肌醇六磷酸酶制剂的制作方法

专利名称：肌醇六磷酸酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及液体和干燥的肌醇六磷酸酶制剂，其具有通过稳定剂的添加或通过交联而获得的增强的稳定性、优选地热稳定性。
尽管在饲料中存在大量肌醇六磷酸磷形式的磷酸盐，但单胃动物象猪和家禽缺乏利用这种形式的磷酸盐的能力。肌醇六磷酸的碱或碱土盐主要天然存在于谷类中。由于单胃动物不能利用这种形式的磷酸盐，所以通常将磷酸盐加入动物饲料中。
另一方面，已知一种称为肌醇六磷酸酶的酶(肌性肌醇六磷酸磷酸水解酶)存在于植物和某些微生物中。肌醇六磷酸酶能通过发酵产生，本领域已知使用肌醇六磷酸酶作为一种动物饲料添加剂，以通过无机磷酸从肌醇六磷酸(肌性肌醇六磷酸)中的释放来提高植物材料的营养价值。通过向动物饲料中添加肌醇六磷酸酶，能降低环境磷污染的水平，因为动物能利用通过肌醇六磷酸酶的应用而从肌醇六磷酸释放的磷酸。
对于饲料应用，一种稳定的优选地热稳定的肌醇六磷酸酶是被普遍关注的，以避免可在配制(例如喷雾干燥、造粒)和饲料加工过程(例如造粒、挤出、膨化)中发生的问题，其间暂时的高温(高达80-120℃)和剪切应力可影响蛋白质的结构并导致所不希望的活性丧失。
Gist-Brocades的国际专利申请WO 93/16175描述了肌醇六磷酸酶的稳定的液体制剂。建议使用尿素和水溶性的多元醇作为稳定剂，由此提到山梨糖醇、甘油和分子量为6000的聚乙二醇。
本发明的一个目的是提高肌醇六磷酸酶的稳定性优选地热稳定性，稳定性被定义为在不同条件下保留活性的能力。该稳定性方面涉及酶的完整的生命周期，包括产生(饲料的发酵、下游加工、配制和热处理)、分配(运输和贮存)和最终应用。对于商业上感兴趣的酶如肌醇六磷酸酶，重要的是在不同的饲料加工过程如造粒、挤出和膨化中耐受所达到的高温(高达80-120℃)，并且在长期贮存中稳定。
本发明中使用的术语“稳定性”涉及一种工业酶的所有特性，包括如活性、特异性、贮存稳定性、机械稳定性、微生物稳定性、毒性、化学组成和物理参数如密度、粘度、潮解性以及颜色、气味和粉尘等方面。本发明的一个优选的方面涉及肌醇六磷酸酶在配制和饲料加工过程如造粒、挤出和膨化中耐受加热灭活的稳定性。
肌醇六磷酸酶广泛应用的一个主要障碍是这些酶在饲料加工过程中耐受灭活所需的热稳定性(80-120℃)的限制。当前可获得的工业化肌醇六磷酸酶全部来源于黑曲霉(A.niger)，对加热灭活具有低的固有耐受力。作为一种选择性或除分子生物学方法之外的方法，本发明通过不同添加剂的添加，以及另一方面通过酶单体化学交联为寡聚体，提高了蛋白质的稳定性优选地热稳定性。
也用所谓的共有肌醇六磷酸酶进行导致本发明的实验，该酶是根据一种理论分子生物学方法开发的肌醇六磷酸酶，与曲霉(Aspergillus)肌醇六磷酸酶相比具有较高的固有稳定性，见欧洲专利申请公开文本897 985。在本发明的实施中，也能使用在实施例3-13中详细描述的共有肌醇六磷酸酶。
本发明公开了不同添加剂的应用，它们作为稳定剂对酶的稳定性优选地热稳定性起作用。
关于能在本发明中优选使用的非配制肌醇六磷酸酶比活性的温度依赖性，根据它们的最大活性能形成三个不同组。在如下温度时达到最大活性对于烟曲霉(A.fumigatus)和黑曲霉肌醇六磷酸酶在55℃，土曲霉(A.terreus)CBS和构巢曲霉(A.nidulans)肌醇六磷酸酶在45℃，共有肌醇六磷酸酶在65℃。选择所测最高温度以上10-15℃的温度(此时非配制的肌醇六磷酸酶完全失活)作为筛选点，用于研究稳定剂对肌醇六磷酸酶热稳定性的作用，即对于构巢曲霉和土曲霉CBS肌醇六磷酸酶为60℃，黑曲霉和烟曲霉肌醇六磷酸酶为65℃，共有肌醇六磷酸酶为75℃。
本发明提供一种稳定的、优选地热稳定的酶制剂，它包含肌醇六磷酸酶和至少一种稳定剂，该稳定剂选自
a)包含5个碳原子的多元醇，优选地是C5糖，更优选地是木糖醇和核糖醇，b)分子量为600到4000Da的聚乙二醇，c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，d)羧甲基纤维素，和e)藻酸钠本发明也提供一种稳定的、优选地热稳定的酶制剂，它包含通过以下方法交联的肌醇六磷酸酶；a)通过与戊二醛的化学反应；或通过b)高碘酸钠的氧化和随后己二酸二酰肼的加入尽管使用从微生物之外的其它来源获得的其它肌醇六磷酸酶是可能的，但优选的是使用微生物产生的肌醇六磷酸酶。在本发明中优选地使用真菌产生的肌醇六磷酸酶，更优选地是选自烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉和黑曲霉。本发明中优选使用的另一种肌醇六磷酸酶是所谓的共有肌醇六磷酸酶。然而，通过遗传工程产生这些肌醇六磷酸酶也是可能的，方法是将从真菌获得的基因转移至宿主生物如细菌(例如大肠杆菌)、酵母或另一种真菌，进一步的细节见如欧洲专利申请公开文本684313和欧洲专利申请公开文本867010。
术语酶制剂包括所有的液体和干燥制剂，其中酶肌醇六磷酸酶可以是商品化的。优选地，这种制剂的肌醇六磷酸酶的来源是从发酵培养液中获得的粗的液体制品。加入所选的稳定剂或交联肌醇六磷酸酶进行液体肌醇六磷酸酶制剂的制备。为获得一种稳定的、优选地热稳定的干燥制剂，肌醇六磷酸酶a)在所选的稳定剂的存在下喷雾干燥或颗粒化，或b)化学交联。
在一种优选实施方案中，液体酶制剂包含作为稳定剂的聚乙二醇，聚乙二醇以10-50％(w/w)的浓度存在于终制剂中。
优选地酶制剂包含分子量为1000-3350Da的聚乙二醇。特别优选的是使用分子量为大约1450的聚乙二醇。分子量略微在优选范围(分别为600Da和4000Da)之外的聚乙二醇仍显示出合乎常理的作用，但不是优选的。聚乙二醇的稳定作用显示为分子量依赖的(见图2和图3)。
在本发明的另一种优选实施方案中，稳定剂是木糖醇或核糖醇。它们都是具有5个碳原子结构的糖醇。优选地以在最终液体制剂中20-60％(w/w)的浓度使用木糖醇和核糖醇。令人惊奇地，木糖醇和核糖醇作为例如烟曲霉肌醇六磷酸酶的稳定剂提高了在65℃测定的比活性，在12.5％浓度的多元醇时提高到11-12U/mg，在25％的浓度时提高到51-90U/mg(见图4)。
在本发明的另一种实施方案中，液体酶制剂包含戊二酸、琥珀酸或丙二酸的二钠盐作为稳定剂，终制剂中盐的浓度范围为10-30％(w/w)。如图6所示，25％浓度的丙二酸盐、琥珀酸盐和戊二酸盐的加入引起烟曲霉肌醇六磷酸酶热稳定性的显著增加，对于丙二酸盐在70℃仍可检测到可观的活性，对于琥珀酸盐和戊二酸盐在65℃仍可检测到。
除此之外，37℃时羧酸盐刺激测定的烟曲霉肌醇六磷酸酶活性，对于丙二酸盐观察到肌醇六磷酸酶活性增加约4倍，对于琥珀酸盐增加2倍，而对于戊二酸盐则有较小的作用。不同浓度(5、10和25％)的丙二酸盐的研究显示，烟曲霉肌醇六磷酸酶的热稳定是浓度依赖的，而酶活性的刺激，至少在该浓度范围内，不是浓度依赖的(见图7)。与这些发现相反，不同浓度(5、10和25％)的单羧酸盐乙酸钠，引起在37℃时烟曲霉肌醇六磷酸酶比活性增加可达2倍，但对于蛋白质的热稳定性只有较小的作用(见图8)。因此，可以推断羧基负责活性调节，而双功能二羧酸盐可能通过离子相互作用稳定肌醇六磷酸酶。丙二酸钠和琥珀酸钠通常使构巢曲霉、土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶的热稳定性提高5-15℃。另一方面，仅对具有相当低的比活性的构巢曲霉和烟曲霉肌醇六磷酸酶观察到肌醇六磷酸酶活性的刺激，而对于土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶则未观察到(见图9和

图10)。
在本发明的另一种实施方案中，酶制剂包含多聚体羧甲基纤维素和/或藻酸钠作为稳定剂，它们在终液体制剂中的浓度为1-20％、优选地1-10％(w/w)。向烟曲霉肌醇六磷酸酶制剂中加入这些多聚体导致肌醇六磷酸酶热稳定性显著增加5-10％。
在本发明的另一种实施方案中，酶制剂包含藻酸盐、优选地藻酸钠作为稳定剂，最优选地以终液体制剂中1-10％(w/w)的浓度。
在本发明的再一种实施方案中，酶制剂包含交联的肌醇六磷酸酶。为了这种稳定的肌醇六磷酸酶形式的制备，以可引起蛋白质寡聚化的浓度向肌醇六磷酸酶中加入戊二醛。
在另一种实施方案中，酶制剂包含通过其糖链交联的肌醇六磷酸酶。交联包括第一步糖残基的高碘酸氧化，随后是生成的醛基与己二酸二酰肼的反应。
根据所用的条件，交联反应能产生酶的多种衍生物，即a)仅与己二酸二酰肼的一个酰肼基反应的修饰的酶分子，b)含或不含分子间交联的分子内交联的酶，以及c)分子间交联的、可溶的寡聚体或不溶的多聚体。
大多数情况下，该反应产生几种形式的混合物。在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中都表达的烟曲霉和共有肌醇六磷酸酶的交联导致寡聚形式的形成。能通过改变酶氧化的程度有效地控制交联的程度。50mM浓度的高碘酸钠应用于5mg/ml的肌醇六磷酸酶溶液时观察到肌醇六磷酸酶的最佳热稳定。对于两种肌醇六磷酸酶，观察到热稳定性在10℃到15℃之间的增加(见图12)。应当指出，甚至不加入己二酸二酰肼，氧化的肌醇六磷酸酶可形成显著量的二聚体、三聚体和四聚体(见图11A)。
本发明的另一方面涉及所列稳定剂作为添加剂用于干燥的/固体肌醇六磷酸酶制剂生产。在本发明的这一实施方案中，稳定剂的加入(1-20％(w/w)的木糖醇/核糖醇、分子量优选地在1000-3350Da之间的1-20％(w/w)的聚乙二醇和/或1-20％(w/w)的二羧酸盐(如丙二酸盐、琥珀酸盐和戊二酸盐)、和/或1-10％(w/w)的多聚体羧甲基纤维素和/或藻酸盐、优选地溶解于100-200ml肌醇六磷酸酶液体(交联的或非交联的)中的藻酸钠)或向标准颗粒混合物中加入固体化合物(包括用作粘合剂的木质素磺酸盐、用作载体的二氧化硅和石膏(gipsum))。这种制剂可导致在高剪切造粒过程后测定的肌醇六磷酸酶活性的回收提高(高达20％)，该方法包括颗粒在流化床干燥器上45℃15分钟的干燥步骤。另外，当这些包含稳定剂的颗粒与饲料混合时，与不含这些添加剂的颗粒相比，它们在饲料加工(例如85℃的造粒方法)后显示回收的酶活性增加。
本发明的另一方面涉及制备用于单胃动物的饲料组合物的方法，方法是向饲料中补加一种根据任何权利要求(1-13)的热稳定的干燥或液体酶制剂。可对补加肌醇六磷酸酶的饲料进行几种饲料加工方法，如挤出、膨化和造粒，其中可出现暂时的高温，热稳定则为有利之处。
