专利名称：用于防治肝癌的草药制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治肝癌的草药制剂。更明确地说，本发明涉及一种草药制剂，该药剂包括特别是对乙型肝炎病毒具有良好防治作用并含4种主要天然药物，即白花蛇舌草(Hedyotidis herba)，姜黄(Curcumaelongae rhizoma)，虎杖(Polygoni cuspidati radix)和山豆根(Sophorae tonkinesis radix)的可注射组合物；和对脂肪肝和肝硬变有防治作用并含十种天然药物即白花蛇舌草，重楼(Paridisrhizoma)，虎杖，山豆根，龙胆草(Gentianae scabrae radix)，大黄(Rhei rhizoma)，连翘(Forsythiae fructus)，赤芍(Paeoniae radix rubra)，姜黄和石菖蒲(Acori graminei rhizoma)的口服组合物，通过两种组合物的联合给药，能有效地阻止包括肝炎，脂肪肝和肝硬变的肝脏疾病发展成为肝癌并治疗肝癌。
肝癌的病因学尚未明确建立。不过，统计学上肝癌具有特征事实，即其发生率在四十到六十岁的男性中远较女性为高，并它可以并发接近80％的肝硬变和10％的丙型肝炎。该特征与下述事实相一致，即在肝癌高发地区，例如远东和东南亚包括韩国，南欧，非洲等地也有乙型肝炎病毒带菌者的高发频数。在这些地区，可以发现肝癌侵害一个家庭的多数成员。进一步地，包括肝硬变，慢性肝炎等的慢性肝病都有发展成肝癌的相对高的倾向，而不管是乙型肝炎和丙型肝炎。此外，已知由慢性肝炎和肝硬变发展成肝癌的频数是饮酒或吸烟的6-8倍。
在许多病例中，肝癌只有在其恶化之后才显示独有的症状。肝癌显示各种症状，包括普通的全身不适，厌食等，以及右上腹部肝肿大和肝中形成硬块，肝硬变的进一步全身恶化症状例如腹水，黄疸，脾肥大等。
迄今，手术切除肝癌变部位被认为是治疗肝癌的最有效的方法。不过，这种切除手术的应用要取决于肝癌的状况而受到限制。例如，切除手术不能用于患有过于严重的原发肝硬变的人，即使其肝癌很小并由早期诊断所发现。另外，当肝癌的尺寸小于3cm，可以采用在超声图象观察下，将酒精直接注射到癌变部位，以彻底杀死癌变的方法。尽管这一方法具有较好的效果并有与外科手术后的相同病程，但它对尺寸大于3cm的癌基本是无效的。
同时，对一个患肝癌的病人，手术操作会冒致死的危险，因为他还患有相当严重的肝硬变，在此情况下，建议使用抗癌剂。对这种情况，通过口服抗癌剂或通常的注射不能提供实质的效果，而主要使用的治疗方法是通过肝脏动脉将抗癌剂直接注入癌变肝组织，或是抗癌剂给药后将连接肝癌部位的血管闭合。
由于许多肝癌可以导致死亡，肝癌的预防必须优先于已侵入的肝癌的治疗。目前，肝癌预防的最佳方法是接种疫苗制剂。
在这种情况下，本发明人已深入研究，开发出药品，该药品可以有效地治疗肝癌，并可通过抑制肝硬变发展成肝癌来防止肝癌的发展，该药品特别地用已披露具有相对较小毒副作用的各种组合天然药物生产的多种组合物阻止肝硬变发展成肝癌。结果，我们已认定，通过每一种具有下述独特组成的可注射组合物和口服组合物联合给药，可以有效地达到上述目的，这样完成了本发明。
因此，本发明涉及对防治肝癌有用的草药制剂。
特别地，本发明涉及一种套装形式的草药制剂药盒，它通过对乙型肝炎病毒具有良好防治效果的可注射组合物和对脂肪肝及肝硬变具有防治效果的口服组合物的联合给药，阻止肝炎或肝硬变发展成肝癌，有效地阻止肝癌的发展和用于治疗肝癌。
更具体地，本发明涉及用于防治肝癌的草药制剂，该药剂包括一种对乙型肝炎病毒具有治疗效果并含4种主要天然药物，即白花蛇舌草，姜黄，虎杖和山豆根的可注射组合物(A)，和一种对脂肪肝和肝硬变有防治效果并含10种天然药物，即白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，姜黄和石菖蒲的口服组合物(B)。本发明的草药制剂可以有效地治疗肝癌，而不用手术操作或抗癌剂，并可以有效地阻止肝病例如肝硬变转变成肝癌。
为了彻底了解本发明的性质和目的，结合附图作下列详细描述，其中
