列情况，包括粘膜炎症、痔疮、鼻充血、齿龈溃疡、眼疮、创伤、溃疡、痤疮、脂溢性皮炎和癣菌病。还将它用于治疗癌症。
近来已经总结了银杏的临床用途(Cleijen和Knipchild，1992，《柳叶刀》(Lancet)3401136-1139)。一种主要的适应症是增加血流量。特别是增加脑血流量。已经报导银杏可用于治疗耳鸣、外周血管疾病、间歇性跛行、有效气量减少和不眠症(脑循环障碍)、视网膜病、记忆缺损、头昏、眩晕。在专利文献中已经报导了有效成分的组成和用途(在美国专利5,246,216中，Bombardelli等报导了作为一种抗感染药的用途、特别是用于治疗卡氏肺囊虫，且在美国专利5,202,313中，Bombardelli等报导了银杏中的白果内酯衍生物)。
22.4 级分分析因为化学成分是黄酮醇(flaviniols)、黄酮、倍半萜、双萜、单萜、银杏苦内酯及其碳水化合物衍生物，所以在C18液体色谱系统上进行级分分析。
22.5 生物活性分析银杏起自由基清除剂的作用、抑制血小板活化因子(PAF)、导致EEG改变、降低毛细管的脆性并增加血流量。
使用血小板活化因子测定法、测定自由基清除剂和血流量增加的测定法来分析银杏提取物和银杏级分的生物活性。
如上述晚樱部分中所述、使用血小板活化因子测定法来分析银杏级分、提取物和原料。
22.6 化学分析使用GC-MS和HPLC来进行银杏的化学分析。主要成分是黄酮醇和黄酮(大部分是五羟黄酮和莰非醇)的苷、白果内酯(倍半萜)、异银杏黄素、银杏苦内酯(ginkolide)A，B，C，M和J(单萜内酯衍生物)、6-羟基犬尿喹啉酸、莽草酸、原儿茶酸、香草酸、对羟基苯甲酸、原花青素(proanthrocyanidines)、葡萄糖苷、生物类黄酮、sciopitysin、银杏黄素、白果黄素和银杏酚酸。
23. 实施例人参(亚洲)，原植物人参(Panax Ginseng)23.1 植物来源/背景技术人参是亚洲人参或美洲人参的干燥根，它们均属于五加科的植物。它是稀有和野生的植物，而在中国和韩国是广泛栽培的。
23.2 商品提供者/产品名称可以证明人参是可以从世界各地得到的最普遍的植物产品。一些产品是由Murdock Madaus Schwabe(Springville，犹他)提供的GinsunTM、由Enzymatic Therapy(Green Bay，Wisconsin)提供的GS-500TM和由Natural Factors Nutritional Products.Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)提供的GinsengSoftgelsTM。粉状人参提取物购自Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International。人参干燥提取物IDB购自Indena s.a.(米兰，意大利)且符合含有7％人参皂甙的标准。也可以通过下列公司得到人参Shaklee、Lichtwer、Sunsource、Nature’s Resource、Herbal Choice-Botalia、Nature’s Way、NaturaLife、Herbal Harvest、Botalia Gold和PhytoPharmica。
23.3 临床适应症一般来说，人参在每日给予的人参合适制剂中的剂量为1-2g根。它已经是德国Commission E.Monograph No.11于1991年1月17日批准的研究对象。人参是一种各种成分的复杂混合物，包括对心血管和神经系统有不同作用的人参皂甙(Brekhman和Dardymov，1969，《药理学回顾年鉴》(Ann.Rev.Pharmacol.)9419-430)。它在心血管系统中表现出不同的活性(Kaku等，1975，Arzneim.Forsch.25539-547)。
人参还表现出抗癌活性。一种研究报导它可防止所培养的细胞受到电离辐射(Benhur和Fulder，1981，《美国中药杂志》(Am.J.Chinese Med.)9(1)48-56)。其中，他们报导人参在细胞培养物中具有增加的抗电离辐射的能力。其它工作者已经报导了它作为一种抗辐射药在小鼠体内的活性(Yonezaw，1976，《辐射研究杂志》(Radition Res.)17111)。
其它工作者还报导了人参对各种中枢神经系统的作用。(Petkov，1959，Arzneim.Forsch.(《药物研究》(Drug Res.))9305-311)。已经证实人参可以延缓痉挛的发作并延长苯巴比妥的睡眠时间。它还可以便禁食鼠的睡眠和失眠周期保持稳定(Lee等，1990，《神经科学简报》(Neurosci.Let.)111217)。
23.4 级分分析使用上述方法、在应用C-18柱的反相(RP)柱上以乙腈水作梯度洗脱液进行级分分析。
23.5 生物学分析用一种研究PC12细胞活化的检测试验进行人参在临床上缓解紧张疾病的生物学分析。接下来的过程如文献中所述(Mohri等，1992，《植物药》(Planta Med.)58321-323)。他们报导人参的亲脂成分能够在他们准备的模型中激活神经元细胞。
23.6 抑郁，丁苯喹嗪在注射丁苯喹嗪甲磺酸盐(100mg/kg，腹膜内)30分钟后，对一组来自3个ICR、体重为22±2g的小鼠口服给予人参、人参提取物和级分(30mg/kg)，并且在60分钟后记录体温。认为丁苯喹嗪诱发的降温反应降到50％或更多(≥50)是显著的且可以证明抗抑郁活性。(Gylys等，1963，《纽约科学院年鉴》(Annals N.Y.Acad.Sci.)107899-913)。
化合物 ED50mg/kg口服

果胶、自由糖、生物矿物(biomins)、多炔(polyacetylines)、多肽。日本研究人员称皂草苷(sappinins)为人参皂甙，而俄罗斯工作者称之为人参糖苷。在亚洲人参中至少发现了18种皂草苷(sappines)。它们均为三萜。已经报导了6种人参糖苷。还报导人参油含有sesquiterpeneuiturpines且至少有56种接近的相关皂草苷称作gynosaponins(Leung和Foster，1996)。
24. 白毛茛，原植物北美黄连(Hydrastis canadensis)24.1 植物来源/背景技术白毛茛是一种在美国Vermont和Arkansas的深部森林中发现的多年生植物。它属于毛茛科的植物。传统上使用其制剂的抗微生物、收敛和抗出血的活性。
24.2 商品提供者/产品名称有许多白毛茛的供应商。一些产品是由Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)提供的Wild Goldenseal RootTM胶囊和由Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司BotanicalsIhternational提供的Goldenseal Root Powdered ExtractTM，后者符合含有5％总生物碱和5％北关黄连碱的标淮。以含有5％北美黄连碱为标准的白毛茛提取物还购自Indena s.a.(米兰，意大利)。
24.3 临床适应症几乎还没有对白毛茛进行过临床研究。然而，它含有大量的小檗碱，小檗碱是抗菌和杀阿米巴的药剂。特别是，经常将它用于治疗粘膜炎症。在德国已经批准的的制剂名称为Gingivitol(将所批准药物的含量规定为含有1.5％至不低于2.5％的北美黄连碱)。
总剂量为0.5g干燥根或2ml-4ml的酊剂(1∶10，60％乙醇)，每日分3次(Bradley，1992)。
24.4 级分分析使用C-18反相(RP)色谱法或硅胶色谱法进行白毛茛的级分分析。条件如上所述。
24.5 MAO-A、5-羟色胺吸收的生物活性分析如催产素检测试验中所述进行白毛茛用于经前期综合征临床适应症的生物学分析，所述的催产素检测试验如上述黑“可霍喜”部分中所述。还可以使用元宝草部分中所述的MAO-A测定法和5-羟色胺吸收测定法来分析白毛茛。
由于白毛茛可在临床上用作漱口液，所以可以如上所述测定它的抗感染、抗菌的活性。
