专利名称：一种新的人金属硫蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人金属硫蛋白L(Metallothionein-L，简称为“MTL”)的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是MT的异构体之一。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
金属硫蛋白(MT)是一个低分子量的、与重金属结合的蛋白家族，每个MT含有两个金属硫簇，能与7至12个重金属原子结合，其半胱氨酸含量高，并且不含芳香族氨基酸，分子量一般小于10kDa。MT广泛存在于动物和植物中，在原核生物中也有发现。在哺乳动物中，MT的半胱氨酸残基极度保守，通过硫醇键与锌、铜、钙、铬等重金属原子结合。在人中，至少有10到12个基因编码MT，这些基因被分为两类MT-Ⅰ和MT-Ⅱ(分类标准是依据基因编码的蛋白在DEAE-纤维素上的洗脱位置，与结构或功能上的相似无必然联系)，MT-Ⅰ和MT-Ⅱ在大多数组织中表达。后来又发现MT-Ⅲ、MT-Ⅳ，分别只在脑和复层鳞状表皮中表达(Masters．B．A．et al Proc．Natl．Acad．Sci．USA．1994，91584-588)。MT具有很强的可诱导性，可被金属、糖皮质激素、某些毒物、细胞因子及应激因素诱导合成(周杰昊等，1995．生理科学进展2629-34)MT能解毒金属，在发育过程中调节锌和铜的体内平衡，参与金属代谢和解毒，MT在消除自由基方面也有作用，在门克氏综合症(Menkes disease)、鼠花斑状表型、肝豆状核变性(Wilson’s disease)中，MT可能保护机体免受铜毒害。另外MT与某些抗肿瘤化疗药物，特别是顺二胺二氯铂(cDDP)相互作用，可减轻其细胞毒性。
MT的克隆工作开展顺利，在人中就有多个MT基因的异构体被克隆。1982年，Karin等人首先克隆到MT的cDNA序列(Karin，M．et al．1982，Nucl．Acid Res．103165-3173)。人MT-IIA(Karin，M．et al． 1982．Nature 299797-802)、MT-IA(Richards，R．I．et al．1984．Cell 37263-272)、MT-IE、MT-IF(Schmidt，C．J．etal．1985 J．Biol．Chem．2603672-3675)的基因组序列也陆续分离克隆，还有人的一些假基因克隆工作(ψMT-IIB、ψMT-IC、ψMT-ID、ψMT-IG、ψMT-I、φMT-IH)也被报道。其他物种中的MT cDNA(小鼠MT-Ⅰ、大鼠MT-Ⅰ、猴MT-Ⅰ和MT-Ⅱ、中国仓鼠MT-Ⅰ和MT-Ⅱ、绵羊MT-Ⅰ)和基因组DNA(小鼠MT-Ⅰ和MT-Ⅱ)的克隆也进展顺利(see ref．Hamer，D．H．1986．Ann．Rev．Biochem．55914-951)。
然而在本申请之前，还没有分离和公开过本发明的MTL。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸被命名为人金属硫蛋白L(human Metallothionein-L，简称为“人MTL”或“hMTL”)。
本发明的另一个目的是提供一种新的人MTL蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的MTL多肽的方法。
本发明还提供了这种人的MTL核酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人MTL蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人MTL蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人MTL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人MTL蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人MTL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人MTL蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为247个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO．3，其中开放读框位于35-220位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人MTL蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO．3中35-220位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO．3序列的编码框35-220位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO．3中35-220位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO．4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人MTL相同功能的蛋白的、SEQ ID NO．4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-15个，最佳地1-6个)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加数个(通常为30个以内，较佳地为15个以内，更佳地为9个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人MTL蛋白多肽”指具有人MTL蛋白活性的SEQ ID NO．4序列的多肽。该术语还包括具有与人MTL相同功能的、SEQ ID NO．4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人MTL蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人MTL DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人MTL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人MTL多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人MTL多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人MTL多肽序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约40个连续氨基酸，更佳地至少约50个连续氨基酸，最佳地至少约60个连续氨基酸。
发明还提供人MTL蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人MTL多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人MTL保守性变异多肽”指与SEQ ID No．4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括人MTL多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人MTL的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人MTL多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人MTL的核酸分子。