图1是根据实验6由DEN(二乙基亚硝胺)和AAF(乙酰氨基芴)诱发的慢性肝癌的鼠肝的照片[正常(正常组)只给生理盐水的组；对照(对照组)只给DEN和AAF的组；UKG1(测试组1)经口给以40mg/Kg口服组合物(B)和经腹腔给以70μl/Kg的可注射组合物(A)的组，UKG2(测试组2)经口给以200mg/Kg口服组合物(B)和经腹腔给以350μl/Kg的可注射组合物(A)的组]；图2是对照组鼠肝的照片，其中慢性肝癌是根据实验6(Masson-三色染色法；箭头表示纤维化)由DEN和AAF诱发的；图3是对照组鼠肝的照片，其中慢性肝癌是根据实验6(H&E(Hematoxylin和Eosin)染色法；箭头表示大个的结节)由DEN和AAF诱发的；图4是测试组2的鼠肝的照片，其中慢性肝癌是根据实验6(Masson-三色染色法)由DEN和AAF诱发的，然后联合给以200mg/Kg的口服组合物和350μl/Kg的可注射组合物；图5是测试组2的鼠肝的照片，其中慢性肝癌是根据实验6(H&E染色法；箭头表示小个的结节)由DEN和AAF诱发的，然后联合给以200mg/Kg的口服组合物和350μl/Kg的可注射组合物。
作为构成本发明草药制剂的一部分，由混合4种主要天然药物，即白花蛇舌草，姜黄，虎杖和山豆根生产的可注射组合物(A)，由于主要天然药物的各种药理活性，通过提高免疫功能并显示抗病毒活性，对病毒肝炎具有防治作用。作为本发明草药制剂的另一部分，由混合10种主要天然药物，即白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，姜黄和石菖蒲生产的口服组合物(B)，基于主要天然药物的各种药理活性，对肝硬变具有防治作用。在本发明草药制剂中，对易于从慢性乙型肝炎或肝硬变发展而成的肝癌，通过这两种组合物的联合给药，被有效地防治。
在下文中，将对源自各个主要天然药物的药理活性，用于防治肝癌的本发明组合物的复合效应作详细的说明。
已知白花蛇舌草主要作用于心脏和肝脏以显示其抗癌活性和抗菌和抗炎活性，并抑制HBsAg和降低SGPT。该药也具有清洁血液和解毒作用，因此它可以被有效地用于黄疸和肝病例如病毒肝炎。它基本是无毒的天然药物，作为毒性标准，LD50值为104g/Kg(老鼠，i.p.)。
姜黄提高胆汁的分泌并收缩胆囊，通过使胆汁含量正常化显示利胆活性。也已知姜黄具有优越的抗菌活性，因此延长了感染肝炎病毒的老鼠的存活期，并显示抗病毒性肝炎及由化学物质(四氯化碳)造成的肝病的优越的治疗效果。在"Hyundaesilyoungjoongyak"中，披露了姜黄作为健胃药和芳香药在胆管和肝脏中促进解毒，因此可用于治疗黄疸，心痛风等。
虎杖具有抗菌和抗病毒活性并可在低血糖造成的休克状况下用于静脉注射。同时，"Yaksungron"披露虎杖是无毒的，但对怀孕妇女是禁忌的。
已认识到，在试管内对老鼠腹腔癌测试，山豆根的抗肿瘤活性是有效的。此外，"Gaeboboncho"披露，山豆根除去伤口位置各种药和毒物的毒性，并具有止痛活性，并还可治疗急性黄疸，咳嗽，发烧等。
重楼具有解毒活性以治疗酒精造成的肝脏损害，并提高人体的免疫功能。也注意到，当大量使用时，重楼可显示抗癌活性。
已知，大黄具有抗菌，抗肿瘤和促泻活性，并可治疗甲状腺瘤变，肝细胞退化，肝静脉充血等。进一步地，当给人体服用大黄，它主要分布在肝和肾中以显示其活性。最近还发现，大黄具有类似于干扰素所具有的药理活性。
连翘具有有效的抗菌活性，主要作用于心脏，肝脏和胆囊，并且是无毒的。此外已发现，连翘连同山豆根，姜黄等，可补充人体中的微量元素并有使肝细胞再生的功能。
赤芍主要作用于肝脏，脾脏等，并显示抗炎和抗溃疡活性。它也有抗菌，退热，止痛，镇静及解痉活性。已有报导，作为用老鼠的抽取心脏在试管中测定的结果，赤芍作用于循环系统，提高冠状动脉的血量。
龙胆草具有保肝和利胆活性，用于治疗由四氯化碳造成的老鼠急性肝病，并降低肝组织损害。此外，龙胆草也具有健胃和抗菌及抗炎活性，影响神经系统，降低血压的活性等。根据老鼠毒性检测结果，已经披露，由于龙胆草的LD50值以经口给药为460-1250mg/Kg，静脉注射为163.4mg/Kg，基本是无毒的。
石菖蒲作用于肝脏，脾脏和心脏，并具有力的抗菌活性。还对平滑肌具解痉活性，刺激消化液的分泌，在胃肠道中抑制异常的发酵和使肠道平滑肌膨胀。
在根据本发明草药制剂的可注射组合物(A)中，以各天然药的干重计，白花蛇舌草，虎杖，山豆根和姜黄按2-10∶2-10∶2-10∶0.1-5的比例，优选比例4-6∶4-6∶4-6∶1-3混合在一起。
在特别优选的可注射组合物(A)中，白花蛇舌草，虎杖，山豆根和姜黄按重量5∶5∶5∶2的比例混合在一起。