24.6 化学分析白毛茛含有活性组分，包括主要由北美黄连碱(1.5-4％)和小檗碱(0.5-6％)组成的异喹啉生物碱、以及较少量的副刀豆氨酸(四氢小檗碱)、坎那定(canadaline)、1-α-北美黄连碱、5-羟基四氢小檗碱和存在的其它相关的生物碱。其它成分包括袂康宁、绿原酸、带有75％不饱和和25％饱和脂肪酸的脂类、树脂、淀粉、糖、以及小量的挥发油(Leung和Foster，1996)。用TLC或HPLC来进行小檗碱的化学分析。生物活性成分包括小檗碱和北美黄连碱。这些成分主要是来自根茎和根部的异喹啉生物碱。
25. 实施例绿茶，原植物茶(Camellia sinensis)25.1 植物来源/背景技术茶叶绿茶来源于长有常绿叶的大树，它生长在广泛栽培它的东亚。将绿茶的干燥叶用于制备饮料已经有几千年。茶叶作为药用已经有数个世纪且在中国认为茶可以治疗癌症。
25.2 商品提供者/产品名称全世界有许多绿茶的供应商。绿茶粉提取物购自ZuelligBotanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International且符合含有15％鞣酸和3-10％咖啡因的标准。绿茶提取物还购自Indena s.a.(米兰，意大利)且符合含有80％多酚的标准。
25.3 临床适应症绿茶有许多临床用途，包括抗癌活性、降低胆固醇活性、血小板聚集活性和降低血液粘稠度的活性。绿茶还涉及延长寿命。一种主要用途是已报导的体外和体内的抗癌活性(Wang和Wu，IARC Sci.Publ.105546)。其它工作者已经报导绿茶可以改变诱变剂诱发的染色体畸变(Imanishi等，1991，《突变研究》((Mutat.Res.))259(1)79)。绿茶还涉及降低结肠癌的危害并抑制小肠癌的发生(Kono等，1991，《临床流行病学杂志》(J.Clin.Epidemiol)44(11)1255；Ito和Imaida，1992，《致癌物诱发的畸形形成》(TeratogenesisCarcineg.Mutagen)12(2)；79)。
绿茶还与降低总胆固醇水平有关(Kono等，1992，《预防医学》(Prev.Med.)21(4)526)。近来，绿茶还涉及延长日本妇女的寿命(Sadakata等，1992，Tohoku J.Exp.Med.166(4)475)。还证明绿茶是保护牙齿的预防药(Rosen等，1984，《牙科研究杂志》(J.Dent.Res.)63(5)658)。近来在公开的文献中记载了它的降低血液粘稠度的活性(Ali等，1990，《前列腺素、白三烯和必需脂肪酸》(Prostaglandins，Leukotrienes and Essential FatyAcids)40281-283)。
25.4 级分分析使用包括微分萃取法在内的各种不同的方法来进行绿茶的级分分析(国际公开号WO96/28178 Bombardelli等)。使用SephadexTMLH-20色谱法、应用公开的程序进行级分分析(Cattell和Nursten，1976，《植物化学》(Phyto Chemistry)151967-1976；Sagesaka-Mitane等，1990，《药物化学简报》(Chem.Pharm.Bull.)38(3)790-793)。另一方面，还使用硅胶或聚丙烯酰胺色谱法来进行级分分析(Chkhikvishvli，1985，《天然化合物化学》(Chem.Nat.Compounds)20(5)629-630)。
25.5 生物活性分析对于抗癌的临床适应症来说，有许多可以在体外和体内进行的生物检测试验。进行P450检测试验(Obermeier等，1990，Xenobiotica25(6)575-584)。在该项研究中，研究工作者研究了生物类黄酮在鼠和人肝微粒体中对肝P450活性的影响。另一方面，通过化学上的抗氧化剂活性来研究体外的抗癌活性(Tanizawa等，1984，《药物化学简报》(Chem.Pharm.Bull.)32(5)2011-2014)。另一方面，可以使用上述槲寄生部分中所述的L1210癌症模型。
25.6 化学分析使用HPLC、GPC或TLC来进行绿茶的化学分析。主要的生物活性成分属于下列化学种类生物碱、benzonoids、萜、倍半萜、二萜、单萜和碳水化合物。多数研究已经集中在儿茶素上(Goto等，1996，《层析杂志》(J.Chrom.)A749295-299)。如近来的公开出版物中所述进行绿茶的TLC分析(Minpeigen，1991，《植物药疗法研究》(Phytotherapy Res.)5239-240)。
26. 实施例山楂，原植物Crataegus laevigata26.1 植物来源/背景技术植物性药材山楂来源于Cratigus laevigata花的干燥叶片，该植物可在野生植物中采集、或来自欧洲的栽培品种。它还在中国和美国使用。山楂是蔷薇科的植物。
在传统的中药中，将山楂的果实用于助消化以促进胃的功能、促进血液循环并治疗各种胃部疾病。传统中药的用途还包括高血压、高血脂(hyperlipdemia)和冠心病。
26.2 商品提供者/产品名称有许多山楂的商品提供者。一些主要产品是由Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)提供的HeartcareTM和Wild EuropeanHawthornTM和由Natural Factors Nutritional Products，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)提供的山楂酊。山楂叶和花的粉状提取物购自Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International且符合含有1.8-2.8％牡荆葡基黄酮过氧化苷(hyperoside)的标准。
26.3 临床适应症在欧洲，将山楂的果实、花和叶的混合物用作收敛药、解痉药、强心剂、泻下药、降血压药和抗心律失常药。美洲印第安人还使用山楂治疗胃肠和循环疾病。
德国已经批准将山楂用于治疗心功能不全和缓慢性心律失常(德国Commission E Monograph B Anz 1，批准日为1989年1月3日)。山楂的临床用途还包括增强心肌功能、治疗心衰疾病、治疗轻度形式的心绞痛和节律障碍(dysrhythmia)以及降低血压(Occhiuto等，1986，《植物药》(Planta Med.)2052；Stepka和Winters，1973；Lloydia，36436)。临床研究已经报导它具有抗心律失常作用、增加心肌缺血后对隔绝氧气和换血管术刺激的心肌耐受性(Guendjv，1977，R.Arnzeim.Forch.271576)。
26.4 级分分析首先通过分离水层和有机层来进行级分分析(Thompson等，1974，《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.)63193-6)，然后在C-18柱上进一步分离这些级分。
26.5 生物学分析使用各种方法进行山楂的生物学分析，包括血栓烷A2检测试验、冠脉血管舒张测定法、心肌收缩性测定法和心室输出速率测定法。如下所述进行血栓烷A2检测试验。
26.6 血栓烷A2在本检测试验中，测定山楂提取物和级分调节[3H]SQ-29548与血检烷A2结合的能力。使用标准技术、在改性的Tris-HCL缓冲液(pH7.2)中制备来自New Zealand、体重为2.5±3kg的雄性或雌性白化体家兔的血小板。在有1μM BM13505存在的情况下估计非特异性结合的程度。将膜过滤并洗涤3次，统计滤过物以测定特异性结合的[3H]SQ-29548。在10μM下筛选混合物(Saussy等，1986，《生物化学杂志》(J.Bio.Chem.)2613025-3029；Hedberg等，1988，《药理学实验疗法杂志》(J.Pharmacol.Exp.Ther.)245786-792)。
试验参考数据Kd4.2nMBmax 960fmol/mg蛋白质特异性结合 95％化合物IC50(nM) Ki(nM) nH

*表示使用的标准参照剂BM-13505＝deltroban；SQ29548＝(Is-[1α，2β{5Z}，3β，4α])-7-(3-[{2-(苯氨基)羰基}肼基]甲基)-7-噁二环[2.2.1.]庚(hepy)-2-基-5-庚酸；U-46619＝11α，9α-环氧亚甲基-PGH2。