本发明的稳定的酶制剂能用于饲料丸粒的实例。可用自来水稀释热稳定的液体酶制剂，以产生具有希望的肌醇六磷酸酶活性(100-200肌醇六磷酸酶单位/g溶液)的溶液。将饲料丸粒转移至机械混合器，在搅拌中将稀释的酶制剂喷射至饲料丸粒上，以产生一种均质的产物，它具有加入的肌醇六磷酸酶活性，如500单位肌醇六磷酸酶/kg饲料丸粒。另外，在对该混合物进行如造粒、膨化或挤出的加工之前，能将干燥的或液体酶制剂直接与磨碎的饲料混合。
本发明的再一方面涉及给单胃动物提供磷的饮食需要的一种方法，其中用根据本发明的饲料饲养该动物，不向饲料中添加另外的磷。
本发明的实验结果显示于如下的附图中。
图1.在实施例1所述的标准测定条件下测定的烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性比较。
图2. 65℃时不同聚乙二醇对烟曲霉肌醇六磷酸酶比活性的影响。
图3. 50％的不同分子量的聚乙二醇溶液对黑曲霉、共有、土曲霉CBS和构巢曲霉肌醇六磷酸酶的热稳定性的影响。对于土曲霉CBS和构巢曲霉肌醇六磷酸酶在60℃测定比活性，黑曲霉肌醇六磷酸酶在65℃测定，共有肌醇六磷酸酶在75℃测定。
图4. 65℃时25％和50％的不同多元醇溶液对烟曲霉肌醇六磷酸酶比活性的影响。
图5.在作为添加剂的50％木糖醇存在下，黑曲霉(A)、共有(B)、构巢曲霉(C)和土曲霉CBS(D)肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图6.在25％浓度的丙二酸二钠、琥珀酸二钠和戊二酸二钠存在下，烟曲霉肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图7.在5％、10％和25％丙二酸二钠存在下，烟曲霉肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图8.在5％、10％和25％乙酸钠存在下，烟曲霉肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图9.在25％丙二酸二钠存在下，黑曲霉(A)、共有(B)、土曲霉CBS(C)和构巢曲霉(D)肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图10.在25％琥珀酸二钠存在下，黑曲霉(A)、共有(B)、土曲霉CBS(C)和构巢曲霉(D)肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图11.
A)用不同浓度的高碘酸钠温育后，烟曲霉肌醇六磷酸酶样品的SDS-PAGE。
B)随后用己二酸二酰肼交联后，(A)中氧化的烟曲霉肌醇六磷酸酶不同样品的SDS-PAGE。
图12.用高碘酸/己二酸二酰肼交联之前及之后，烟曲霉肌醇六磷酸酶和共有肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。
图13.共有肌醇六磷酸酶序列的设计。字母以单字母密码的形式表示氨基酸残基。使用以下序列进行序列排列土曲霉9A-1的phyA(Mitchell等人，1997；自氨基酸(aa)27)、土曲霉cbs116.46的phyA(van Loon等人，1998；自aa 27)、黑曲霉awamori变种的phyA(Piddington等人，1993；自aa 27)、黑曲霉T213的phyA(来源于aa 27)、黑曲霉株NRRL3135的phyA(van Hartingsveldt等人，1993；自aa 27)、烟曲霉ATCC 13073的phyA(Pasamontes等人，1993；自aa 25)、烟曲霉ATCC3 2722的phyA(van Loon等人，1998；自aa 27)、烟曲霉ATCC58128的phyA(van Loon等人，1998；自aa 27)、烟曲霉ATCC 26906的phyA(van Loon等人，1998；自aa 27)、烟曲霉ATCC 32239的phyA(van Loon等人，1998；自aa 30)、Emericella nidulans的phyA(Pasamontes等人，1997a；自aa 25)、Talaromyces thermophilus的phyA(Pasamontes等人，1997a；自aa 24)、以及Myceliophthora thermophila的phyA(Mitchell等人，1997；自aa 19)。使用程序PILEUP计算序列排列。手工修饰缺口的位置。序列排列中特定位置的大写氨基酸残基属于建立共有残基的氨基酸组合。以黑体在计算的共有序列之下显示最终构建的共有肌醇六磷酸酶(Fcp)的氨基酸序列。根据实施例3所述的原则手工填充计算的共有序列中的缺口。
图14.共有肌醇六磷酸酶-1基因(fcp)的DNA序列和用于基因构建的引物的DNA序列。使用程序BACKTRANSLATE(Devereux等人，1984)和高表达的酵母基因的密码子频率表(GCG程序包，9.0)将计算的氨基酸序列(图13)转换为DNA序列。土曲霉cbs.116.46的肌醇六磷酸酶的信号肽与N-末端融合。黑体碱基代表用于产生基因的寡核苷酸序列。另外在序列之上或之下指出了各自的寡核苷酸名称。用下划线标出的碱基代表基因的起始和终止密码子。以斜体写出的碱基显示两个引入的EcoRI位点。
图15.五种担子菌(Basidiomycetes)肌醇六磷酸酶的序列排列和共有序列。字母以单字母密码表示氨基酸残基。开始于圆括号中所示氨基酸残基的卷缘网褶菌(Paxillus involutus)phyA(aa21)和phyA2(aa21，WO 98/28409)、绒毛栓菌(Trametes pubescens)(aa 24，WO 98/28409)、平田头茹(Agrocybe pediades)(aa 19，WO 98/28409)和Peniophora lycii(aa 21，WO 98/28409)的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，用来进行序列排列，并进行称为“Basidio”的相应共有序列的计算(实施例4)。用程序PILEPUP进行序列排列。手工修饰缺口的位置。用程序PRETTY计算共有序列。当将0.5的权重(vote weight)分配给两种卷缘网褶菌肌醇六磷酸酶时，使用权重为1.0的所有其它基因进行共有序列的计算。在程序不能确定共有残基的位置，Basidio序列包含一个破折号。序列排列中特定位置的大写氨基酸残基属于建立共有残基的氨基酸组合。
图16.共有肌醇六磷酸酶-10氨基酸序列的设计。将Thermomyceslanugiosa的肌醇六磷酸酶序列(Berka等人，1998)和五种担子菌的肌醇六磷酸酶的共有序列添加至图13的序列排列中，用程序PRETTY计算改进的共有序列。另外，省略黑曲霉T213的氨基酸序列，因此，对保留的黑曲霉肌醇六磷酸酶序列使用0.5的权重。进一步的信息见实施例14。
图17.共有肌醇六磷酸酶-10的DNA和氨基酸序列。用单字母密码在相应的DNA序列之上写出氨基酸序列。用于装配基因的寡核苷酸序列为黑体字母。与共有肌醇六磷酸酶-1相比改变的寡核苷酸和氨基酸的标记用下划线标出，并以小写突出其相应的三联体密码。由如下的寡核苷酸装配fcp10基因CP-1、CP-2、CP-3.10、CP-4.10、CP-5.10、CP-6、CP-7.10、CP-8.10、CP-9.10、CP-10.10、CP-11.10、CP-12.10、CP-13.10、CP-14.10、CP-15.10、CP-16.10、CP-17.10、CP-18.10、CP-19.10、CP-20.10、CP-21.10、CP-22.10。新合成的寡核苷酸用数字10另外标记。肌醇六磷酸酶包含如下32个交换Y54F、E58A、D69K、D70G、A94K、N134Q、I158V、S187A、Q188N、D197N、S204A、T214L、D220E、L234V、A238P、D246H、T251N、Y259N、E267D、E277Q、A283D、R291I、A320V、R329H、S364T、I366V、A379K、S396A、G404A、Q415E、A437G、A463E。以黑体字母强调的突变显示对共有肌醇六磷酸酶-1的一种稳定作用，这如在共有肌醇六磷酸酶-1中单突变所测定的一样。
图18.用于共有肌醇六磷酸酶-11设计的序列排列。与共有肌醇六磷酸酶-10的设计相反，对于每种担子菌序列使用分配的0.2的权重，作为独立的序列使用所有担子菌肌醇六磷酸酶进行共有肌醇六磷酸酶-11的氨基酸序列的设计。另外，在序列排列中再次使用黑曲霉T213的氨基酸序列。
图19.共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列。用单字母密码在相应的DNA序列之上写出氨基酸序列。替换的氨基酸残基用下划线标出。基因的终止密码子以星号(*)标记。
图20.共有肌醇六磷酸酶-10-热[3]-Q50T-K91A的DNA和氨基酸序列。用单字母密码在相应的DNA序列之上写出氨基酸序列。替换的氨基酸残基用下划线标出。基因的终止密码子以星号(*)标记。
图21.烟曲霉ATCC 13073肌醇六磷酸酶α-突变体的DNA和氨基酸序列。用单字母密码在相应的DNA序列之上写出氨基酸序列。替换的氨基酸残基用下划线标出。基因的终止密码子以星号(*)标记。
图22.共有肌醇六磷酸酶-7的DNA和氨基酸序列。用单字母密码在相应的DNA序列之上写出氨基酸序列。用于装配基因的寡核苷酸序列为黑体字母。用下划线标出了交换的寡核苷酸和氨基酸，并以小写突出其相应的三联体密码。由如下的寡核苷酸装配fcp7基因CP-1、CP-2、CP-3、CP-4.7、CP-5.7、CP-6、CP-7、CP-8.7、CP-9、CP-10.7、CP-11.7、CP-12.7、CP-13.7、CP-14.7、CP-15.7、CP-16、CP-17.7、CP-18.7、CP-19.7、CP-20、CP-21、CP-22。新合成的寡核苷酸用数字7另外标记。与原始共有肌醇六磷酸酶相比，该肌醇六磷酸酶包含如下24个交换S89D、S92G、A94K、D164S、P201S、G203A、G205S、H212P、G224A、D226T、E255T、D256E、V258T、P265S、Q292H、G300K、Y305H、A314T、S364G、M365I、A397S、S398A、G404A和A405S。