上述组合物比例是考虑到每种主要天然药的有效量和副作用而确定的。如果组合物比例超出上述范围，药理作用就会迅速地降低或任何副作用都会发生。
为了得到治疗乙型病毒肝炎的更有力的活性，如果要求，本发明可注射组合物A可以另外含有一种或多种选自包括大青叶(IsatidisFolium)，山豆根(Sophorae radix)，茵陈(Artemisiae capillaris herba)，柴胡(Bupleuri radix)，苍术(Atractylodis rhizoma alba)，泽泻(Alisma rhizoma)，冬虫夏草(Cordyceps)，大黄，板兰根(Isatidis Radix)，龙胆草，黄芩(Scutellariae radix)和重楼的补充天然药物。
当补充天然药物按干重量被加入本发明可注射组合物中，基于干重，大青叶，山豆根，茵陈，柴胡，苍术，泽泻，板兰根，龙胆草，黄芩和重楼中的每一种按2-10重量份数，优选4-6重量份数的比例加入；且冬虫夏草和大黄中的每一种按0.5-6重量份数，优选2-4重量份数的比例加入。
本发明的可注射组合物(A)可以根据制药领域中常用的方法使用制药学可接受的赋形剂制备。例如，可注射组合物(A)可根据韩国药典通则中描述的制备注射剂的方法制备，该方法包括a)用水提取姜黄，然后蒸馏姜黄的水提取液；b)分别用水提取白花蛇舌草，虎杖和山豆根，蒸馏并浓缩所得水提取液，用酒精提取残余物三次，过滤提取液得到滤液；c)将步骤b)中得到的滤液与步骤a)中得到的姜黄的提取液混合；然后d)向其中加入通常用于制备注射剂的一种制药赋形剂，例如类似吐温80的乳化剂。
同时，构成根据本发明草药制剂的另一部分的口服组合物(B)包括十种主要天然药物，即如上所述的白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，姜黄和石菖蒲。
在本发明口服组合物(B)中，主要天然药物以干重计，按白花蛇舌草占1-10，虎杖占1-10，山豆根占1-10，重楼占0.5-8，赤芍占0.5-8，姜黄占0.5-8，石菖蒲占0.5-8，龙胆草占0.1-5，大黄占0.1-5和连翘占0.1-5的比例结合在一起。优选地，在本发明口服组合物(B)中，主要天然药物以干重计，按白花蛇舌草占3-8，虎杖占3-8，山豆根占3-8，重楼占1-6，赤芍占1-6，姜黄占1-6，石菖蒲占1-6，龙胆草占0.5-4，大黄占0.5-4和连翘占0.5-4的比例结合在一起。
本发明特别优选的口服组合物含主要天然药物以干重计，按白花蛇舌草∶虎杖∶山豆根∶重楼∶赤芍∶姜黄∶石菖蒲∶龙胆草∶大黄∶连翘=3∶3∶3∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1的比例。
这种组成比例是考虑了每种主要天然药物的有效量和副作用而确立的。如果组成比例超过上述范围，药理作用就会急速降低或任何副作用就会发生。
为了更有效地防治脂肪肝和肝硬变，如果需要，本发明口服组合物(B)可以另外含有选自包括冬虫夏草，熊胆(bear′s gall-bladder)，羚羊角(antelope′s horn)，玄参(Scrophulariae radix)，丹参(Salviaeradix)，板兰根，黄芪(Astragali radix)，山楂(Crataegi fructus)，白茅根(Imperatae rhizoma)，鳖甲(Amydae carapax),Cumarae longaerhizoma，当归(Angelicae gigantis radix)，人参(Ginseng radix alba)，枸杞(Lycii fructus)，五味子(Schizandrae fructus)，柴胡，三七(Notoinseng radix)，茵陈，大青叶和黄芩的一种或多种补充天然药物。
当天然药物按干重被加入本发明口服组合物中时，板兰根，黄芪，山楂，白茅根，Cumarae longae rhizoma，当归，枸杞，五味子，柴胡，三七，茵陈，大青叶和黄芩中的每一种按重量份数1-10，优选3-8加入；而冬虫夏草，羚羊角，玄参，丹参，鳖甲和人参中的每一种按重量份数0.5-8，优选0.5-4的比例加入；熊胆按重量份数0.01-2，优选0.1-1的比例加入。