可以使用公开的方法分析山楂提取物对心肌的作用(Schusselr等，1995，Annzeim.Forch.Drug Res.4511)。在一种研究中，对分离的豚鼠进行心脏的冠脉血流量、心率和左心室的血压以及收缩和舒张的频率的分析。将该提取物的研究结果与过氧化苷藤黄菌素-7-葡糖苷和芸香苷进行比较。
还可以使用文献中公开的方法研究山楂对心肌缺血的保护作用(Lianda等，1984，《传统中药杂志》(J.Trad.Chinese Med.)4289-292)。使用培养的鼠心脏细胞和隔绝氧气和葡萄糖的鼠心脏细胞来研究山楂。
上述工作者已经证实在培养细胞的检测试验中牡荆葡基黄酮鼠李糖苷起心脏保护剂的作用。
26.7. HPLC化学分析C. Laevigata和C.Monogyna含有类黄酮，包括过氧化苷(金丝祧苷)、槲皮素、牡荆葡基黄酮、牡荆葡基黄酮-4’-L-鼠李-D-葡糖苷、牡荆葡基黄酮-4’-L-鼠李糖苷、牡荆葡基黄酮-4’-7-二-D-葡糖苷、芸香苷、槲皮素-3-鼠李-半乳糖苷、及其它。还含有黄嘌呤、胺、原花色素苷(proanthocyanidins)。(Leung和Foster，1996)。
如上述元宝草部分中所述、使用反相HPLC进行山楂的化学分析。
27. 实施例常春藤叶，原植物Hederae folium27.1 植物来源/背景技术常春藤生长在全欧洲和地中海附近的国家。进行一般销售的是其提取物的形式。传统上认为它可以作为抗菌剂、收敛剂、避孕药、催吐药、轻泻药、泻药、兴奋药、血管收缩药、血管舒张药和驱虫药。常春藤还可以用于风湿性硬化症、淋巴结结核和牙痛。
27.2 商品提供者/产品名称市售可得的常春藤来源包括ProspanTM(Engelhard，德国)、HedelixTM(Krewel Meuselbach，德国)和BronchofortanTM。
27.3 临床适应症德国专著中已经批准将常春藤用于治疗呼吸道炎症、治疗慢性支气管疾病(德国Commission E Monograph B Anz No.122，批准日为1988年6月6日)。常春藤叶的普通剂量为0.3g药物或相应的提取物。它还对骨关节炎和GI痛具有活性。常春藤具有预期的发汗活性和收敛活性。可以将它用于治疗消化不良疾病。
27.4 级分分析如上述元宝草实验中所述、使用反相色谱法进行常春藤叶提取物的级分分析。
27.5 生物学分析使用用以研究分泌作用和解痉作用的回肠模型来进行生物学分析。
27.6 HPLC化学分析常春藤中存在的成分包括皂草苷(2.5-6％)，α-常春藤素，石竹素葡糖苷，常春藤糖苷C(常春藤糖苷(hederacoside)C)，鼠李糖，黄酮醇葡糖苷，莰非醇3-芸香糖苷；痕量物质；甾醇包括豆甾醇，谷甾醇，胆甾醇，菜油甾醇，α-菠菜甾醇，和5α-豆(stigma)7-烯-3β-醇；东莨菪苷，绿原酸，咖啡酸，倍半萜烃类大根香叶烷，β-榄香烯，毒标刺激皮肤素和抗原儿茶酚(Bisset，1994)。
28. 实施例卡瓦胡椒，原植物卡瓦胡椒(Piper methysticum)28.1 植物来源/背景技术卡瓦胡椒叶称作kava kava。它是一种定期落叶的灌木，生长在从夏威夷到新几内亚的整个南太平洋地区。入药的部位是根状茎。
28.2 商品提供者/产品名称有许多卡瓦胡椒的商品提供者。一些主要产品是由MurdockMadaus Schwabe(Springville，Utah)提供的Polynesian KavaRoot；由Natrol(Chatsworth，加州)提供的AntaresTM(KrewelMeuselbach，德国)，LaitanTM(Schwabe，德国)和KavatrolTM。卡瓦胡椒根的粉状提取物也购自Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International且符合含有30％卡瓦吡喃酮的标准。
28.3 临床适应症卡瓦胡椒有许多生物活性。将它用作治疗失眠症、神经过敏、紧张的镇静药并用作肌肉松弛药。它具有解痉和抗惊厥活性。卡瓦胡椒的主要用途是作为非阿片类的止痛药。
已经批准将卡瓦胡椒用于治疗神经焦虑、紧张和不安。将卡瓦胡椒与南瓜子油、南瓜子一起用于治疗膀胱过敏综合征。德国CommissionE Monograph No.101中已经批准了卡瓦胡椒(1990年6月1日)。
28.4 级分分析如上述元宝草和Saw Palmetto部分中所述，在C-18柱上使用反相色谱法或在上述所用的硅胶上使用闪蒸色谱法来进行对卡瓦胡椒的级分分析。
28.5 GABA的生物活性分析通过研究与外周和中枢的GABA受体的结合情况、5-羟色胺重吸收检测试验和与多巴胺受体结合的情况来进行卡瓦胡椒活性的生物学分析。
使用公开的方法进行结合GABA-A和GABA-B受体和苯并二氮_类受体程度的分析(Davies等，1992，《药物学和毒素学》(Pharma.and Toxin.)71120-126)。此外，使用公开的置换检测法来研究卡瓦胡椒提取物与GABA-A受体的结合情况(Jussoifie等，1994，《精神药理学》(Psychopharmacology)116469-474)。
28.6 化学分析卡瓦胡椒含有3-20％的卡瓦内酯。树脂中的卡瓦内酯是具有C4位甲氧基和C6位芳香苯乙烯基部分的α-吡喃酮，包括醉椒素、7，8-二氢醉椒素、5，6-脱氢醉椒素、去甲基醉椒素、5，6，7，8-四氢去甲基醉椒素、醉人素、二氢醉人素、5，6-脱氢醉人素、5，6-二氢去甲基醉椒素、7，8-二氢去甲基醉椒素、10-甲氧基-去甲基醉椒素、11-甲氧基-去甲基醉椒素、11-羟基-去甲基醉椒素、羟基醉椒素和11-甲氧基-12-羟基-脱氢醉椒素。根状茎还含有黄醉椒素(flavokavins)A和B；生物碱胡椒醉人素(pipermethystin)；头二酮A(cepharadione)；酮包括亚肉桂基酮(cinnamalaketone)和亚甲基二氧-3，4-亚肉桂基酮(cinnamalaketone)；以及一种醇，即二氢化醉椒素-5-醇。(Leung和Foster，1996)。
29. 实施例甘草，原植物洋甘草(Glycyrrhiza glabra)29.1 植物来源/背景技术甘草是生长在亚热带气候中的4-5英尺的灌木。大部分商品甘草属于洋甘草的变种。该药物由干燥的根茎和根组成。它属于豆科的植物。
29.2 商品提供者/产品名称有许多甘草的商品提供者。粉状甘草根的提取物购自ZuelligBotanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International。符合含有5％甘草酸标准的甘草干燥提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)、LakrimentTM(Knoll，德国)、SuczulenTM(Dolorgiet，德国)且Licorice Root500TM购自Natural Factors NutritionalProducts，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)29.3 临床适应症甘草在临床上用作抗溃疡药剂、抗炎药、抗关节炎药、用作祛痰药并用作抗感染药剂。甘草的普通剂量为5-15g精细切制或粉状的根(计算成含有200-600mg的甘草甜素)。最常见的用途是治疗胃-十二指肠融合性溃疡。另一方面，可以使用甘草根的汁液(0.5-1g可治疗呼吸道炎症或1.5-3g可治疗溃疡)。德国Commission EMonograph No.90已经批准了甘草(1985年5月15日，1990年3月13日和1991年4月4日修订)。
已经证实甘草成分具有抗HIV活性(Hatano等，1988，《化学药物简报》(Chem.Pharm.Bull.)36(6)2286-2288)。还证实甘草对可导致牙龋的链球菌具有活性(Segal等，1985，《药物科学杂志》(J.Pharm.Sci.)7479-81)。
29.4 级分分析如上所述使用反相C-18柱进行成分的级分分析。