图23.共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-10的差示扫描量热(DSC)。将蛋白质样品浓缩为大约50-60mg/ml，并对10mM乙酸钠，pH5.0充分透析。应用10℃/分钟的恒定加热率直到95℃。共有肌醇六磷酸酶-10的DSC(上部图)产生85.4℃的熔解温度，它比共有肌醇六磷酸酶-1的熔点(78.1℃，下部图)高7.3℃。
图24.共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A的差示扫描量热(DSC)。将蛋白质样品浓缩为大约50-60mg/ml，并对10mM乙酸钠，pH5.0充分透析。应用10℃/分钟的恒定加热率直到95℃。共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T的DSC(上部图)产生88.6℃的熔解温度，而发现共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A的熔点为89.3℃。
图25.共有肌醇六磷酸酶-1、共有肌醇六磷酸酶-10和共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T之间最适温度的比较。为了最适温度的测定，在37℃和86℃之间的一系列温度进行肌醇六磷酸酶标准测定。用转化的酿酒酵母株的稀释的上清液进行该测定。上清液中的其它组分显示对最适温度的测定没有影响＾，共有肌醇六磷酸酶-1；☆，共有肌醇六磷酸酶-10；■，共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T。
图26.共有肌醇六磷酸酶-10及其变体热-Q50T和热-Q50T-K91A的pH-依赖的活性分布图和底物特异性。使用标准测定法在不同pH值的适当缓冲液(见实施例11)中测定肌醇六磷酸酶的活性。图a)显示共有肌醇六磷酸酶-10(□)、共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T(.)和共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A(＾)的pH-依赖的活性分布图。图b)显示相应的底物特异性，其测定方法是在标准测定中用指定的化合物替换肌醇六磷酸；空白条，共有肌醇六磷酸酶-10(灰色条，共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T；黑色条，共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A)。数字对应于如下化合物1，肌醇六磷酸；2，磷酸对硝基苯酯；3，磷酸苯酯；4，果糖-1，6-二磷酸；5，果糖-6-磷酸；6，葡萄糖-6-磷酸；7，核糖-5-磷酸；8，DL-甘油-3-磷酸；9，甘油-2-磷酸；10，3-磷酸甘油酸；11，磷酸烯醇丙酮酸；12，AMP；13，ADP；14，ATP。
图27.共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A的pH-依赖的活性分布图和底物特异性。使用标准测定法在不同pH值的适当缓冲液(见实施例11)中测定肌醇六磷酸酶活性。图a)显示Q50T(■)和Q50T-K91A-变体(.)的pH-依赖的活性分布图。图b)显示相应的底物特异性，其测定方法是在标准测定中用指定的化合物替换肌醇六磷酸(空白条，共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T；填充条，共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A)。底物列于图26的图例中。
图28.共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T和共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A的差示扫描量热(DSC)。将蛋白质样品浓缩为大约50-60mg/ml，并对10mM乙酸钠，pH5.0充分透析。应用10℃/分钟的恒定加热率直到95℃。共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T的DSC(上图)显示84.7℃的熔解温度，而发现共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]-Q50T-K91A的熔点为85.7℃。
图29.共有肌醇六磷酸酶-1、共有肌醇六磷酸酶-1-热[3]和共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]之间最适温度的比较。为了测定最适温度，在37℃和86℃之间的一系列温度下进行肌醇六磷酸酶标准测定。用从转化的酿酒酵母株的上清液中纯化的蛋白质进行该测定。○，共有肌醇六磷酸酶-1；□，共有肌醇六磷酸酶-1-热[3]；▲，共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]。
图30.共有肌醇六磷酸酶-1、共有肌醇六磷酸酶-7和黑曲酶NRRL3135的肌醇六磷酸酶的pH-依赖的活性分布图和底物特异性的比较。使用标准测定法在不同pH值的适当缓冲液(见实施例11)中测定肌醇六磷酸酶活性。图a)显示共有肌醇六磷酸酶-1(■)、黑曲酶NRRL 3135的肌醇六磷酸酶(○)和共有肌醇六磷酸酶-7(▲)的pH-依赖的活性分布图。图b)显示相应的底物特异性，其测定方法是在标准测定中用指定的化合物替换肌醇六磷酸(黑色条，黑曲酶NRRL 3135肌醇六磷酸酶；灰色条，共有肌醇六磷酸酶-1；虚线条，共有肌醇六磷酸酶-7)。底物列于图26的图例中。
图31.烟曲霉ATCC 13073及其稳定的α-突变体的肌醇六磷酸酶的差示扫描量热(DSC)，该突变体包含如下氨基酸交换F55Y、V100I、F114Y、A243L、S265P、N294D。将蛋白质样品浓缩为大约50-60mg/ml，并对10mM乙酸钠，pH5.0充分透析。应用10℃/分钟的恒定加热率直到95℃。共有烟曲霉13073肌醇六磷酸酶的DSC(上部图)显示62.5℃的熔解温度，而发现α-突变体的熔点为67.0℃。
图32.烟曲霉13073野生型、烟曲霉α-突变体和一种进一步稳定的α-突变体(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)的最适温度的比较。为了测定最适温度，在37℃和75℃之间的一系列温度下进行肌醇六磷酸酶标准测定。用转化的酿酒酵母株的稀释的上清液进行该测定。上清液的其它组分显示对最适温度的测定没有影响。○，烟曲霉ATCC 13073肌醇六磷酸酶；▲，烟曲霉ATCC 13073α-突变体；□，烟曲霉ATCC 13073α-突变体-(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T；■，烟曲霉ATCC13073α-突变体-(E59A-S126N-R329H-S364T-G404A)-Q27T-K68A。Q27T和K68A分别对应于共有肌醇六磷酸酶-1Q50T和K91A。
图33.共有肌醇六磷酸酶12(consphy12)的氨基酸序列，它包含从“basidio”共有序列转移到共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A的许多活性位点残基。
实施例1a)材料肌醇六磷酸(十二钠盐)和聚乙二醇、多元醇、二羧酸钠、高碘酸钠、己二酸二酰肼及其它添加剂购自商品供应商。其它所有化学药品至少是分析纯级的。5ml HiTrap脱盐柱从Pharmacia获得。SDS-PAGE凝胶(4-12％NuPAGE Bis-Tris Pre-Cast)和缓冲液由NOVEX供应。
b)肌醇六磷酸酶的表达和纯化烟曲霉、土曲霉CBS肌醇六磷酸酶和共有肌醇六磷酸酶在多形汉逊酵母中过量表达。黑曲霉和构巢曲霉肌醇六磷酸酶在黑曲霉中过量表达。Pasamontes等人[应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)(1997)，63，1696-1700页]在以前描述了这些肌醇六磷酸酶的克隆、纯化和表征。根据欧洲专利申请公开文本897 985进行共有肌醇六磷酸酶的构建、克隆和纯化。非配制的共有肌醇六磷酸酶由于氨基酸交换(在位点50用L替换Q)具有高达70℃的增强的热稳定性，并且与烟曲霉肌醇六磷酸酶相比具有三倍高的比活性。
c)肌醇六磷酸酶活性测定为了进行热稳定性的测定，通过将纯化的酶在0.2M乙酸钠，pH5.0(含或不含％w/w的添加剂)中稀释为0.05U/ml(37℃测定的活性)，在不同的温度用肌醇六磷酸进行酶活性的测定。将一等份蛋白质溶液(250μl)在希望的温度预温育5分钟，随后加入等体积的含1％肌醇六磷酸的0.2M乙酸钠，pH5.0溶液(以10ml等份在相同温度预温育10分钟)。样品在希望的温度(例如在60或65℃，用于添加剂作用的筛选)温育15分钟后，通过0.5ml 15％三氯乙酸的加入终止反应。用标准方法进行释放的无机磷酸的测定。
d)热稳定添加剂的评价通常，将多元醇以25％或50％(w/w)的浓度溶解于0.2M乙酸钠，pH5.0中。除分子量为4000、8000和10000的PEG以25％的浓度使用之外，PEG以50％的浓度溶解。为了PEG和其它多元醇的筛选，对于构巢曲霉和土曲霉CBS肌醇六磷酸酶选择60℃的预温育和反应温度，烟曲霉和黑曲霉肌醇六磷酸酶选择65℃，共有肌醇六磷酸酶选择75℃。
以5％、10％和25％的浓度溶解丙二酸二钠、琥珀酸二钠和戊二酸二钠，在酶加添加物和底物(见上)以如下温度预温育后测定肌醇六磷酸酶活性37、45、50、55、60、65、70、75、80和85℃。以同样方式，检测了在25％木糖醇和核糖醇存在下，不同肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性。应当指出，底物加入后添加物的浓度减半。