本发明口服组合物(B)可以根据通常在制药领域中常用的方法，用制药可接受的赋形剂来制备。例如，口服组合物(B)可以根据包括a)粉碎姜黄和，石菖蒲；b)萃取白花蛇舌草，虎杖，山豆根，重楼，龙胆草，大黄，连翘和赤芍；和c)将在步骤a)中得到的粉和在步骤b)中得到的萃取物混合的方法来制备。
用于受体人的本发明草药制剂的剂量和给药方法可以根据患者的年龄，性别，健康状况，待处置疾病的严重性，给药的频率等加以变化。通常，对成年人(体重约70Kg)用静脉注射作为每1ml含以上述比例混合的6-35g天然药物中得到的萃取物的注射剂的可注射组合物A)，日剂量为1-10ml，优选3-6ml是适合的。与此同时，以上述比例混合的口服组合物B)，对成年人(体重约70Kg)以日剂量1-10g给药也是合乎要求的。如果需要，可注射组合物A)和口服组合物B)可以同时给药，也可将它们按一定的间隔给药。为此目的，本发明草药制剂可按下列形式包装，其中可注射组合物A)和口服组合物B)可以装在一个包装盒内，或以分开的包装将两个组合物分开包装。
本发明由下列实施例和实验加以更明确的解释。不过，应理解，本发明不以任何方式受这些实施例的限制。
实施例1可注射组合物的制备100g姜黄浸入水中，静置3小时。向其中加入1L蒸馏水，混合物加热提取得到约400-500ml提取液。所得提取液浓缩至约250ml，得到溶液A。
取白花蛇舌草，山豆根和虎杖每种250g并混合在一起，并向混合物加入7L蒸馏水。此混合物静置24小时，然后加热1小时作第一次提取并过滤。向残余物中加入3L蒸馏水，然后加热提取40分钟。合并提取液并浓缩至600ml，得到溶液B。此溶液B根据下述方式用酒精提取三次纯化，除去杂质。
向溶液B中加入1400ml酒精以制备70％的酒精溶液，将其静置24小时，然后过滤。通过蒸发从所得2000ml滤液中除去酒精，得到600ml溶液B1。
向B1溶液中加入2400ml的100％酒精，得到约80％的酒精溶液，该溶液静置24小时，然后过滤得到3000ml滤液。该滤液用20％的氢氧化钠调整pH为8-9，在冷却的温度(0-4℃)下静置24-48小时，然后过滤得到3000ml滤液。从滤液中蒸发掉酒精，得到600ml溶液B2。
向溶液B2中加入3400ml酒精，得到85％酒精溶液，该溶液在冷却的温度(0-4℃)下静置24小时，然后过滤。所得4000ml滤液被蒸发和浓缩至600ml，得到溶液B3。
所得溶液B3与250ml上述得到的溶液A及3g吐温80混合，然后通过加入蒸馏水调整混合物总体积为约1L。所得溶液用2N NaOH调整pH为7.5-8.0，然后根据韩国药典通则中描述的制备注射剂的方法，制备成可注射制剂形式。
实施例2口服组合物的制备(片剂)30g姜黄和30g石菖蒲被精细地研磨，得到粉末A。取白花蛇舌草，虎杖和山豆根每种45g，重楼和赤芍每种30g，和龙胆草，大黄及连翘每种15g，将它们混合。向混合物中加入2.4L水，并静置24小时。加热该混合物提取1.5小时，冷却，然后过滤得到滤液B和残余物。加热下，残余物用约1.6L的水提取1小时，冷却，然后过滤得到滤液。该滤液与上述得到的滤液B合并。加热将合并滤液浓缩，然后冷却得到溶液C。将上述得到的粉末A加入溶液C中，并彻底混合。所得混合物在低于60℃温度下干燥，冷却，然后粉碎，得到74.4g的天然药物的混合粉末(其中作为提取液的溶液C的收率是14.4g(约6％)，且天然药物的总收率约24.8％)。根据韩国药典通则中描述的制备片剂的方法，所得粉末被制备成片剂，得到每一药片含800mg混合天然药物粉末的片剂。
实施例3口服组合物的制备(胶囊)姜黄，人参，枸杞，五味子，石菖蒲，柴胡，茵陈，大青叶和黄芩各30克，和鳖甲，Cumarae longae rhizoma，当归每种15g被精细地研磨得到粉末A。取白花蛇舌草，虎杖和山豆根每种45g，重楼，黄芪，山楂，赤芍和白茅根每种30g，和龙胆草，大黄，连翘和三七每种15g混合。向此混合物中加约3.5L水并静置24小时。混合物加热提取1.5小时，冷却，然后过滤得到滤液B和残余物。加热，残余物用2.5L水提取1小时，冷却，然后过滤得到滤液。此滤液与上面所得滤液B合并。合并的滤液加热浓缩，然后冷却得到溶液C。上面所得粉末A加入溶液C中，并彻底混合所得混合物，并在低于60℃温度下干燥，冷却，然后研磨得到245.7g天然药物混合物粉末(其中作为提取物的溶液C的收率为20.7g(约6％)，且天然药物的总收率约为70％)。根据韩国药典通则中描述的制备胶囊的方法，所得粉末被制备成硬胶质胶囊，得到每一胶囊含500mg混合天然药物粉末的硬明胶胶囊。