29.5 生物活性分析使用上述的环加氧酶测定法和脂氧合酶测定法以及抗前列腺素测定法来进行总甘草提取物和甘草各个成分的生物学分析。另一种生物检测法是11-β羟基甾醇脱氢酶检测法(MacKenzie等，1990，《临床内分泌代谢杂志》(J.Clin.Endocirnol.Metab.)701637-1643)。
29.6 HPLC化学分析甘草含有作为其主要活性组成的三萜苷甘草甜素(也称作甘草酸或三萜皂甙甘草酸)，其浓度在1-24％的范围，这取决于植物的来源和测定方法。有些工作者报导仅由于不同的测定方法就可导致所报导的甘草甜素的值有10倍的差异。甘草甜素通过水解产生甘草亭酸(或甘草亭)以及两分子的葡萄糖醛酸。
甘草的其它成分包括黄酮类化合物和异黄酮类化合物(甘草黄酮醇(licoflavonol)、熊竹素、甘草异黄酮、光甘草酚、光甘草酮(glabrone)、glyzarin、甘草异黄酮A和B、甘草异黄烷酮、甘草醇、刺芒柄花素、甘草黄苷素、甘草黄苷、新甘草苷、鼠李糖甘草苷、glyzaglabrin、4’-7’-二羟基黄酮、glaranine等)、查耳酮(异甘草素、异甘草黄苷、新异甘草黄苷、异甘草素葡萄糖洋芫荽糖甙(licuraside)、鼠李糖异甘草苷、刺灵德草碱、甘草查耳酮(licochalcones)A和B、4-羟基查耳酮等)、香豆素(伞形酮、脱肠草素、liqcoumarin、丙三醇等)、三萜系化合物(甘草亭酸、美草醇、光甘草内酯、异光甘草内酯、甘草酸(licoric acid)、β-香树素、18-β-甘草亭酸等)、甾醇(β-谷甾醇、豆甾醇、22，23-二氢化豆甾醇等)、2-20％的淀粉、3-14％的糖(葡萄糖和蔗糖)、木素、氨基酸(脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸等)、胺(天冬酰胺、甜菜碱、胆碱)、树胶、蜡、由许多合成香料组成的挥发油(包括丙酮醇、2-乙酰呋喃、丙酸、2-乙酰吡咯、糠醇、苯甲醛、戊醇、己醇、反式-六氯化铀-2-烯-醇、辛-1-烯-醇、里那醇、里那基氧化物、α-萜品醇、丁内酯、葶酮、和葑酮、其中还包括不单独构成甘草香料的物质)及其它。(Leung和Foster，1996)。
用HPLC进行甘草级分的化学分析。
30. 实施例MILK THISLE，原植物水飞蓟(Silybum marianum)，也称Carduus marianus，Carduus mariaum30.1 植物来源/背景技术Milk Thistle是克什米尔地区固有的植物，而在从加拿大到墨西哥的北美地区也可以找到这种植物。Milk Thistle以完整种子形式的植物药和提取物的形式来进行销售。传统上将它用作保肝剂。
30.2 商品提供者/产品名称Milk Thistle是另一种极其普遍的植物药产品。Milk Thistle250TM购自Natural Factors Nutritional Products，Ltd.(Burnaby，British Columbia，加拿大)且符合含有70-80％水飞蓟素标准的Milk Thistle粉状提取物购自Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International。Milk Thistle提取物还购自Bionorica(德国)、Madaus AG(德国)和Klinger(德国)。下列公司也提供Milk ThistleHerbal Choice-Botalia、NaturaLife、Herb Pharm、Natural’sHerbs、PhytoPharmica、LegalonTM(Madaus，德国)、SilimaritTM(Bionorica，德国)、PermixonTM(Pierre Fabre，德国)和Nature’s Way。
30.3 临床适应症(1)保肝剂、自由基清除剂、抗氧化剂、肝硬变、肝炎、消化不良疾病、肝/胆膀胱疾病、食欲不佳。
30.4 级分分析在C-18注上使用反相色谱法或在硅胶上使用闪蒸色谱法对MilkThistle进行级分分析。分别如上述元宝草部分和Saw Palmetto部分中所述来实施这两种方法。
30.5 生物活性分析通过研究所培养的肝细胞、c-AMP、B-葡糖苷酸酶和肝酶的水平来进行生物学分析。
30.5.1 抑制β-葡糖苷酸酶的检测试验β-葡糖苷酸酶是在肝损害或患肝癌后血液中增加的一种溶酶体酶类。因此，Milk Thistle及其成分的保肝作用通过它们对这种酶的抑制作用来确定。根据Kim等在1994年所述(《生物药物简报》(Biol.Pharm.Bull.)17443-445)、由人的粪便可以制备这种酶。为了测定这种酶的活性，在37℃、有或没有抑制剂存在的条件下，用溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0)的20μl、10mM的对硝基苯基-β-葡葡糖醛酸苷将这种酶进行培养(50分钟)。通过添加0.25N的NaOH来中止该反应并在405nm处测定所释放的对硝基苯酚的吸收度。30.5.2 抑制环-amp磷酸二酯酶(PHOSPHODISTRASE)(PDE)的检测试验在本检测试验中，如Koch等在1985年所述(《临床药理学实验研究方法》(Meth.Find Exp.Clin.Pharmcol.)1409-413)，在25℃、有不同量的Milk Thistle提取物和级分存在的条件下，用溶于40mM Tris-HCl(Hel)缓冲液(pH7-8)的PDE将C-AMP(0.1mM)培养10分钟。通过添加冷冻的高氯酸来中止该反应。将蛋白质沉淀进行离心并用HPLC(反相色谱法)来检测上清液。通过降低的C-AMP至AMP的转化率来研究酶的抑制情况。
30.6 TLC、HPLC化学分析在1968年，首先从种子中分离出了黄烷醇木酚素复合物、即水飞蓟素。水飞蓟素(成熟果实中占4-6％)主要由三种黄烷醇木酚素组成，即水飞蓟素(水飞蓟素)、次水飞蓟素(次水飞蓟素)和异水飞蓟素。其它的黄烷醇木酚素包括脱氧水飞蓟素、3-去氧次水飞蓟素、去氧异水飞蓟素(silymonin)、siliandrin、silybirnome、silyhermin和neosilyhermin。其它的成分包括5，7，4’-三羟黄酮，silybonol；固定油类(16-18％)，该油类主要由亚油酸和油酸、以及肉桂酸、棕榈酸、和硬脂酸组成盐酸甜菜碱，三胺，组胺，及其它(Leung和Foster，1996)。如上所述使用TLC和HPLC来分析MilkThistle。
31. 实施例西番莲，原植物粉色西番莲(Passiflora incarnata)31.1 植物来源/背景技术西番莲生长在美洲，且在亚热带和热带地区是栽培的。该药物在美国、印度和西印度群岛生产。
31.2 商品提供者/产品名称有许多西番莲提取物的商品提供者。西番莲干燥提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)并符合含有以异牡荆色素计的3.5％类黄酮的标准。粉状提取物购自Zuellig Botani cals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International并符合含有4％类黄酮的标准。它还购自Passifloradragee AlsitanTM(Alistan，德国)。
31.3 临床适应症西番莲可用作镇静药，治疗焦虑、用于失眠、坐立不安、各种神经性疾病。它还可用作解痉药剂(Paris，1963，《法国药物学年鉴》(Ann.Pharm.Franc.)21389)。普通的剂量范围是每日服用4-8g药物。神经药理学研究已经证明它具有中枢神经系统的作用(Speroni和Minghetti，1988，《植物药》(Planta Med.)54488)。
31.4 级分分析在C-18柱上使用反相色谱法或在硅胶上使用闪蒸色谱法来进行西番莲的级分分析。分别如上述元宝草和Saw Palmetto部分中所述实施这两种方法。
31.5 生物活性分析对MAO、GABA A(外周，中枢)进行生物学分析并如上所述进行实验。