e)糖链的交联如Cesi等人关于转化酶所述[有机化学研究47酶的稳定性和稳定，1992年在荷兰Maastricht举行的国际学术会议论文集，Elsevier SciencePublications B.V.，阿姆斯特丹，荷兰]进行肌醇六磷酸酶糖链的交联。在0.2M乙酸钠，pH5.0中不同浓度(0、5、10、20、30、40和50mM)高碘酸钠的存在下，将肌醇六磷酸酶样品(5mg蛋白质/ml)在30℃温育2小时，并且于4℃贮存过夜。使用0.2M乙酸钠，pH5.0作为洗脱缓冲液，在与AktaExplorer系统(Pharmacia)连接的5ml HiTrap脱盐柱(Pharmacia)上将每一个样品脱盐。实现交联的方法是将100μl 0.5M溶解于0.2M乙酸钠，pH5.0中的己二酸二酰肼加入900μl脱盐的氧化产物中。在氧化和交联步骤之后进行样品的肌醇六磷酸酶活性测定和凝胶电泳。
f)热稳定的肌醇六磷酸酶的高剪切造粒将100-250ml肌醇六磷酸酶溶液(总共2500-5000单位交联的或非交联的肌醇六磷酸酶)加入5-10％木质素磺酸钙(Borregard，挪威)、5-20％二氧化硅(Sipernat 50S，Degussa，德国)、0-20％热稳定剂和石膏的1kg干燥混合物中。在高剪切造粒过程中，加入水直到形成具有希望性质的颗粒。将颗粒在流化床干燥器中45℃干燥15分钟，随后用天然棕榈脂(棕榈46，Florin，Basel，瑞士)脂肪包被。
g)热稳定的干燥和液体肌醇六磷酸酶制剂的造粒稳定性将热稳定的干燥和液体肌醇六磷酸酶制剂(如上所述)与饲料混合，随后在85℃蒸汽条件下造粒。通过测定造粒前浆汁中和输运的丸粒中的肌醇六磷酸酶活性，测定肌醇六磷酸酶的造粒稳定性。实施例2如实施例1所述的不同真菌肌醇六磷酸酶活性的温度依赖性的研究显示，最大活性在如下温度烟曲霉肌醇六磷酸酶和黑曲霉肌醇六磷酸酶在55℃，土曲霉CBS肌醇六磷酸酶和构巢曲霉肌醇六磷酸酶在45℃，共有肌醇六磷酸酶在65℃。选择所测最高温度之上10-15℃的温度作为筛选点，用于研究多元醇、聚乙二醇、二羧酸盐、羧甲基纤维素和藻酸钠对肌醇六磷酸酶热稳定性的影响。
a)不同分子量的聚乙二醇的加入50％或25％(反应期间为25％和12.5％的终浓度)聚乙二醇的加入以分子量依赖方式增强了在65℃测定的烟曲霉肌醇六磷酸酶的比活性，用PEG 1450观察到最大值(比活性80U*(mg蛋白质)-1)，PEG 1000(50U*(mg蛋白质)-1)和PEG 3350(42U*(mg蛋白质)-1)也有可观的活性。图2概括了该实验的结果。
分子量为600、1000、1450、3350和4000Da的PEG对所测的其它肌醇六磷酸酶显示相似的作用。该实验的结果显示于图3中。
b)多元醇的加入浓度为25％和50％的多元醇核糖醇、木糖醇(C5糖)和山梨糖醇(C6糖)显著提高了烟曲霉肌醇六磷酸酶的热稳定性。这显示于图4中。
赤藓糖醇、甘露醇、甘露庚酮糖和甘露庚糖不能以50％(w/w)的浓度溶解于0.2M乙酸钠，pH5.0中，因此只显示25％的值。在25％的核糖醇、木糖醇和山梨糖醇存在下在65℃测定的比活性分别是11、21和11U*(mg蛋白质)-1，在50％核糖醇、木糖醇和山梨糖醇溶液存在下比活性分别是51、90和74U*(mg蛋白质)-1。
包含多于6个或少于5个碳原子的多元醇如甘油(C3糖)、赤藓糖醇(C4糖)、甘露庚糖和甘露庚酮糖(C7糖)对烟曲霉肌醇六磷酸酶的热稳定显示较低的作用。
50％浓度的木糖醇也使构巢曲霉、土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶的最适温度提高10-15℃。结果显示于图5中。
c)二羧酸的加入25％浓度(活性测定中12.5％的终浓度)的丙二酸盐、琥珀酸盐和戊二酸盐导致烟曲霉肌醇六磷酸酶热稳定性的显著提高，对于丙二酸盐在70℃、琥珀酸盐和戊二酸盐在65℃仍检测到可观的活性。结果显示于图6中。
另外，二羧酸盐刺激在37℃测定的烟曲霉肌醇六磷酸酶活性，对于丙二酸盐肌醇六磷酸酶活性大约提高4倍，琥珀酸盐提高2倍，戊二酸盐有较小的作用。不同浓度(5％、10％和25％)丙二酸盐的研究显示，烟曲霉肌醇六磷酸酶的热稳定是浓度依赖的，而酶活性的刺激至少在此浓度范围内不是浓度依赖的。这显示于图7中。
与这些发现相反，不同浓度的乙酸钠(5％、10％和25％)，一种单羧酸，引起烟曲霉肌醇六磷酸酶37℃比活性的2倍提高，但对该蛋白质的热稳定性仅有较小的作用。这能在图8中看出。
丙二酸二钠和琥珀酸二钠通常使构巢曲霉、土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶的热稳定性提高5-15℃。另一方面，仅对构巢曲霉和烟曲霉肌醇六磷酸酶观察到肌醇六磷酸酶活性的刺激，两者都有相当低的比活性，但对土曲霉CBS、黑曲霉和共有肌醇六磷酸酶则观察不到。这在图9和图10中得到证明。
d)交联的作用在一个预实验中，通过用戊二醛温育交联烟曲霉肌醇六磷酸酶单体。60℃测定的最终热稳定在1小时反应时间后达到最大值，但导致活性丢失(37℃测定)。在另一组实验中，烟曲霉肌醇六磷酸酶单体通过其糖链交联。实现此种类型的交联仅伴有比活性的较小损失(＜10％)，并在超过15mM的高碘酸钠浓度时引起寡聚形式的形成。这能从图11中看出。
热稳定的范围依赖于高碘酸盐的浓度，并在50mM达到最大值，此时观察的高比活性高达75℃(见图12)。对于通过糖链交联的共有肌醇六磷酸酶也观察到肌醇六磷酸酶寡聚化对热稳定性的显著影响。这能从图12中看出。
在本工作中，我们将努力集中于低Mr添加剂的热稳定作用(这被高度推荐用于工业酶的稳定)和化学修饰的热稳定作用，虽然由于技术和经济的原因通常认为后一种方法是没有吸引力的。
我们已发现C5糖对在丝状真菌(黑曲霉)或酵母(多形汉逊酵母)中表达的许多不同肌醇六磷酸酶的热稳定。热稳定性的提高在不同肌醇六磷酸酶间有某些程度的不同，但都在10℃左右。PEG的作用是分子量依赖的。用分子量在1000和3350Da之间的PEG获得所有肌醇六磷酸酶的最佳热稳定。
乙酸钠，一种单羧酸并且是标准肌醇六磷酸酶活性测定的主要组分，引起烟曲霉肌醇六磷酸酶活性的浓度依赖的增强，但对于肌醇六磷酸酶的热稳定性没有作用。因此，羧基可能负责活性调节，而双功能二羧酸盐可能通过离子相互作用稳定肌醇六磷酸酶。实施例3共有肌醇六磷酸酶-1的氨基酸序列的设计氨基酸序列的排列使用序列分析包9.0版(Devereux等人，1984)的程序PILEUP及标准参数(缺口产生罚12，缺口延伸罚4)计算序列排列。使用文字编辑器修饰缺口的位置。表1显示不含信号序列的序列(见图13)，该序列用于序列排列的进行，排列开始于表1所述的氨基酸(aa)。
表1用于共有肌醇六磷酸酶-1设计的肌醇六磷酸酶氨基酸序列的来源和权重-来源于土曲霉9A-1的phyA，aa 27，权重0.5(Mitchell等人，1997)-来源于土曲霉cbs116.46的phyA，aa 27，权重0.5(van Loon等人，1998)-来源于黑曲霉awamori变种的phyA，aa 27，权重0.33(Piddington等人，1993)-来源于黑曲霉T213的phyA，aa 27，权重0.33-来源于黑曲霉株NRRL3135的phyA，aa 27，权重0.33(van Hartingsveldt等人，1993)-来源于烟曲霉ATCC 13073的phyA，aa 26，权重0.2(Pasamontes等人，1997)-来源于烟曲霉ATCC 32722的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 58128的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 26906的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 32239的phyA，aa 30，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于Emericella nidulans的phyA，aa 25，权重1.0(Pasamontes等人，1997a)-来源于Talaromyces thermophilus ATCC 20186的phyA，aa 24，权重1.0(Pasamontes等人，1997a)-来源于Myceliophthora thermophila的phyA，aa 19，权重1.0(Mitchell等人，1997)共有肌醇六磷酸酶-1氨基酸序列的计算用修饰的序列排列作为输入，通过序列分析包9.0版(Devereux等人，1984)的程序PRETTY计算共有序列。PRETTY以其排列的竖列打印序列，并能显示排列的共有序列。将涉及排列的肌醇六磷酸酶氨基酸序列间相似性的权重分配给所有序列。设定权重，例如设定一个序列亚组(相同的种，但来源于不同的株)的所有肌醇六磷酸酶(如烟曲霉的所有肌醇六磷酸酶的氨基酸序列)对选择的组合影响，其意思是为每个序列提供1除以株序列数量的一个值(见表1)。用这种方法，能防止例如不同烟曲霉株的肌醇六磷酸酶的非常相似的氨基酸序列在计算的共有序列中占优势。
程序PRETTY开始于以下参数大多数说明了权的数量，在其之下没有共有被设定为2.0。确定得分矩阵值的阈值被设定为2，在其之下氨基酸残基不能加权用于残基组合。对于肽PRETTY使用PrettyPep.Cmp共有得分矩阵。
根据如下原则手工填充程序不能确定共有残基的序列排列中的10个位置(位置46、66、82、138、162、236、276、279、280、308；图13)如果存在最常见的残基，则选择该残基(138、236、280)；如果存在优势的一组相似的或系统发生相同的残基，则选择最常见的，或者如果不能得到最常见的，则选择该组之中的一个残基(46、66、82、162、276、308)。如果既没有优势残基也没有优势基团，则根据对蛋白质稳定性影响的普通假设选择出现的残基之一(279)。另外8个位置(132、170、204、211、275、317、384、447；图13)没有用程序选择的氨基酸残基填充，但一般用与程序所选残基相同频率出现的氨基酸填充。在大多数情况下，通过这种修正消除了对三种黑曲霉序列(权重总数0.99)的轻微低估。共有肌醇六磷酸酶-1氨基酸序列向DNA序列的转换用土曲霉cbs116.46肌醇六磷酸酶的前26个氨基酸残基作为信号肽，并因此与所有共有肌醇六磷酸酶的N-末端融合。对于这种延长，我们使用一种特殊方法计算相应的DNA序列。Purvis等人(1987)建议，基因中稀有密码子的掺入对蛋白质的折叠效率有影响。因此，至少将稀有密码子在土曲霉cbs116.46信号序列中的分布转移至为在酿酒酵母中表达而产生的新信号序列中，土曲霉cbs116.46的信号序列用于共有肌醇六磷酸酶，对于蛋白质的分泌是非常重要的，但将其转换为酿酒酵母使用的密码子。对于蛋白质的剩余部分，我们使用从GCG程序包获得的高表达酿酒酵母基因的密码子频率表，将计算的氨基酸序列翻译为DNA序列。