上述实施例1中制备的注射剂和实施例2或3中制备的口服制剂最后或以套装的形式生产，其中两种制剂包在一个包装中，或以独立包装分别包装，因此当它们被用于临床目的时可以同时使用。
为了确定根据本发明草药制剂---其中可注射组合物(A)和口服组合物(B)组合在一起，对肝癌的防治效果，进行了以下实验。在下述实验中，可注射制剂(A)代表实施例1中制备的注射剂，而口服制剂(B)代表实施例2中制备的片剂，每种制剂所给量表示在它们被制成注射剂和片剂之前的天然药物提取物和混合天然药物的量。
实验例1对由半乳糖胺诱发的急性肝病的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Sprague-Dawley鼠被随机地分为下列8组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组腹腔给药半乳糖胺500mg。
③测试组1经口给药口服剂(B)40mg/kg。
④测试组2经口给药口服剂(B)200mg/kg。
⑤测试组3腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
⑥测试组4腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
⑦测试组5分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
⑧测试组6分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在此实验中，口服剂(B)是以生理盐水悬浮液的形式给药，而可注射制剂(A)是以稀释在5％的葡萄糖溶液中给药。除正常组外，对照组和所有测试组，都经腹腔以500mg/kg的半乳糖胺给药。其后连续7天的每天下午，测试组经口和/或经腹腔通过给予口服制剂B和/或可注射制剂(A)进行治疗。在此期间，每个正常组和对照组都经口给以10ml生理盐水。为作血液分析，在最后给予测试药品8小时后，从眼睑静脉丛取血，然后以4000rpm离心10分钟得到血清。用血液分析仪对血清进行GOT(谷草转氨酶)，GPT(谷丙转氨酶)，ALP(碱性磷酸酯酶)和T-BIL(总胆红素)浓度测定。所得结果在下列表1中描述。
表1
从上述表1结果可见，在半乳糖胺损害的肝脏中测得的GPT,GOT,ALP和T-BIL的增高，通过口服制剂B和可注射制剂(A)(测试组5和6)联合给药，与单独口服给药(测试组1和2)或可注射制剂(测试组3和4)给药相比，已大大地减弱了。特别地，也应注意到，与低剂量给药(测试组5)相比，大剂量给药(测试组6)给出的值更接近正常组中测得的值。由此结果可以认为，以可注射组合物与口服组合物联合给药这样设计的本发明草药制剂，可有效地治疗由半乳糖胺造成的肝病。
实验例2对由半乳糖胺诱发的亚急性肝病的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Sprague-Dawley鼠被任意地分为下列6组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组经腹腔给药半乳糖胺500mg。
③测试组1经口给药口服剂(B)40mg/kg。
④测试组2经口给药口服剂(B)200mg/kg。
⑤测试组3分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
⑥测试组4分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在此实验中，口服剂(B)是以生理盐水悬浮液的形式给药，而可注射制剂(A)是以稀释在5％的葡萄糖溶液中给药。在连续14天的每天早晨，每个测试组每次只经口给口服剂(B)或同时每次经腹腔给可注射制剂(A)进行治疗。在此期间，每个正常组和对照组都经口给以10ml生理盐水。其后，在从给予测试药品开始的第7天到最后一天的期间内，每天给予测试药品4小时后，除正常组外，对照组和所有测试组，都经腹腔给以500mg/kg的半乳糖胺。为作血液分析，在末次给药半乳糖胺24小时后，从眼睑静脉丛取血，然后以4000rpm离心10分钟得到血清。用血液分析仪对血清进行GOT,GPT,ALP和T-BIL浓度测定。所得结果在下列表2中描述。
表2