本发明还包括检测人MTL核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人MTL多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人MTL DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MTL基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MTL基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MTL蛋白的分子，也包括那些并不影响人MTL蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人MTL基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No．4，946，778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MTL基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MTL或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本发明的抗体包括能阻断人MTL功能的抗体以及不影响人MTL功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MTL基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MTL基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E．Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人MTL核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施例中，人MTL的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肝λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物--A5′-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3′(SEQ ID NO．1)为正向引物，寡核苷酸B5′-ACATCTGGGAGAAGAGCTGTTGC-3′(SEQ ID NO．2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断约为250bp的目的片段(SEQ ID NO3)。
MT能解毒金属，在发育过程中调节锌和铜的体内平衡，参与金属代谢和解毒，MT在消除自由基方面也有作用，在门克氏综合症(Menkes disease)、鼠花斑状表型、肝豆状核变性(Wilson’s disease)中，MT可能保护机体免受铜毒害。另外MT与某些抗肿瘤化疗药物，特别是顺二胺二氯铂(cDDP)相互作用，可减轻其细胞毒性。
本发明的发现和分离出的这种新的人金属硫蛋白，是研究金属硫蛋白的有用工具。此外，由于本发明的人MTL具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
在附图中，
图1为本发明的人MTL与人MT-1B(sp|P07438)、人MT-1E(sp|P04732)、人MT-1I(sp|P80295)等金属金属硫蛋白的共4种蛋白的氨基酸序列同源比较图。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”标出，相似的氨基酸用“·”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人MTL的cDNA序列的克隆和测定1．引物扩增以人肝λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物--A5′-TCGCTTGAGATCTCCAGCCTTAC-3′(SEQ ID NO．1)为正向引物，寡核苷酸B5′-ACATCTGGGA GAAGAGCTGTTGC-3′(SEQ ID NO．2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的长度约为250bp的PCR目的片段A／B。
2．PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A／B与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用SequiThermEXCEL TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对插入片段进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共247bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于35-220位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人MTL的氨基酸序列，共61个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
实施例2同源比较用本发明的人MTL的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，在核苷酸水平上分别与鼠的MT(emb|V01533)、人MT-IR(emb|X97261)、人MT(emb|X64177)、人MT-IL(ref|NM_002450．1|)等有较高同源，同一性分别为93％、91％、89％、90％。同源蛋白比较也支持此序列的正确，在氨基酸水平上MTL推导蛋白与人MT-1B(sp|P07438)、人MT-1E(sp|P04732)、人MT-1I(sp|P80295)等金属金属硫蛋白的同一性分别为86％、86％、85％(四者同源比较见图1)。
哺乳动物的MT蛋白的特征有由60-68个氨基酸残基组成，其中半胱氨酸占23-33％，约有20个，分子量小于10kDa，并在氨基端含有一段由19个残基组成的一致顺序C-x-C-[GSTP]-x(2)-C-x-C00-x(2)-C-x-C-x(2)-C-x-K(其中C为半胱氨酸，x为任意氨基酸，数字表示氨基酸数目，[GSTP]表示这四个氨基酸中的任意一个)。本分明MTL符合以上特征由61个氨基酸残基组成，其中半胱氨酸20个，占33％，分子量约为6kDa，而且位于13-31位的序列13CACTGSCKCKECKCTSCKK31符合一致顺序。因此，这表明本发明的人MTL是MT的又一个异构体。
根据结构决定功能，结构相似功能相关的生物学原理，可以根据已知的不同物种中的MT基因及其编码蛋白的功能来推测本发明MTL的生物学功能。
现有的研究都表明，金属硫蛋白具有重要的诸如解毒等作用，而且与某些疾病也存在密切的相关性。例如，研究表明MT与金属代谢有关。早期实验表明MT对重金属有解毒作用对动物预给Zn诱导MT合成可产生对Cd细胞毒性的抵抗，丧失MT活性能力的哺乳动物以及缺乏MT的组织对Cd毒性高度敏感。但后来的研究发现Cd-MT具有细胞毒性，血浆中Cd-MT对妊娠期母体血管内皮细胞有损伤作用，引起内皮细胞炎症、蛋白尿、血管痉挛、水肿等症状产生，有人认为血浆中Cd-MT可能是妊娠中毒症的主要原因(Chisolm，J．C．et a1．3rdInternational Meeting on Metallothionein(Abstract)Dec8-11，1992．94)。