产生的fcp基因的序列显示于图14中。共有肌醇六磷酸酶-1基因的构建和克隆交替使用有义和反义链的序列，将计算的共有肌醇六磷酸酶-1(fcp)的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每个寡核苷酸与其之前和之后的相对链的寡核苷酸重叠20bp。在图14中显示了购自Microsynth，Balgach(瑞士)并以PAGE纯化形式获得的所有引物的位置。PCR反应在三个PCR反应中，合成的寡核苷酸组成完整的基因。使用Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)的高忠实度试剂盒和AMS生物工程(欧洲)有限公司(Lugano，瑞士)的热循环仪ProtokolTM进行PCR。
将寡核苷酸CP-1到CP-10(混合物1，图14)混合为每种寡核苷酸0.2pmol/μl的浓度。用CP-9到CP-22(每种寡核苷酸0.2pmol/μl)制备第二种寡核苷酸混合物(混合物2)。另外，在PCR反应中使用4种短引物CP-aEcoRI5’-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3’CP-b5’-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTTC-3’CP-c5’-TCTTCGAAAGCAGTACAAGTAC-3’CP-eEcoRI5’-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3’PCR反应a10μl混合物1(每种寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每种核苷酸10mM)2μl引物CP-a(10pmol/μl)2μl引物CP-c(10pmol/μl)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物
73.25μl H2OPCR反应b10μl混合物2(每种寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每种核苷酸10mM)2μl引物CP-b(10pmol/μl)2μl引物CP-e(10pmol/μl)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应a和b的反应条件步骤1 2分钟-45℃步骤2 30秒-72℃步骤3 30秒-94℃步骤4 30秒-52℃步骤5 1分钟-72℃步骤3到5重复40次。
通过琼脂糖凝胶电泳(0.9％琼脂糖)和随后的凝胶抽提(QIAEX II凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)纯化PCR产物(670和905bp)。用纯化的DNA片段进行PCR反应c。PCR反应c6μl反应a的PCR产物(≈50ng)6μl反应b的PCR产物(≈50ng)2μl引物CP-a(10pmol/μl)2μl引物CP-e(10pmol/μl)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应c的反应条件步骤1 2分钟-94℃步骤2 30秒-94℃步骤3 30秒-55℃
步骤4 1分钟-72℃步骤2到4重复31次。
如上所述纯化产生的PCR产物(1.4kb)，用EcoRI消化，连接至EcoRI消化的并去磷酸化的pBsk(-)载体(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。用1μl连接混合物转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。所有标准方法如Sambrook等人(1987)所述进行。通过本领域已知的测序控制构建的共有肌醇六磷酸酶基因(fcp，图14)的DNA序列。实施例4改进的共有肌醇六磷酸酶(共有肌醇六磷酸酶-10)氨基酸序列的设计使用序列分析包9.0版(Devereux等人，1984)的程序PILEUP及标准参数(缺口产生罚12，缺口延伸罚4)计算用于共有肌醇六磷酸酶-10设计的序列排列。使用文字编辑器修饰缺口的位置。使用以下序列进行担子菌肌醇六磷酸酶的序列排列，它开始于表2所述的氨基酸(aa)表2用于相应氨基酸共有序列(basidio)计算的5种担子菌肌醇六磷酸酶的来源和权重-来源于卷缘网褶菌NN 005693的phyA1，aa 21，权重0.5(WO 98/28409)-来源于卷缘网褶菌NN 005693的phyA2，aa 21，权重0.5(WO 98/28409)-来源于绒毛栓菌NN 9343的phyA，aa 24，权重1.0(WO 98/28409)-来源于平田头菇NN 009289的phyA，aa 19，权重1.0(WO 98/28409)-来源于Peniophora lycii NN 006113的phyA，aa 21，权重1.0(WO98/28409)序列排列显示于图3中。
在表3中排列了用于进行最终序列排列的基因。在排列中使用的序列的第一个氨基酸(aa)在生物名称之后提及。表3用于共有肌醇六磷酸酶10设计的肌醇六磷酸酶序列的来源和权重-来源于土曲霉9A-1的phyA，aa 27，权重0.5(Mitchell等人，1997)-来源于土曲霉cbs116.46的phyA，aa 27，权重0.5(van Loon等人，1998)-来源于黑曲霉awamori变种的phyA，aa 27，权重0.5(Piddington等人，1993)-来源于黑曲霉株NRRL3135的phyA，aa 27，权重0.5(van Hartingsveldt等人，1993)-来源于烟曲霉ATCC 13073的phyA，aa 26，权重0.2(Pasamontes等人，1997)-来源于烟曲霉ATCC 32722的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 58128的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 26906的phyA，aa 26，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于烟曲霉ATCC 32239的phyA，aa 30，权重0.2(van Loon等人，1998)-来源于Emericella nidulans的phyA，aa 25，权重1.0(Pasamontes等人，1997a)-来源于Talaromyces thermophilus ATCC 20186的phyA，aa 24，权重1.0(Pasamontes等人，1997a)-来源于Myceliophthora thermophila的phyA，aa 19，权重1.0(Mitchell等人，1997)-来源于Thermomyces lanuginosa的phyA，aa 36，权重1.0(Berka等人，1998)-5种担子菌肌醇六磷酸酶的共有序列，权重1.0(Basidio，图15)相应的序列排列显示于图16中。共有-10氨基酸序列的计算为了改进序列排列，我们向一个更大的排列中加入来源于4种不同担子菌的5种肌醇六磷酸酶的原始共有序列，它被称为Basidio，仍包含未确定的序列位置(见图15)，加入几乎所有用于原始共有肌醇六磷酸酶计算的肌醇六磷酸酶序列和一种子囊菌Thermomyces lanuginosa的新肌醇六磷酸酶序列。使用担子菌肌醇六磷酸酶序列的共有序列，不能顾及5种氨基酸序列之间的差异，但顾及子囊菌与担子菌肌醇六磷酸酶之间的共同的和不同的氨基酸残基。
我们将大多数(plurality)设置为2.0，将阈值设定为3。使用的权重列于表3中。序列排列和相应的共有序列显示于图16中。与原始的共有肌醇六磷酸酶相比，新的共有肌醇六磷酸酶序列具有32个不同的氨基酸。根据实施例3所述的原则填充程序PRETTY不能计算共有氨基酸残基的位置。程序建议的残基没有一个被替换。
此外，我们包括所有的担子菌肌醇六磷酸酶作为单氨基酸序列，但将0.2的权重分配于序列排列中。相应的序列排列显示于图18中。计算的共有氨基酸序列(共有肌醇六磷酸酶-11)与共有肌醇六磷酸酶-10的序列具有以下差异。字母X意思是程序不能计算的共有氨基酸；圆括号中的氨基酸对应于最终包含于共有肌醇六磷酸酶-10之中的氨基酸。
D35X、X(K)69K、X(E)100E、A101R、Q134N、X(K)153N、X(H)190H、X(A)204S、X(E)220D、E222T、V227A、X(R)271R、H287A、X(D)288D、X(K)379K、X(I)389I、E390X、X(E)415E、X(A)416A、X(R)446L、E463A，而其编号方式如图17。
我们也检查了改进的共有序列10和11建议的单氨基酸替换对原始共有肌醇六磷酸酶稳定性的影响。其方法描述于实施例5中。共有肌醇六磷酸酶-10氨基酸序列向DNA序列的转换用土曲霉cbs116.46肌醇六磷酸酶的前26个氨基酸残基作为信号肽，并因此与共有肌醇六磷酸酶-10的N-末端融合。使用的方法进一步描述于实施例3中。
产生的fcp10基因的序列显示于图17中。共有肌醇六磷酸酶-10基因(fcp10)的构建和克隆交替使用有义和反义链的序列，将计算的fcp10的DNA序列分成85bp的寡核苷酸。每个寡核苷酸与其之前和之后的相对链的寡核苷酸重叠20bp。图17中显示了购自Microsynth，Balgach(瑞士)并以PAGE纯化形式获得的所有引物的位置。PCR反应在三个PCR反应中，合成的寡核苷酸组成完整的基因。使用Boehringer Mannheim(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)的高忠实度试剂盒和AMS生物工程(欧洲)有限公司(Lugano，瑞士)的热循环仪ProtokolTM进行PCR。以下寡核苷酸以0.2pmol/ml的浓度使用。