从上述表2结果可见，与实验1中的诱发急性肝病的对照组相比，本实验的对照组中由半乳糖胺长时期给药诱发的亚急性肝病，显示所有GPT,GOT,ALP和T-BIL的值都有明显增高，因此，在亚急性情况下，肝损害的程度比在急性肝病情况下要严重得多。此外，如同实验例1，口服剂(B)与可注射制剂(A)联合给药的测试组3和4中测得的所有GPT,GOT,ALP和T-BIL的值都低于只给口服剂(B)的测试组1和2所测得的值。特别地，也可注意到，大剂量给药(测试组4)给出的值大大低于低剂量给药(测试组3)的值。
实验例3对四氯化碳(CCl4)诱发的亚急性肝病的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Sprague-Dawley鼠被任意地分为下列4组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组经口给药25％四氯化碳3ml/kg。
③测试组1分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
④测试组2分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在此实验中，口服剂(B)是以生理盐水悬浮液的形式给药，和可注射制剂(A)是以稀释在5％的葡萄糖溶液中给药。在连续21天的每天早晨，每一测试组分别经口和经腹腔，并行地给予口服剂(B)和可注射制剂(A)治疗。在此期间，每一正常组和对照组都经口给予10ml生理盐水。其后，在从给予测试药品开始的第7天到最后一天的期间内，每天给予测试药品4小时后，除正常组外，对照组和所有测试组，都经腹腔按3ml/kg的量给以溶解在橄榄油中的25％半乳糖胺。为作血液分析，在四氯化碳末次给药24小时后，从眼睑静脉丛取血，然后以4000rpm离心10分钟得到血清。用血液分析仪对血清进行GOT,GPT,ALP和T-BIL浓度测定。所得结果在下列表3中描述。
表3
<p>从上述表3结果可见，甚至当肝脏由比半乳糖胺具更强侵害力的四氯化碳诱发而损害时，与对照组比较，按口服剂(B)和可注射制剂(A)联合给药这样设计的本发明草药制剂，有意义地降低了所有GPT,GOT,ALP和T-BIL的值。
实验例4对酒精诱发的急性肝病的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Sprague-Dawley鼠被任意地分为下列6组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组按6g/kg的量口服酒精。
③测试组1经口给药口服剂(B)40mg/kg。
④测试组2经口给药口服剂(B)200mg/kg。
⑤测试组3分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
⑥测试组4分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在此实验中，口服剂(B)是以生理盐水悬浮液的形式给药，而可注射制剂(A)是以稀释在5％的葡萄糖溶液中给药。在连续14天的每天早晨，每一测试组每次只经口给口服剂(B)或同时每次经腹腔给可注射制剂(A)进行治疗。在此期间，每一正常组和对照组都经口给予10ml生理盐水。其后，在给予测试药品的最后一天的下午，除正常组外，对照组和所有测试组，都按6g/kg的量口服酒精。为作血液分析，在酒精末次服用24小时后，从眼睑静脉丛取血，静置30分钟，然后离心得到血清。根据游离甘油比消光法，通过测定450nm处光密度，测定血清中甘油三酸酯(TG)的活性。所得结果在下列表4中描述。
表4
从上述表4结果可见，由酒精诱发急性肝病的情况下，与对照组比较，按口服剂(B)和可注射制剂(A)联合给药这样设计的本发明草药制剂，显著地降低了甘油三酸酯的活性。因此，可以注意到，本发明草药制剂对防止肝脏遭受酒精造成的急性肝损害是有效的。
实验例5对酒精诱发的亚急性肝病的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Sprague-Dawley鼠被任意地分为下列6组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组按6g/kg的量口服酒精。
③测试组1经口给药口服剂(B)40mg/kg。