Menke氏病是一种X-连锁的儿科疾病，其特征是体内铜分布失调，铜以及一些铜依赖性酶水平下降，Cu-MT在除肝脏以外的组织过度积累。鼠花斑状表型的突变体(一种很好的Menkes氏病动物模型)与Menkes氏病患者的一些特征一致。Wilson氏病也在铜代谢方面有障碍，先天性铜在肝和脑中先天性过度积蓄。这三种病变都通过铜代谢影响MT的基因调控，反之它们的治疗机制可能是通过MT进行的。近年来对Wilson氏病进行补Zn治疗，取得了较好的疗效。患者口服Zn盐后诱导肠粘膜细胞内MT水平增高，由于MT与Cu结合能力强于与Zn结合的能力，因此Cu-MT可随粘膜脱落到肠腔而由粪便排出，血浆Cu浓度减低，从而达到给Zn盐促排Cu的效果(Gurkan．，V．Y．et al．1992．J．Lab．Clin．Med．120380-386)。
MT能消除自由基。1985年，Vasak离体实验表明，MT可以消除由于辐射形成的OH自由基，而且在与GSH作用后，MT得到再生(Thonally，P．et al．1985．Bioch．Biophys．Acta．82736-44)。13μmol／L的MT与10μmol／L的GSH在保护牛胸腺DNA免受áOH损伤方面具有同等效力。对Cd耐受的中国仓鼠V79细胞含有较多的MT，与对照组相比，对H2O2、O2-引起的耐受力大大提高(Temopleton，D．M．et al 1991．Riordan JF and Vallee BL ed．Methods of Enzymology．Vol．205，11-24)。在临床医学中关于MT抗自由基的作用也有研究，Mulder等发现氧自由基与炎性肠病的组织损伤有关，通过测定病人中的MT浓度发现，MT的浓度为对照组细胞胞浆＞炎性肠病非炎性细胞胞浆＞炎性肠病炎性细胞胞浆，这一发现可能有助于阐明炎性肠病的部分病因，即肠上皮损伤可能是由于某种原因使消除自由基的物质减少，而导致氧自由基产消失衡(Mulder，T．P．J．et al．1991．Gut．321146-1150)。
MT与cDDP作用，可减轻cDDP细胞毒性。顺二胺二氯铂(cDDP)是一种常用的化疗药，但由于其对肾组织的损伤，应用受到很大限制。1985年，Imura等预给小鼠皮下注射硝酸铋(BSN)致使cDDP的肾毒性减轻。Saijo等进一步研究发现，BSN可以特异诱导正常肾脏组织合成MT，而对肾癌和正常组织并不诱导MT产生；还发现cDDP对预给Bi盐的动物肾脏损伤小，而cDDP杀伤肿瘤的效果未减。其机制可能与Bi盐在肾组织中诱导MT合成，而在肿瘤组织中并不诱导MT合成有关(Saijo，N．et al Mrtallothionein 111，BaselBirkhauser Verlag，1993．279-292)。
另一方面，有研究表明MT与肿瘤抗药性有关。对几种抗cDDP细胞系进行MT含量分析，发现四种抗cDDP的肿瘤细胞系胞内MT含量比相应母系高2-4倍；用人MT-ⅡA DNA片段为探针进行核酸杂交，发现抗cDDP的细胞株中的MT mRNA含量比母系高几倍甚至十几倍；将人MT-ⅡA DNA片段转入原来对cDDP敏感的鼠细胞中，发现该细胞系对cDDP的抗性提高了44倍，胞内MT含量也提高了10倍(Kellley，S．L．et al．1988．Science 2411813-1815)。
肝脏中富含MT，MT与肝脏疾病有一定关系。通过放免分析测定肝病患者肝MT含量，发现慢性肝炎病人的肝MT含量比正常人高，而肝硬化病人肝MT含量比正常人低，在动物肝硬化模型中用Zn诱导肝MT的合成，可明显抑制肝组织纤维化，这表明肝MT含量下降可能与肝硬化病人组织纤维化有关(see ref．周杰昊等，1995．生理科学进展2629-34)。Mulder等人观察原发性胆汁性肝硬变与MT的关系，发现原发性胆汁性肝硬变病人血浆MT浓度随病情加重而上升，因而MT水平可作为原发性胆汁性肝硬变病情发展的一个监控指标(Mulder，T．P．J．et al．1991．Hepatology 141008-1012)。
本发明的人MTL除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人MTL还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人MTL的N端与小鼠MT-Ⅱ的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人MTL的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人MTL核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人MTL的表达水平或者抑制人MTL的过度表达。本发明的人MTL蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人MTL缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人MTL在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A／B为模板，将编码人MTL的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．5和6)进行扩增，获得人MTL cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5-CAAGGTCGACATGGACCCCAACTGCTCCT-3′(SEQ ID NO．5)，该引物含有SalⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人MTL编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO．6)，该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人MTL的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子／操纵子(P／O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacⅠ阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒测序验证人MTL的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O／N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0．4-0．6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导启动P／O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人MTL。用6M盐酸胍(pH5．0)从柱中洗脱人MTL。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5．0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w／v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约6kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO．4的序列一致。