混合物1.10CP-1、CP-2、CP-3.10、CP-4.10、CP-5.10、CP-6、CP-7.10、CP-8.10、CP-9.10、CP-10.10混合物2.10CP-9.10、CP-11.10、CP-12.10、CP-13.10、CP-14.10、CP-15.10、CP-16.10、CP-17.10、CP-18.10、CP-19.10、CP-20.10、CP-21.10、CP-22.10用数字10标记新合成的寡核苷酸。与原始共有肌醇六磷酸酶相比，该肌醇六磷酸酶包含如下32种交换，这些交换在图17中以下划线标出Y54F、E58A、D69K、D70G、A94K、N134Q、I158V、S187A、Q188N、D197N、S204A、T214L、D220E、L234V、A238P、D246H、T251N、Y259N、E267D、E277Q、A283D、R291I、A320V、R329H、S364T、I366V、A379K、S396A、G404A、Q415E、A437G、A463E。
使用4种短PCR引物进行寡核苷酸的装配
CP-a Eco RI5’-TATATGAATTCATGGGCGTGTTCGTC-3’CP-b5’-TGAAAAGTTCATTGAAGGTTTC-3’CP-c.105’-TCTTCGAAAGCAGTACACAAAC-3’CP-e Eco RI5’-TATATGAATTCTTAAGCGAAAC-3’PCR反应a10μl混合物1.10(每种寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每种核苷酸10mM)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-c.10(10pmol/ml)10.0μlPCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物73.25μl H2OPCR反应b10μl混合物2.10(每种寡核苷酸2.0pmol)2μl核苷酸(每种核苷酸10mM)2μl引物CP-b(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应a和b的反应条件步骤1 2分钟-45℃步骤2 30秒-72℃步骤3 30秒-94℃步骤4 30秒-52℃步骤5 1分钟-72℃
步骤3到5重复40次。
通过琼脂糖凝胶电泳(0.9％琼脂糖)和随后的凝胶抽提(QIAEX II凝胶抽提试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)纯化PCR产物(670和905bp)。用纯化的DNA片段进行PCR反应c。PCR反应c6μl反应a的PCR产物(≈50ng)6μl反应b的PCR产物(≈50ng)2μl引物CP-a(10pmol/ml)2μl引物CP-e(10pmol/ml)10.0μl PCR缓冲液0.75μl聚合酶混合物(2.6U)73.25μl H2OPCR反应c的反应条件步骤1 2分钟-94℃步骤2 30秒-94℃步骤3 30秒-55℃步骤4 1分钟-72℃步骤2到4重复31次。
如上所述纯化产生的PCR产物(1.4kb)，用EcoRI消化，连接至EcoRI消化的并去磷酸化的pBsk(-)载体(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。用1μl连接混合物转化大肠杆菌XL-1感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，美国)。所有标准方法如Sambrook等人(1987)所述进行。通过本领域已知的测序检查构建的基因(fcp10)的DNA序列。实施例5通过共有肌醇六磷酸酶-10和共有肌醇六磷酸酶-11的氨基酸序列所建议的单突变的引入，提高共有肌醇六磷酸酶-1的热稳定性为了提高同源基因的热稳定性，检测目标蛋白质与计算的共有序列之间不同的氨基酸残基的稳定作用以及将所有稳定突变组成目标蛋白质也是可能的。我们使用共有肌醇六磷酸酶作为目标蛋白质，并检测其对34种氨基酸残基的蛋白质稳定性的作用，这不同于为单突变的共有肌醇六磷酸酶10和/或11。
为构建用于在黑曲霉、酿酒酵母或多形汉逊酵母中表达的突变蛋白质，使用包含共有肌醇六磷酸酶基因的相应表达质粒作为定点诱变的模板(见实施例8-10)。按照操作规程使用Stratagene的“quick exchangeTM定点诱变试剂盒”(La Jolla，CA，美国)并使用相应的引物引入突变。进行的所有突变及其相应的引物总结于表4中。通过本领域已知的DNA序列分析鉴定具有希望的突变的质粒。表4用于共有肌醇六磷酸酶定点诱变的引物(以黑体突出交换的碱基。限制位点的引入在序列之上标出。当限制位点写在圆括号中时，所述位点被突变的引入所破坏。)突变引物组Kpn I-Q50T5’-CACTTGTGGGGTACCTACTCTCCATACTTCTC-3’5’-GAGAAGTATGGAGAGTAGGTACCCCACAAGTG-3’Y54F5’-GGTCAATACTCTCCATTCTTCTCTTTGGAAG-3’5’-CTTCCAAAGAGAAGAATGGAGAGTATTGACC-3’E58A5’-CATACTTCTCTTTGGCAGACGAATCTGC-3’5’-GCAGATTCGTCTGCCAAAGAGAAGTATG-3’Aat IID69K5’-CTCCAGACGTCCCAAAGGACTGTAGAGTTAC-3’5’-GTAACTCTACAGTCCTTTGGGACGTCTGGAG-3’
Aat IID70G5’-CTCCAGACGTCCCAGACGGCTGTAGAGTTAC-3’5’-GTAACTCTACAGCCGTCTGGGACGTCTGGAG-3 ’K91A5’-GATACCCAACTTCTTCTGCGTCTAAGGCTTACTCTG-3’5’-CAGAGTAAGCCTTAGACGCAGAAGAAGTTGGGTATC-3’ScaIA94K 5’-CTTCTAAGTCTAAGAAGTACTCTGCTTTG-3’5’-CAAAGCAGAGTACTTCTTAGACTTAGAAG-3’A101R 5’-GCTTACTCTGCTTTGATTGAACGGATTCAAAAGAACGCTAC-3’5’-GTAGCGTTCTTTTGAATCCGTTCAATCAAAGCAGAGTAAGC-3’N134Q 5’-CCATTCGGTGAACAGCAAATGGTTAACTC-3’5’-GAGTTAACCATTTGCTGTTCACCGAATGG-3’Nru IK153N 5’-GATACAAGGCTCTCGCGAGAAACATTGTTC-3’5’-GGAACAATGTTTCTCGCGAGAGCCTTGTATC-3’Bss HII158V 5’-GATTGTTCCATTCGTGCGCGCTTCTGGTTC-3’5’-GAACCAGAAGCGCGCACGAATGGAACAATC-3’
Bcl ID197N5’-CTCCAGTTATTAACGTGATCATTCCAGAAGG-3’5’-CCTTCTGGAATGATCACGTTAATAACTGGAG-3’Apa IS187A5’-GGCTGACCCAGGGGCCCAACCACACCAAGC-3’5’-GCTTGGTGTGGTTGGGCCCCTGGGTCAGCC-3’Nco IT214L5’-CACTTTGGACCATGGTCTTTGTACTGCTTTCG-3’5’-CGAAAGCAGTACAAAGACCATGGTCCAAAGTG-3’Avr IIE222T5’-GCTTTCGAAGACTCTACCCTAGGTGACGACGTTG-3’5’-CAACGTCGTCACCTAGGGTAGAGTCTTCGAAAGC-3’V227A5’-GGTGACGACGCTGAAGCTAACTTCAC-3’5’-GTGAAGTTAGCTTCAGCGTCGTCACC-3’Sac IIL234V5’-CTAACTTCACCGCGGTGTTCGCTCCAG-3’5’-CTGGAGCGAACACCGCGGTGAAGTTAG-3’A238P5’-GCTTTGTTCGCTCCACCTATTAGAGCTAGATTGG-3’5’-CCAATCTAGCTCTAATAGGTGGAGCGAACAAAGC-3’Hpa IT251N5’-GCCAGGTGTTAACTTGACTGACGAAG-3’5’-TTCGTCAGTCAAGTTAACACCTGGC-3’Aat IIY259N5’-GACGAAGACGTCGTTAACTTGATGGAC-3’5’-GTCCATCAAGTTAACGACGTCTTCGTC-3’Asp IE267D5’-GTCCATTCGACACTGTCGCTAGAACTTC-3’5’-GAAGTTCTAGCGACAGTGTCGAATGGAC-3’E277Q5’-CTGACGCTACTCAGCTGTCTCCATTC-3’5’-GAATGGAGACAGCTGAGTAGCGTCAG-3’A283D5’-GTCTCCATTCTGTGATTTGTTCACTCAC-3’5’-GTGAGTGAACAAATCACAGAATGGAGAC-3’Ksp IH287A 5’-GCTTTGTTCACCGCGGACGAATGGAG-3’5’-CTCCATTCGTCCGCGGTGAACAAAGC-3’Bam HIR291I5’-CACGACGAATGGATCCAATACGACTAC-3’5’-GTAGTCGTATTGGATCCATTCGTCGTG-3’Bsi WIQ292A5’-GACGAATGGAGAGCGTACGACTACTTG-3’5’-CAAGTAGTCGTACGCTCTCCATTCGTC-3’Hpa IA320V5’-GGTGTTGGTTTCGTTAACGAATTGATTGC-3’5’-GCAATCAATTCGTTAACGAAACCAACACC-3’(Bgl II)R329H5’-GCTAGATTGACTCACTCTCCAGTTCAAG-3’5’-CTTGAACTGGAGAGTGAGTCAATCTAGC-3’EcoRVS364T5’-CTCACGACAACACTATGATATCTATTTTCTTC-3’5’-GAAGAAAATAGATATCATAGTGTTGTCGTGAG-3’