④测试组2经口给药口服剂(B)200mg/kg。
⑤测试组3分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
⑥测试组4分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在此实验中，口服剂(B)是以生理盐水悬浮液的形式给药，而可注射制剂(A)是以稀释在5％的葡萄糖溶液中给药。在连续21天的每天早晨，每一测试组每次只经口给口服剂(B)或同时每次经腹腔给可注射制剂(A)进行治疗。在此期间，每一正常组和对照组都经口给予10ml生理盐水。其后，在从给予测试药品开始的第7天到最后一天的期间内，除正常组外，对照组和所有测试组，都按6g/kg的量口服酒精。为了血液分析，在酒精末次服用24小时后，从眼睑静脉丛取血，静置30分钟，然后离心得到血清。根据游离甘油比消光法，通过测定450nm处光密度来测定血清中甘油三酸酯(TG)的活性。所得结果在下列表5中描述。
表5
从上述表5结果可见，在由长期服用酒精诱发急性肝病的情况下，与对照组相比，按口服剂(B)和可注射制剂(A)联合给药这样设计的本发明草药制剂，显著地降低了甘油三酸酯的活性。因此，可以注意到，本发明草药制剂对防止肝脏遭受连续饮用酒精造成的肝损害是有效的。
实验例6对慢性肝癌的作用作为实验动物，重150-200g的雄性Fisher344鼠被任意地分为下列4组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组经口给以DEN(二乙基亚硝胺)和0.03％AAF(乙酰氨基芴)。
③测试组1分别经口给药口服剂(B)40mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)70μl/kg。
④测试组2分别经口给药口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给药可注射制剂(A)350μl/kg。
在这些测试动物中，肝癌是根据如下描述的Solt-Farber标准方法[见Solt D.和Farber E.(1976)，化学致癌作用分析新原理，自然263:706-708]诱发的。按200mg/kg的量经腹腔给以DEN(二乙基亚硝胺)，且2周后，经口给以0.03％AAF(乙酰氨基芴)10周。服用AAF10周后再过3周后，进行50％的半肝切除以诱发肝癌。在服用致癌材料(DEN和AAF)的全部时间(即12周)内，每一正常组和对照组都经口给予10ml生理盐水，而测试组1和2都按上述量给予根据本发明的草药制剂。
为作血清分析，从活到实验结束的实验动物的腹腔静脉取血，然后在微离心管内以4000rpm离心10分钟以分离血清。分离的血清用血液分析仪进行GOT和GPT酶活性，ALP活性，和T-BIL的测定。此外，根据游离甘油比消光法，通过测定540nm处光密度来测定血清中甘油三酸酯(TG)活性。所得结果在下列表6中描述。
表6
从上述表6结果可见，与对照组相比，对诱发肝癌鼠，按口服剂(B)和可注射制剂(A)联合给药这样设计的本发明草药制剂，显著地降低了所有GPT,GOT,ALP,T-BIL和TG的值。因此，可以注意到，本发明草药制剂可以有效地阻止肝癌的发展。
此外，在实验完成后，从各个实验动物中提取肝脏，然后进行肉眼观察。结果显示在图1。图1可见，与正常组相比，用肉眼观察，在对照组中可以清楚地观察到结节，但较小，而在服用本发明草药制剂的测试组1和2中则结节不明显。因此，已观察到，通过服用本发明草药制剂，肝癌的发展程度明显不同于对照组中的情形。进一步地，对照组和测试组2中的鼠的肝组织分别用Masson-Tricrome(图2和4)或H&E(苏木精和曙红)(图3和5)染色。结果可以观察到，对照组的肝脏(图2和3)显示纤维化和清晰的结节以及大多数细胞具有深红色的细胞质和清楚的核。与此相反，测试组2的肝脏中，类似在对照组中的纤维化和清晰的结节未被观察到，但是观察到许多细胞变成嗜酸细胞，透明细胞或空细胞，且核和细胞核的尺寸比对照组中的核要小。从这些结果可以认为，本发明草药制剂可以阻止肝脏的纤维化和肝细胞的过度增生。
实验例7与龙胆泻肝汤(Yongdamsakantang)和虎杖的联合给药相比，本发明草药制剂对慢性肝癌的作用为了比较根据本发明的草药制剂与龙胆泻肝汤(龙胆草，地黄，柴胡，山楂，黄芩，木通，车前，泽泻，当归，甘草)--已知该药对肝癌相对有效，和虎杖的提取物的联合给药对肝癌的作用，进行了下列实验。