实施例4人MTL在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A／B为模板，将编码人MTL的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO．7和8)进行扩增，获得人MTL cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-CAAGAAGCTTATGGACCCCAACTGCTCCT-3′(SEQ ID NO．7)该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人MTL编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-TAGGGGATCCTCAGGCACAGCAGCTGCAG-3’(SEQ ID NO．8)该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人MTL的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg／ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的克隆。抽提质粒测序验证人MTL的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8．0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为6kDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO．4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg／0．2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg／0．2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人MTL基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人复旦大学(ⅱ)发明名称一种新的人金属硫蛋白及其编码序列(ⅲ)序列数目8(2)SEQ ID NO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．1TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TAC23(2)SEQ ID NO．2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2ACATCTGGGA GAAGAGCTGT TGC23(2)SEQ ID NO．3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度247bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID NO．3TCGCTTGAGA TCTCCAGCCT TACCGCGGCT CGAAATGGAC CCCAACTGCT CCTGCACCAC 60TGGTGTCTCC TGCGCCTGCA CCGGCTCCTG CAAGTGCAAA GAGTGCAAAT GCACCTCCTG 120CAAGAAGAGC TGCTGCTCCT GCTGCCCCGT GGGCTGTGCC AAGTGTGCCC ACGGCTGTGT 180CTGCAAAGGG ACGTTGGAGA ACTGCAGCTG CTGTGCCTGA TGTGGGAACA GCTCTTCTCC 240CAGATGT 247(2)SEQ ID NO．4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度61个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．4Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Thr Thr Gly Val Ser Cys Ala Cys 15Thr Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys 30Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala 45His Gly Cys Val Cys Lys Gly Thr Leu Glu Asn Cys Ser Cys Cys 60Ala 61(2)SEQ ID NO．5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．5CAAGGTCGAC ATGGACCCCA ACTGCTCCT29(2)SEQ ID NO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．6TAGGAAGCTTTCAGGCACAGCAGCTGCAG 29(2)SEQ ID NO．7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．7CAAGAAGCTTATGGACCCCAACTGCTCCT 29(2)SEQ ID NO．8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO．8TAGGGGATCCTCAGGCACAGCAGCTGCAG 29
权利要求
1．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列杂交。
2．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO．4所示的序列。
3．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列。
4．一种分离的人MTL蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO．4序列的多肽。
6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7．一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8．一种产生具有人MTL蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人MTL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人MTL蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO．3中从核苷酸35-220位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人MTL蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人MTL蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人MTL蛋白活性的多肽。
9．一种能与权利要求4所述的人MTL蛋白多肽特异性结合的抗体。
10．一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人金属硫蛋白L(Metallothionein－L,简称为“MTL”)的cDNA序列,该cDNA编码的蛋白MTL是金属硫蛋白MT的异构体之一。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号A61K39/395GK1290747SQ99108849
公开日2001年4月11日 申请日期1999年6月24日 优先权日1999年6月24日
发明者余龙, 张宏来, 傅强, 赵勇, 赵寿元 申请人:复旦大学