Nco II366V5’-CGACAACTCCATGGTTTCTATTTTCTTCGC-3’5’-GCGAAGAAAATAGAAACCATGGAGTTGTCG-3’Kpn IA379K 5’-GTACAACGGTACCAAGCCATTGTCTAC-3’5’-GTAGACAATGGCTTGGTACCGTTGTAC-3’S396A5’-CTGACGGTTACGCTGCTTCTTGGAC-3’5’-GTCCAAGAAGCAGCGTAACCGTCAG-3’G404A5’-CTGTTCCATTCGCTGCTAGAGCTTAC-3’5’-GTAAGCTCTAGCAGCGAATGGAACAG-3’Q415E5’-GATGCAATGTGAAGCTGAAAAGGAACC-3’5’-GGTTCCTTTTCAGCTTCACATTGCATC-3’Sal IA437G5’-CACGGTTGTGGTGTCGACAAGTTGGG-3’5’-CCCAACTTGTCGACACCACAACCGTG-3’Mun IA463E5’-GATCTGGTGGCAATTGGGAGGAATGTTTCG-3’5’-CGAAACATTCCTCCCAATTGCCACCAGATC-3’
并因此用于其它突变。
如实施例11所概述的，测定在酿酒酵母中表达(实施例9)的纯化的肌醇六磷酸酶的最适温度。表5显示引入的每个突变对共有肌醇六磷酸酶稳定性的影响。
表5共有肌醇六磷酸酶-1中单个氨基酸替换的稳定性作用(+或-分别表示对蛋白质稳定性可达1℃的正、负影响，++和--分别表示对蛋白质稳定性在1℃与3℃之间的正、负影响；数字10或11对应于建议氨基酸替换的共有肌醇六磷酸酶序列。)稳定 中等不稳定突变 影响 突变 影响 突变影响
*该氨基酸替换发现于另一轮突变中。
我们使用本实施例中这些引物和上述技术在共有肌醇六磷酸酶中组合8种阳性突变(E58A、D197N、E267D、R291I、R329H、S364T、A379K、G404A)。此外，引入突变Q50T和K91A，其主要影响肌醇六磷酸酶的催化特性(见欧洲专利申请公开文本897 985以及实施例11)。产生的肌醇六磷酸酶基因(共有肌醇六磷酸酶-热[8]-Q50T-K91A)的DNA和氨基酸序列显示于图19中。以这样的方式，共有肌醇六磷酸酶的最适温度和熔点升高7℃(见图27、28、29)。
使用表5的结果，我们进一步提高了共有肌醇六磷酸酶10的热稳定性，方法是对共有肌醇六磷酸酶的稳定性显示强阴性作用的突变进行回复突变K91A、V158I和A396S。产生的蛋白质是肌醇六磷酸酶-10-热[3]。所得蛋白质为肌醇六磷酸酶10-热[3]。此外，我们引入突变Q50T和K91A，其主要影响共有肌醇六磷酸酶的催化特性(见专利申请EP公开文本897 985以及实施例11和图26与图27)。产生的DNA和氨基酸序列显示于图20中。最佳肌醇六磷酸酶显示比共有肌醇六磷酸酶10具有高4℃的最适温度和熔点(图24和图25)。此外，该肌醇六磷酸酶以肌醇六磷酸为底物在pH5.5时也具有大大增加的比活性250U/mg(图26)。实施例6通过将氨基酸残基用相应的共有肌醇六磷酸酶-1和共有肌醇六磷酸酶-10残基替换稳定烟曲霉ATCC 13073肌醇六磷酸酶在不包括相应的共有肌醇六磷酸酶氨基酸残基的图13的排列中，在烟曲霉13073是唯一或几乎唯一的肌醇六磷酸酶的6个典型位置，用共有肌醇六磷酸酶氨基酸残基替换非共有肌醇六磷酸酶氨基酸残基。在第一轮中，在烟曲霉13073肌醇六磷酸酶中替换以下氨基酸，包括Q27T替换和土曲霉cbs.116.46肌醇六磷酸酶的信号序列(见图21)F55(28)Y、V100(73)I、F114(87)Y、A243(220)L、S265(242)P、N294(282)D。
圆括号中的数字给出了图13的编号。
在第二轮，共有肌醇六磷酸酶-10序列中7个稳定的氨基酸交换中的4个(E59A、R329H、S364T、G404A)经检测在共有肌醇六磷酸酶-1中是单一突变(表5)，将它们另外引入烟曲霉α-突变体。此外，引入显示降低肌醇六磷酸酶蛋白酶敏感性的氨基酸替换S126N。
如实施例5所述引入突变(见表6)，并且如实施例8到10所述表达。产生的烟曲霉13073肌醇六磷酸酶变体被称为α-突变体和α-突变体-E59A-S126N-R329H-S364T-G404A。
与野生型的值(最适温度55℃，Tm60℃)相比，烟曲霉13073肌醇六磷酸酶α-突变体的最适温度(60℃，图32)和熔点(67.0℃，图31)升高5℃。另外5个氨基酸替换进一步使最适温度升高3℃(图32)。
表6用于烟曲霉肌醇六磷酸酶ATCC 13073稳定的突变引物突变 引物F55Y5’-CACGTACTCGCCATACTTTTCGCTCGAG-3’5’-CTCGAGCGAAAAGTATGGCGAGTACGTG-3’(Xho I)E58A5’-CCATACTTTTCGCTCGCGGACGAGCTGTCCGTG-3’5’-CACGGACAGCTCGTCCGCGAGCGAAAAGTAGG-3’V100I5’-GTATAAGAAGCTTATTACGGCGATCCAGGCC-3’5’-GGCCTGGATCGCCGTAATAAGCTTCTTATAC-3’F114Y5’-CTTCAAGGGCAAGTACGCCTTTTTGAAGACG-3’5’-CGTCTTCAAAAAGGCGTACTTGCCCTTGAAG-3’A243L5’-CATCCGAGCTCGCCTCGAGAAGCATCTTC-3’5’-GAAGATGCTTCTCGAGGCGAGCTCGGATG-3’S265P5’-CTAATGGATGTGTCCGTTTGATACGGTAG-3’5’-CTACCGTATCAAACGGACACATGTCCATTAG-3’N294D5’-GTGGAAGAAGTACGACTACCTTCAGTC-3’5’-GACTGAAGGTAGTCGTACTTCTTCCAC-3’(Mlu I)R329H5’-GCCCGGTTGACGCATTCGCCAGTGCAGG-3’5’-CCTGCACTGGCGAATGCGTCAACCGGGC-3’Nco IS364T5’-CACACGACAACACCATGGTTTCCATCTTC-3’5’-GAAGATGGAAACCATGGTGTTGTCGTGTG-3’(Bss HI)G404A5’-GTGGTGCCTTTCGCCGCGCGAGCCTACTTC-3’5’-GAAGTAGGCTCGCGCGGCGAAAGGCACCAC-3’实施例7黑曲霉NRRL3135肌醇六磷酸酶的活性位点氨基酸残基向共有肌醇六磷酸酶-1的引入我们使用黑曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶的晶体结构确定所有活性位点氨基酸残基(见参考实施例和EP 897 010)。我们使用图13的序列排列，将共有肌醇六磷酸酶的以下活性位点残基和其它不相同的相邻残基替换为黑曲霉肌醇六磷酸酶的残基S89D、S92G、A94K、D164S、P201S、G203A、G205S、H212P、G224A、D226T、E255T、D256E、V258T、P265S、Q292H、G300K、Y305H、A314T、S364G、M365I、A397S、S398A、G404A和A405S如实施例3所述将新的蛋白质序列共有肌醇六磷酸酶-7回复翻译为DNA序列(图22)。使用以下寡核苷酸混合物如实施例3所述产生相应的基因(fcp7)；混合物1.7CP-1、CP-2、CP-3、CP-4.7、CP-5.7、CP-6、CP-7、CP-8.7、CP-9、CP-10.7混合物2.7CP-9、CP-10.7、CP-11.7、CP-12.7、CP-13.7、CP-14.7、CP-15.7、CP-16、CP-17.7、CP-18.7、CP-19.7、CP-20、CP-21、CP-22。
寡核苷酸的DNA序列显示于图15中。新合成的寡核苷酸用数字7另外标记。如实施例3所述使用相同的PCR引物装配寡核苷酸后，如实施例8-10所述将基因克隆至表达载体。
在多形汉逊酵母中表达和纯化后测定的pH分布图移至pH谱的酸性范围内，在pH4.5-5.0显示最佳(见图30)。该酶具有宽pH最适谱，从pH2.5到pH6.0至少可达其最大活性的60％。直到pH5.0，其分布图类似于黑曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶的分布图。然而，在pH5.0之下，在黑曲霉肌醇六磷酸酶分布图的pH4.0处它缺乏典型的低点。实施例8共有肌醇六磷酸酶基因在多形汉逊酵母中的表达构建用于转化多形汉逊酵母RB11(Gemssen等人，1994)的肌醇六磷酸酶表达载体，方法是将pBsk-fcp或其变体的EcoRI片段插入多形汉逊酵母表达载体pFPMT121的多克隆位点，这基于酿酒酵母的ura3选择性标记、多形汉逊酵母的甲酸脱氢酶(FMD)启动子元件和甲醇氧化酶(MO)终止子元件。fcp基因的5’末端与FMD启动子融合，3’末端与MOX终止子融合(Gellissen等人，1996；EP 0299 108 B)。产生的表达载体被称为pFPMTfcp、pFPMTfcp10和pFPMTfcp7。
构建的质粒在大肠杆菌中增殖。用现有技术的标准方法纯化质粒DNA。如Gelissen等人(1996)所述使用感受态细胞制备和酵母转化的方法，将表达质粒转化至乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷的多形汉逊酵母株RP11。将每一转化混合物涂板于含2％葡萄糖和1.8％琼脂的YNB(0.14％w/v Difco YNB和0.5％硫酸铵)中，37℃温育。4到5天后挑取单个转化体菌落，在如上所述的液体培养基中37℃生长2天。随后，用一等份该培养物接种装有含2％葡萄糖的YNB培养基的新鲜管瓶。在选择性培养基中另外传代七次后，将表达载体以多聚体的形式整合入酵母基因组中。随后，通过在3ml非选择性液体培养基(YPD、2％葡萄糖、10g酵母提取物和20g蛋白胨)中的两个另外的培养步骤获得有丝分裂稳定的转化体。为了获得遗传均质的重组株，将最终稳定培养物的一等份涂板于选择平板上。分离单菌落，用于在含代替葡萄糖、使fmd启动子去阻遏的2％甘油的YNB中进行肌醇六磷酸酶表达的分析。共有肌醇六磷酸酶的纯化如实施例9所述进行。实施例9其有肌醇六磷酸酶基因在酿酒酵母中的表达以及肌醇六磷酸酶从培养上清液中的纯化从相应的Bluescript质粒(pBsk-fcp、pBsk-fcp10和pBsk-fcp7)中分离共有肌醇六磷酸酶基因，并连接至酿酒酵母表达载体pYES2(Invitrogen，San Diego，CA，美国)的表达盒的EcoRI位点，或如Janes等人(1990)所述，亚克隆于截短的GAPFL(甘油醛3-磷酸脱氢酶)启动子和pho5终止子之间。用PCR检查基因的正确方向。根据Hinnen等人(1978)的方法进行酿酒酵母株如INVSc1(Invitrogen，San Diego，CA，美国)的转化。