31.6 HPLC化学分析西番莲含有小而高可变量(0.01-0.09％)的吲哚生物碱，主要由哈尔满、较少量的哈尔酚、骆驼蓬灵、哈尔明和骆驼蓬酚组成。已经怀疑是否有后四种生物碱存在。其它存在的成分包括类黄酮(异牡荆葡基黄酮2’’-β-D-葡糖苷，异荭草素2’’-β-D-葡糖苷，5，7，4’-三羟黄酮，木犀草素，槲皮素，莰非醇，夏佛托甙，异夏佛托甙，牡荆色素，皂草苷，牡荆葡基黄酮，荭草素和芸香苷)；生氰配糖体，大风子定(0.01％)；糖(主要为棉子糖和蔗糖)；甾醇(豆甾醇和谷甾醇)；正二十九烷，和树胶，及其它。已经从该植物中分离出了麦芽酚和乙基麦芽酚。在根中已经检测出了香豆素伞形酮和茛菪亭(Leung和Foster，1996)。通过HPLC分析西番莲。
32. 实施例南瓜，原植物南瓜子(Cucurbitae semen)32.1 植物来源/背景技术根据不同的种，将南瓜称作光皮南瓜、夏季和秋季南瓜，它生长在北美而在全世界栽培。其剂型要求使用完整或粉状的种子。
32.2 商品提供者/产品名称有许多南瓜种子提取物的商品提供者。Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals International提供了两个品种含有0.02％植物甾醇的粉状提取物以及含有0.5％植物甾醇和70％脂肪酸的软提取物。此外，南瓜种子亲脂提取物购自Indena s.a.(米兰，意大利)。它还可作为Prosta FinkTM(Fink，德国)和Cysto-UregeninTM(Madaus，德国)得到。
32.3 临床适应症主要用途是治疗排尿困难、尤其是与血浆过多的良性衰竭增生(BPH)相关的疾病。临床应用主要凭经验，但也要根据可靠的检验报告(Lutzelburger，Artzl.Praxis，1974，763278；Haefele，Artzl.Praxis，1977，793321)。平均日剂量为10g种子。
32.4 级分分析在C-18柱上使用反相色谱法或在硅胶上使用闪蒸色谱法来对南瓜种子和提取物进行级分分析。分别如上述元宝草和Saw Palmetto部分中所述来实施这两种方法。
32.5 生物活性分析对于BPH的临床适应症来说，用于抗炎活性的主要检测法是环加氧酶-1和-2以及5-脂氧合酶检测法。如上述Saw Palmetto部分中所述来进行这些实验。用于BPH临床疾病的其它相关生物检测法是雄激素受体结合检测法和5-α-还原酶检测法。这些检测试验如上述Saw Palmetto部分中所述来进行。
32.6 化学分析南瓜种子含有1％的甾醇，尤其是以24β-乙基-5α-胆甾基-7，25(27)-二烯-3β-醇和24β-乙基-5α-胆甾基-7-反式-22，25(27)-三烯-3β-醇作为主要成分，并且在某种程度上还含有甾醇葡糖苷以及Δ5-和Δ8-甾醇；生育酚(维生素E)；微量元素，特别是硒、锰、锌和铜；30-40％的固定油类；约/30％的果胶；约25-30％的蛋白质(Bisset，1994)。
33. 实施例臀果木，原植物Pygeum africanum33.1 植物来源/背景技术该植物主要在非洲发现，为喀麦隆产的树皮。用有机溶剂提取的粉状干燥树皮和干燥物形成了不同组成的浓缩粉状药物(Botati，(J.Ethnopharmacol.)，1991，32195-7)。
33.2 商品提供者/产品名称有许多臀果木提取物的商品提供者。主要厂商之一是提供臀果木纯化软提取物的Indena s.a.(米兰，意大利)，该产品符合含有以β-谷甾醇计的13％总甾醇的标准。普遍使用的是DEBAT实验室(Garches，法国)提供的TadenanTM、Inofarma(Madrid，西班牙)提供的PronitolTM和Murdock Madaus Schwabe(Springville，Utah)提供的Pygeum CapsulesTM。
33.3 临床适应症主要临床适应症类似于南瓜和Saw Palmetto，用于治疗排尿困难、尤其是与血浆过多的良性衰竭增生(BPH)相关的疾病。认为近来报导的对134名患BPH并用25mg该药物结合荨麻治疗的病人所进行的56天临床治疗实验是安全和有效的。(Krzeski，Kazon，Borkowski，Witeska和Kuczera，1993，《临床疗法(Clin.Ther.)，151011-20)。
33.4 级分分析在C-18柱上使用反相色谱法或在硅胶上使用闪蒸色谱法来对臀果木进行级分分析。分别如上述元宝草和Saw Palmetto部分中所述来实施这两种方法。
33.5 生物活性分析对于BPH的临床适应症来说，用于抗炎活性的主要检测法是环加氧酶-1和-2以及5-脂氧合酶检测法。如上述Saw Palmetto部分中所述来进行这些实验。用于BPH临床疾病的其它相关生物检测法是雄激素受体结合检测法和5-α-还原酶检测法。这些检测法如上述Saw Palmetto部分中所述来进行。也测定肌收缩性。
33.6 HPLC、GC化学分析用HPLC和GC来进行化学分析。成分包括烷烃、脂肪酸、甾醇和三萜。
34. 实施例迷迭香，原植物迷迭香(Rosemarinus officinalis)34.1 植物来源/背景技术迷迭香植物生长在地中海地区并且在许多国家是栽培的。该药物在西班牙、摩洛哥、南斯拉夫和突尼斯生产。通过对叶和叶柄进行水蒸气蒸馏可以产生迷迭香油。使用的是新鲜和干燥的叶并将它用乙醇提取。
34.2 商品提供者/产品名称迷迭香叶购自Zuellig Botanicals，Inc.(德国)的子公司Botanicals Ihternational。
34.3 临床适应症主要适应症是用作消化不适的止痛药和健胃药、用于气胀、扩张、食欲和刺激胃分泌。它还可用作利胆药。在外用方面，可以使用它的油剂或1inament来治疗风湿病以及局部刺激循环。平均日剂量(does)为2-6g药物或10-20滴芳香油。
34.4 级分分析如上所述使用反相C-18柱进行迷迭香成分的级分分析。
34.5 生物活性分析使用下列检测试验进行生物学分析羟醛-还原酶检测法、鼠和小鼠糖尿病试验法、db db小鼠试验法、Ob/Ob小鼠试验法、Zucker鼠试验法。如下所述进行羟醛-还原酶检测试验。
34.5.1. 醛糖还原酶醛糖还原酶(一种单体NADPH依赖性醛-酮还原酶)是在催化各种醛还原的聚合醇途径中的一种限速酶。这一过程包括将葡萄糖中的醛形式还原成相应的糖醇山梨醇。已经报导山梨醇蓄积在糖尿病型动物的晶状体、神经、肾和视网膜中。大量山梨醇可导致渗透破裂，这种渗透破裂是某些糖尿病并发症发病机理中的致病因素之一。
通过组织匀浆和离心将来自鼠晶状体的醛糖还原酶进行部分纯化。将化合物或载体、酶、NADPH和检测缓冲液预先在25℃下培养3分钟并在340nm处从起始的0点值开始观察吸收度。然后通过添加DL-甘油醛来引发反应并在25℃下持续保温8分钟，此时注意最终的吸收度。通过起始与最终吸收度间的差异来测定酶的活性。在100μM下筛选化合物(DeRuiter等，1993，《酶抑制作用杂志》(J.EnzymeInhibiton)7249-256；Kubo等，1994，《生物药物学简报》(Biol.Pharm. Bull.)17458-459)。标准参照剂是卡比多巴和苄丝肼。
34.6 HPLC、GC化学分析迷迭香含有约0.5％的挥发油；类黄酮(香叶木苷元，香叶木苷，芫花黄素，芫花黄素-4’-甲醚，6-甲氧基-芫花黄素，木犀草素，6-甲氧基木犀草素，6-甲氧基木犀草素-7-甲醚，粗毛豚草素，5，7，4’-三羟黄酮等)；酚酸(迷迭香酸，唇形草鞣质酸，绿原酸，新绿原酸和咖啡酸)；鼠尾草酸；迷迭香碱和异述迭香碱(鼠尾草酸的反应产物)；三萜酸(主要为熊果酸和齐墩果酸，以及微量的19α-羟基熊果酸、2β-羟基齐墩果酸和3β-羟基脲-12，20(3)-二烯-17-酸)；迷迭香醇(rosmanol)，7-乙氧基迷迭香醇，白桦脂酸和鼠尾草苦内酯；及其它。芳香油主要含有单萜(monoterpne)烃类(α-和β-蒎烯，莰烯，苎烯等)、桉树脑(桉叶油素)、和冰片、以及樟脑、里那醇、马鞭草烯醇、萜品醇、3-辛酮，并且还含有乙酸异冰片酯。(Leung和Foster，1996)。
挥发油包括单萜烃、樟脑、冰片和桉树脑以及类黄酮。35.实施例西伯利亚人参，原植物Eleutherococcus senticosus35.1 植物来源/背景技术西伯利亚人参是由俄罗斯科学家引种的一种相对于亚洲人参的植物。该草药的药用部位是根。