作为实验动物，重150-200g的雄性SD鼠被任意地分为下列4组，这样每组包括10只动物①正常组只给生理盐水。
②对照组经口给以DEN和0.03％AAF。
③测试组1分别经口给口服剂(B)200mg/kg和经腹腔给可注射制剂(A)350μl/kg。
④测试组2经口同服200mg/kg的龙胆泻肝汤和200mg/kg的虎杖的提取物。
在这些测试动物中，肝癌是根据下述Solt-Farber标准方法诱发的。按200mg/kg的量经腹腔给以DEN，并在2周后，经口给以0.03％AAF10周。服用AAF10周后再过3周后，进行50％的半肝切除以诱发肝癌。在服用致癌物质(DEN和AAF)的全部时间(即12周)内，每一正常组和对照组都经口给予10ml生理盐水，而测试组1和2都按上述量给予测试制剂。
为作血清分析，从活到实验结束的实验动物的腹腔静脉取血，然后在微离心管内以4000rpm离心10分钟以分离血清。分离的血清用血液分析仪进行GOT和GPT酶活性，ALP活性，和T-BIL的测定。所得结果在下列表7中描述。
表7
从上述表7结果可见，与龙胆泻肝汤和虎杖的提取物联合给药的测试组2相比，对测试组1的诱发致癌鼠，用按口服剂(B)和可注射制剂(A)联合给药这样设计的本发明草药制剂治疗，显著地降低了所有GPT,GOT,ALP,T-BIL和TG的值。因此，可以知道，与已知草药制剂相比，本发明草药制剂可以有效地阻止肝癌的发展。
权利要求
1．治疗肝癌的草药制剂，其包括含有白花蛇舌草，姜黄，虎杖和山豆根作为主要天然药物的可注射组合物(A)，和含有白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，姜黄和石菖蒲作为主要天然药物的口服组合物(B)。
2．根据权利要求1的治疗肝癌的草药制剂，其中可注射组合物(A)中含有白花蛇舌草，姜黄，虎杖和山豆根，以天然药物的干基重量计，其比例为2-10∶2-10∶2-10∶0.1-5。
3．根据权利要求2的治疗肝癌的草药制剂，其中可注射组合物(A)中含有白花蛇舌草，姜黄，虎杖和山豆根，以天然药物的干基重量计，其比例为5∶5∶5∶2。
4．根据权利要求1的治疗肝癌的草药制剂，其中可注射组合物(A)进一步含有一种或多种选自包括大青叶，山豆根，茵陈，柴胡，苍术，泽泻，冬虫夏草，大黄，板兰根，龙胆草，黄芩和重楼的补充天然药物。
5．根据权利要求1的治疗肝癌的草药制剂，其中口服组合物(B)含有白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，Curcumae longae rhizoma和石菖蒲，以天然药物的干基重量计，含有比例为1-10∶1-10∶1-10∶0.5-8∶0.5-8∶0.5-8∶0.5-8∶0.1-5∶0.1-5∶0.1-5。
6．根据权利要求5的治疗肝癌的草药制剂，其中口服组合物(B)白花蛇舌草，重楼，虎杖，山豆根，龙胆草，大黄，连翘，赤芍，姜黄和石菖蒲，以天然药物的干基重量计，其比例为3∶3∶3∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1。
7．根据权利要求1的治疗肝癌的草药制剂，其中口服组合物(B)进一步含有一种或多种选自包括冬虫夏草，熊胆，羚羊角，玄参，丹参，板兰根，黄芪，山楂，白茅根，鳖甲，Cumarae longae rhizoma，当归，人参，枸杞，五味子，柴胡，三七，茵陈，大青叶和黄芩的补充天然药物。
8．根据权利要求1的治疗肝癌的草药制剂，其中可注射组合物(A)和口服组合物(B)以套装形式包装在一起。
全文摘要
本发明涉及一种防治肝癌的草药制剂。更明确地说,本发明涉及一种草药制剂,该药剂包括特别是对乙型肝炎病毒具有良好防治效果并含4种主要天然药物,即白花蛇舌草,姜黄,虎杖和山豆根的可注射组合物;和对脂肪肝和肝硬变有防治效果并含十种天然药物即白花蛇舌草,重楼,虎杖,山豆根,龙胆草,大黄,连翘,赤芍,姜黄和石菖蒲的口服组合物,通过两种组合物的联合给药,能有效地阻止包括肝炎,脂肪肝和肝硬变的肝脏疾病发展成为肝癌,并治疗肝癌。
文档编号A61K36/00GK1216256SQ9812024
公开日1999年5月12日 申请日期1998年8月14日 优先权日1997年11月5日
发明者李正植 申请人:参天堂制药株式会社