35.2 商品提供者/产品名称可得到的各种形式的西伯利亚人参如下Natural Life、HerbalHarvest、Herbal Choice-Botalia.、Herb PharmEleu-KokkTM(Pharmaton，德国)和Vital-Kapseln-ratiopharmTM(Ratipharm，德国)。
35.3 临床适应症西伯利亚人参有许多临床适应症，包括抗癌特性、免疫刺激特性和降血压特性。还报导它可以作为普通的补药。
35.4 级分分析如上述槲寄生部分中所述制备级分。另一方面，使用公开的方法(Bauer和Remiger，1989，《植物药》(Planta Med.)55367-371；Steinmuller等，1993，《免疫药理学杂志》(Jimmunopharmacol.)15(5)605-614)。
35.5 生物活性分析如上述槲寄生部分中所述进行抗癌临床用途的生物学分析。
35.6 化学分析用HPLC进行化学分析。成分包括五加苷、配位体和甾醇。
36. 实施例荨麻，原植物狭叶荨庥(Urtica dioica)36.1 植物来源/背景技术这种植物几乎分布在世界各地并且主产于东南欧。在外用时，该药物作为冷压榨油的形式使用，且在内服时，该药物作为由精细筛选的植物材料制成的茶来使用。
36.2 商品提供者/产品名称新鲜冷冻的干燥荨麻购自Ecclectic Institute(Sandy，Oregon)并购自Bionorica(德国)。该药物的根(泌尿科药剂)购自BazotonTM(Kanoldt，德国)、ProstafortonTM(Sanofi Winthrop，德国)且该药物的叶(抗风湿药)购自Rheuma-HeckTM(KrewelMeuselbach，德国)。
36.3 临床适应症主要用途是作为利尿药，不过，还可用作愈合创伤的促进剂并可治疗胆囊疾病(Kirchhoff，Z.Phytotherap.1983，4621)。日平均剂量为150ml热水中3-4茶匙荨麻草药，每日服用3-4次。
36.4 级分分析如上所述使用反相C-18柱进行荨麻成分的级分分析。
36.5 生物活性分析如上述Saw Palmetto部分中所述进行生物学分析。
36.6 HPLC化学分析已经从该药物中分离出了β-谷甾醇和鞣酸、最新的莨菪亭、β-谷甾醇3-β-D-葡糖苷以及其它甾醇和甾醇葡糖苷。已经在该药物中检测出了包括高香草醇和相应葡糖苷在内的苯基丙烷、以及相对少见的单环氧化木酚素类的木酚素、还有新橄榄树脂素和衍生物。还存在一系列多酚及其甲基醚。已经分离出了游离形式的几种单萜二醇和葡糖苷形式。还发现了所谓UDA(荨麻二酸凝集素)的外源凝集素(0.1-0.2％)和多糖(酸性和中性的)以及9-羟基十八碳-10-反式，12-顺式二烯酸(Bisset，1994)。
37. 实施例缬草，原植物宽叶缬草(Valeriana officianalis)37.1 植物来源/
背景技术：
缬草植物生长在欧洲和亚洲并且移植到了北美。该药物在美国、日本和欧洲是栽培的。最常应用的药用部位是根、根茎和匍匐枝并作为茶服用。通过用乙醇提取根该可以生产芳香油和酊剂。
37.2 商品提供者/产品名称有许多缬草提取物的商品提供者。主要厂商之一是提供缬草干燥提取物的Indena s.a.(米兰，意大利)，该药物符合含有0.8％缬草酸(valerenic acid)的标准。其它产品包括由Murdock MadausSchwabe(Springville，Utah)提供的CalmaidTM和ValerianNighttimeTM。Flora Laboratories、Trout Lake Farm、PhytoPharmica、Herbal Choice-Botalia、Botalia Gold、HerbPharm、Nature’s Way和Shaklee也提供。
37.3 临床适应症与缬草相关的临床用途和适应症如下镇静、促进睡眠剂、镇静剂、保肝、肝硬变、肝炎、免疫调制活性、高血脂症、镇静药、紧张、神经过敏和失眠症。
37.4 级分分析如上所述使用反相C-18柱进行缬草成分的级分分析。还如上述槲寄生部分中所述来制备级分。另一方面，使用公开的方法(Bauer和Remiger，1981；Steinmuller等，1993)。
37.5 生物活性分析如上所述分析缬草的CNS受体、GABA-A(中枢，外周)以及5HT1受体活性。使用上述动物模型来研究阻抑特性。
37.5.1 氨基丁酸-A(GABA-A)受体结合的生物检测法通过断头术处死雄性鼠，将它们的皮层除去并在Potter-Eleveheim匀浆器中的10个体积冷0-32M蔗糖(pH7.4)中进行匀浆。将100g匀化的物质离心10分钟。然后将20,000g上清液离心20分钟并将沉淀(pallet)重新悬浮在20个体积的新鲜的冷却蒸馏水中，并(nd)以8,000×g再离心20分钟。将上清液和‘暗黄色覆盖层’以50,000×g离心20分钟以作为沉淀(pallet)的GABA-A受体。在50mm Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中进行结合的检测试验。根据1993年Bernasconi和Morazzoni的方法来确定在0℃下培养30分钟后缬草提取物及其级分对3H-蝇蕈醇与GABA-A受体结合的影响(Fitoterapia，vol.LXIV，291-299)。
37.6 HPLC、TLC、超临界二氧化碳的化学分析常见的缬草含有作为其主要生物活性成分的几种称作缬草三酯的环烯醚萜化合物，包括戊曲酯(戊曲酯、异戊醇戊曲酯、螺呋醋内酯、缬草酯氯等)、地戊曲酯(地戊曲酯、高地戊曲酯、去氧地戊曲酯、高去氧地戊曲酯、氧化异戊羟基地戊曲酯等)，且异戊曲酯(异戊曲酯、7-表脱乙酰基异戊酸酯等)、戊曲酯和地戊曲酯是主要的缬草三酯。此外，它含有缬草苦甙(一种环烯醚萜酯苷)和挥发油(0.5-2％)，其中挥发油由许多成分组成，包括乙酸冰片酯和异戊酸酯(主要化合物)、石竹烯、α-和β-蒎烯、缬草烯醛(valerenal)、缬草烯酸、缬草酮、β-芷香酮、异戊酸丁子香酚酯、异戊酸异丁子香酚酯、绿叶醇、缬草醇、冰片、莰烯、β-红没药烯、喇叭茶醇、异戊酸、和萜品油烯、及其它。常见的缬草还含有几种生物碱，包括猕猴桃碱、缬草宁碱、缬草碱、和鬓草宁碱。常见缬草中存在的其它成分包括胆碱(约3％)、甲基2-吡咯酮、绿原酸和咖啡酸；β-谷甾醇；鞣酸；树胶；及其它。据一般报导印度缬草含有作为常见缬草的类似成分，包括缬草三酯、缬草苦甙和挥发油。此外，它含有乙酰化里那苷的2A’’’-O-和3’’’-O-2-甲基丁酰酯(Leung和Foster，1996)。
因为这些实施方案只是用来解释本发明的几个方面，所以本文描述并要求的本发明在范围上不由本文公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案均属于本发明的范围。实际上，除本文展示和描述的技术方案外，本领域技术人员还可以根据上述描述对本发明作各种修改，这是显而易见的。这类修改也属于所附权利要求的范围。括号中引入的是贯穿于本申请中的各种公开文献和专利。将它们的内容引入本申请中作为参考。
权利要求
1. 一种用于制备药物等级的植物药的方法，该方法包括以下步骤提供一种具有特定生物活性的植物材料，所述的植物材料含有多种成分；将植物材料的代表性等分试样分离成多种标记级分，其中至少一种标记级分含有至少一种活性成分；测定每个标记级分的特定生物活性程度以提供一种代表性等分试样的指纹图谱；并且将代表性等分试样的生物活性指纹图谱与已经确定为药物等级的植物药的生物活性指纹图谱进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
2. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中一种或多种标记级分含有一种活性成分。
3. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中该方法包括以下另外的步骤测定至少一种标记级分中的活性成分的量以便提供一种代表性等分试样的定量组成指纹图谱并且将代表性等分试样的定量组成指纹图谱与已经确定为特定药物等级的植物药的定量组成指纹图谱进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
4. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中该方法包括以下另外的步骤测定植物材料代表性等分试样的总生物活性并且将代表性等分试样的总生物活性与标准物的总生物活性进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
5. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种由植物材料制成的提取物。
6. 根据权利要求5的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种超临界二氧化碳提取物。
7. 根据权利要求5的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种乙醇提取物。
8. 根据权利要求5的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种水或有机提取物。
9. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种种子油。
10. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种粉状植物材料。
11. 根据权利要求1、2、3或4的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料选自下列植物组成的组芦荟、复盆子、黑“可霍喜”、春黄菊、Chaste tree、板栗、紫松果菊、晚樱、小白菊、大蒜、姜、银杏、人参(亚洲)、白毛茛、绿茶、Guggulipid、山楂、常春藤、卡瓦胡椒、甘草、Milk Thistle、西番莲、南瓜、臀果木、迷迭香、西伯利亚人参、Saw Palmetto、元宝草、荨庥和缬草。
12. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是芦荟。
13. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是复盆子。
14. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是黑“可霍喜”。
15. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是春黄菊。
16. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是板栗。
17. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是紫松果菊。
18. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是晚樱油。
19. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是小白菊。
20. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是大蒜。
21. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是姜。
22. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是银杏。
23. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是人参(亚洲)。
24. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是白毛茛。
25. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是绿茶。
26. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是山楂。
27. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是常春藤叶。
28. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是卡瓦胡椒。
29. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是甘草。
30. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是Milk Thistle。
31. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是西番莲。
32. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是南瓜。
33. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是臀果木。
34. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是迷迭香。
35. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是Saw Palmetto。
36. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是西伯利亚人参。
37. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是元宝草。
38. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是荨麻。
39. 根据权利要求11的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是缬草。
40. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种植物材料的混合物。
41. 根据权利要求40的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料的混合物是Saw Palmetto和南瓜的混合物。
42. 根据权利要求40的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料的混合物是紫松果菊和白毛茛的混合物。
43. 根据权利要求40的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料的混合物是元宝草和缬草的混合物。
44. 根据权利要求1、2、3或4的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分选自下列成分组成的组多聚乙酰(acetogenin)、生物碱、碳水化合物、类胡萝卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、类黄酮、苷、类异戊二烯、大环抗菌素、核酸、青霉素、肽、酚(phenolic)、多炔、聚酮化合物(polyketide)、多酚、多糖、蛋白质、前列腺素、类甾醇和类萜。
45. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是多聚乙酰。
46. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是生物碱。
47. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是碳水化合物。
48. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是脂肪酸酯。
49. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是类黄酮。
50. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是外源凝集素。
51. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是酚。
52. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是类甾醇。
53. 根据权利要求44的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分是类萜。
54. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善过敏性/炎症疾病中的用途的指征。
55. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善心血管疾病中的用途的指征。
56. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善中枢神经系统疾病中的用途的指征。
57. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善胃肠疾病中的用途的指征。
58. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善新陈代谢紊乱中的用途的指征。
59. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性治疗或改善由微生物体或病毒诱发的疾病中的用途的指征。
60. 根据权利要求1的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种均匀物质。
61. 一种用于制备药物等级的植物药的方法，该方法包括以下步骤提供一种含有多种成分的植物材料，所述的成分具有特定的生物活性且其中每种成分均具有标准化的生物活性分布；将来自植物材料的代表性等分试样分离成多种标记级分，其中至少一种标记级分含有至少一种活性成分；测定存在于每种标记级分中的每种活性成分的量；根据存在的每种活性成分的量和标准化成分的生物活性分布来推算每种标记级分的生物活性，以便提供代表性等分试样推算出的生物活性指纹图谱；并且将代表性等分试样推定的生物活性指纹图谱与已经确定为药物等级的植物药的生物活性指纹图谱标准物进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
62. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中该方法包括以下另外的步骤测定植物材料代表性等分试样的总生物活性并且将代表性等分试样的总生物活性与标准物的总生物活性进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
63. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种由植物材料制成的提取物。
64. 根据权利要求63的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种水或有机提取物。
65. 根据权利要求63的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种粉状植物材料。
66. 根据权利要求61或62的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料选自下列植物组成的组芦荟、复盆子、黑“可霍喜”、春黄菊、Chaste tree、板栗、紫松果菊、晚樱、小白菊、大蒜、姜、银杏、人参(亚洲)、白毛茛、绿茶、Guggulipid、山楂、常春藤、卡瓦胡椒、甘草、Milk Thistle、西番莲、南瓜、臀果木、迷迭香、西伯利亚人参、SawPalmetto、元宝草、寻麻和缬草。
67. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是是一种植物材料的混合物。
68. 根据权利要求61或62的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性成分选自下列成分组成的组多聚乙酰、生物碱、碳水化合物、类胡萝卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、类黄酮、苷、类异戊二烯、大环抗菌素、核酸、青霉素、肽、酚、多炔、聚酮化合物、多酚、多糖、蛋白质、前列腺素、类甾醇和类萜。
69. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善过敏性/炎症疾病中的用途的指征。
70. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善心血管疾病中的用途的指征。
71. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性治疗或改善中枢神经系统疾病中的用途的指征。
72. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性治疗或改善胃肠疾病中的用途的指征。
73. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性治疗或改善新陈代谢紊乱中的用途的指征。
74. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中生物活性是在治疗或改善由微生物体或病毒诱发的疾病中的用途的指征。
75. 根据权利要求61的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料是一种均匀物质。
76. 根据权利要求1、4、61或62的用于制备药物等级植物药的方法，其中标记级分含有一类相关的成分。
77. 一种用于制备药物等级的植物药的方法，该方法包括以下步骤提供一种具有特定生物活性的植物材料，所述的植物材料含有多种成分；将植物材料的代表性等分试样分离成多种标记级分，其中至少一种标记级分含有至少一种活性种类的成分；测定每个标记级分的特定生物活性程度以提供一种代表性等分试样的生物活性指纹图谱；并且将代表性等分试样的生物活性指纹图谱与已经确定为药物等级的植物药的生物活性指纹图谱标准物进行比较，从而确定该植物材料是否是一种药物等级的植物药。
78. 根据权利要求77的用于制备药物等级植物药的方法，其中植物材料选自下列植物组成的组芦荟、复盆子、黑“可霍喜”、春黄菊、Chastetree、板栗、紫松果菊、晚樱、小白菊、大蒜、姜、银杏、人参(亚洲)、白毛茛、绿茶、Guggulipid、山楂、常春藤、卡瓦胡椒、甘草、Milk Thistle、西番莲、南瓜、臀果木、迷迭香、西伯利亚人参、Saw Palmetto、元宝草、荨麻和缬草。
79. 根据权利要求77的用于制备药物等级植物药的方法，其中活性种类的成分选自下列成分组成的组多聚乙酰、生物碱、碳水化合物、类胡萝卜素、肉桂酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸酯、类黄酮、苷、类异戊二烯、大环抗菌素、核酸、青霉素、肽、酚、多炔、聚酮化合物、多酚、多糖、蛋白质、前列腺素类甾醇和类萜。
80. 一种根据权利要求1、3、61或77的方法制备的药物等级的植物药。
81. 一种根据权利要求1的方法制备的药物等级的植物药，其中标记级分含有一类相关的成分。
全文摘要
本发明总体上涉及植物材料和以医药上有用的和药理上可接受的形式来制备这些植物材料的方法。具体的，本发明涉在将植物材料加工成药物的过程中组分和活性指纹图谱的应用，该药物有资格用作药物等级组合物，且适于在临床或兽医学上用于治疗和/或减轻疾病，紊乱，或病症。
文档编号A61P31/18GK1239547SQ97195565
公开日1999年12月22日 申请日期1997年4月15日 优先权日1996年4月15日
发明者T·A·赫瓦雅, E·P·弗里德曼 申请人:法玛普林特公司, 南加州大学