挑取含有在GAPFL启动子控制下的肌醇六磷酸酶基因的单菌落，在5ml选择培养基(SD-尿嘧啶，Sherman等人，1986)中于30℃猛烈摇动(250转/分)下培养一天。然后将预培养物加入500ml YPD培养基中(Sherman等人，1986)，并在相同条件下生长。根据使用说明书进行gal1启动子的诱导。温育4天后，离心(7000转/分，GS3转头，15分钟，5℃)细胞培养液以去除细胞，经过在Amicon8400目(PM30膜)和ultrafree-15离心过滤装置(Biomax-30K，Millipore，Bedford，MA，美国)中的超滤浓缩上清液。以10mM乙酸钠，pH5.0作为洗脱液，在40ml Sephadex G25超细柱(Pharmacia Biotech，Feiburg，德国)上将浓缩液(10ml)脱盐。将脱盐的样品与2M(NH4)2SO4一起，直接加样于1ml丁基Sepharose 4快速流动疏水相互作用层析柱(PharmaciaBiotech，Feiburg，德国)，用10mM乙酸钠，pH5.0中的从2M到0M(NH4)2SO4线性梯度洗脱层析柱。肌醇六磷酸酶洗脱于穿透液(break-throngh)，浓缩并加样于120ml Sephacryl S-300凝胶渗透层析柱(Pharmacia Biotech，Feiburg，德国)。共有肌醇六磷酸酶和共有肌醇六磷酸酶-7洗脱为均匀的对称峰，SDS-PAGE显示其纯度大约为95％。实施例10共有肌醇六磷酸酶基因在黑曲霉中的表达Bluescript质粒pBsk-fcp、pBsk-fcp10和pBsk-fcp7用作模板，用于基因的起始密码子BspHI位点上游和终止密码子的EcoRV位点下游的引入。使用ExpandTM高忠实度PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)及以下引物引物Asp-1Bsp HI5’-TATATCATGAGCGTGTTCGTCGTGCTACTGTTC-3’用于fcp和fcp7克隆的引物Asp-2
Eco RV3’-ACCCGACTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5’用于fcp10克隆的引物Asp-3EcoRV3’-ACCCTTCTTACAAAGCGAATTCTATAGATATAT-5’如供应商所述进行该反应。PCR扩增的fcp基因在起始密码子处有一个由引物Asp-1引入的新的BspHI位点，它导致第二个氨基酸残基甘氨酸被替换为丝氨酸。随后，用BspHI和EcoRV消化DNA片段，连接至黑曲霉葡糖淀粉酶启动子(glaA)的NcoI位点下游和构巢曲霉色氨酸C终止子(trpC)的EcoRV位点上游(Mullaney等人，1985)。此克隆步骤之后，将基因测序以检测可能的PCR引入的差错。如EP 684 313的实施例9中所述产生的基本对应于pGLAC载体的表达质粒，包含作为选择性标记的粗糙链孢酶(Neurospora crassa)的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyr4)。黑曲霉的转化和共有肌醇六磷酸酶基因的表达如EP684 313所述进行。如实施例9所述纯化共有肌醇六磷酸酶。实施例11肌醇六磷酸酶活性和最适温度的测定基本如Mitchell等人(1997)所述测定肌醇六磷酸酶活性。在含0.5％肌醇六磷酸(≈5mM)的200mM乙酸钠，pH5.0测定混合物中测定其活性。37℃温育15分钟后，通过等体积的15％三氯乙酸的加入终止反应。定量释放的磷酸，方法是将100μl测定混合物与900μl H2O和1ml 0.6MH2SO4、2％抗坏血酸和0.5％钼酸铵混合。用磷酸钾的标准溶液作为参照。一单位酶活性被定义为37℃时每分钟释放1μmol磷酸的酶量。使用根据Pace等人(1995)计算的在280nm处的酶消光系数测定蛋白质浓度共有肌醇六磷酸酶，1.101；共有肌醇六磷酸酶7，1.068；共有肌醇六磷酸酶10，1.039。
对于最适pH曲线，将纯化的酶在10mM乙酸钠，pH5.0中稀释。将稀释的蛋白质等份与等体积的1％肌醇六磷酸(≈10mM)在一系列不同缓冲液中混合以开始温育，缓冲液为0.4M甘氨酸/HCl，pH2.5；0.4M乙酸盐/NaOH，pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；0.4M咪唑/HCl，pH6.0、6.5；0.4M Tris/HCl，pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。对照实验显示混合步骤仅轻微地影响pH。如前所述在37C进行温育15分钟。
将测定混合物中的肌醇六磷酸替换为5mM浓度的各自的磷酸盐化合物，进行肌醇六磷酸酶底物特异性的测定。如前所述进行活性测定。
将酶(100μl)和底物溶液(100μl)在特定的温度下预温育5分钟，进行最适温度的测定。通过向酶中加入底物溶液开始反应。15分钟的温育后，用三氯乙酸终止反应，测定释放的磷酸的量。
原始共有肌醇六磷酸酶的最适pH在pH6.0-6.5左右(70U/mg)。通过Q50T突变的引入，最适pH转变为pH6.0(130U/mg)。K91A引入后，最适pH向酸性pH范围移动一个pH单位，在pH2.5和pH6.0之间显示较高的比活性。也显示了稳定的突变体和共有肌醇六磷酸酶-10的最适pH(图26和图27)。
构建共有肌醇六磷酸酶-7用来将黑曲霉肌醇六磷酸酶NRRL 3135的催化特性转移给共有肌醇六磷酸酶，它具有转移至pH谱的酸性范围内的pH分布图，在pH4.5和5.0之间显示最佳(见图31)。该酶具有宽pH谱，从pH2.5到pH6.0至少可达其增强的最大活性的60％。相比共有肌醇六磷酸酶-1，其底物谱也更类似于黑曲霉NRRL 3135肌醇六磷酸酶。
共有肌醇六磷酸酶-1的最适温度(71℃)比用于计算共有序列的野生型肌醇六磷酸酶的最适温度(45-55℃，表7)高16-26℃。改进的共有肌醇六磷酸酶-10显示最适温度进一步提高至80℃(图33)。使用过量产生的酿酒酵母株的上清液发现共有肌醇六磷酸酶-1-热[8]的最适温度在相同的范围内(78℃)。对于共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A测定到可达82℃的最高最适温度。
表7共有肌醇六磷酸酶和烟曲霉、黑曲霉、E.nidulans和M.Thermophila的肌醇六磷酸酶的最适温度和Tm值。如实施例11所述进行最适温度的测定，如实施例12所述用差示扫描量热法测定Tm值。
实施例12用差示扫描量热法(DSC)对熔点的测定为了测定肌醇六磷酸酶的解折叠温度，按Brugger等人(1997)已发表的使用差示扫描量热法。用50-60mg/ml均质的肌醇六磷酸酶溶液进行检测。应用10℃/分钟的恒定加热率直到90-95℃。
所测定的熔点反映了对于最适温度获得的结果(表7)。设计的最稳定的共有肌醇六磷酸酶是共有肌醇六磷酸酶-10-热-Q50T-K91A，其显示在89.3℃的所选条件的熔解温度。这比使用的野生型肌醇六磷酸酶的熔点高26到33.6℃。实施例13担子菌肌醇六磷酸酶活性位点向共有肌醇六磷酸酶-10-热-O50T-K91A的转移如前所述(实施例5)，将从担子菌肌醇六磷酸酶活性位点衍生的突变引入共有肌醇六磷酸酶10。制备如下5种构建体a)至e)此构建体称为共有肌醇六磷酸酶12，它包含basidio共有序列的所选数量的活性位点残基，其氨基酸序列(consphy12)显示于图33中(前26个氨基酸形成信号肽，下划线标出修正的位置)；将一组突变(组II)转移至共有10序列，即S80Q、Y86F、S90G、K91A、S92A、K93T、A94R、Y95I；类似地，转移另外一组突变(组III)，即T129V、E133A、Q143N、M136S、V137S、N138Q、S139A；类似地，转移再一组突变(组IV)，即A168D、E171T、K172N、F173W；以及最后，转移再另一组突变(组V)，即Q297G、S298D、G300D、Y305T。
如实施例8到10所述表达这些构建体。
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权利要求
1.一种稳定的干燥或液体酶制剂，它包含肌醇六磷酸酶和一种或多种稳定剂，该稳定剂选自a)C5糖，优选地木糖醇或核糖醇，b)分子量600到4000Da、优选地1000到3350Da的聚乙二醇。c)丙二酸二钠盐、戊二酸二钠盐和琥珀酸二钠盐，d)羧甲基纤维素，和e)藻酸盐，优选地藻酸钠。
2.一种稳定的干燥或液体酶制剂，它包含如下交联的肌醇六磷酸酶a)用戊二醛，或者通过b)用高碘酸钠氧化，并且与己二酸二酰肼反应。
3.根据权利要求1或2的酶制剂，其特征在于该肌醇六磷酸酶是一种真菌来源的或共有肌醇六磷酸酶。
4.根据权利要求3的酶制剂，其特征在于该真菌来源的肌醇六磷酸酶选自烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉和黑曲霉肌醇六磷酸酶。
5.根据权利要求1到4中任一个的酶制剂，其特征在于该制剂是液体。
6.根据权利要求5的酶制剂，其特征在于该稳定剂是聚乙二醇，聚乙二醇以10-50％(w/w)的浓度存在于终制剂中。
7.根据权利要求5或6的酶制剂，其特征在于该稳定剂是木糖醇和/或核糖醇，它们以20-60％(w/w)的浓度存在于终制剂中。
8.根据权利要求5到7中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是戊二酸二钠盐、琥珀酸二钠盐和丙二酸二钠盐，该盐在终制剂中的浓度为10-30％(w/w)。
9.根据权利要求5到8中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是羧甲基纤维素，多聚体在终制剂中的浓度为1-10％(w/w)。
10.根据权利要求5到9中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是藻酸钠，多聚体在终制剂中的浓度为1-10％(w/w)。
11.根据权利要求1-4中任一个的酶制剂，其特征在于该制剂是干燥的/固体。
12.根据权利要求11的酶制剂，其特征在于该稳定剂是聚乙二醇，聚乙二醇以1-20％(w/w)的浓度存在于终制剂中。
13.根据权利要求11或12的酶制剂，其特征在于该稳定剂是木糖醇和/或核糖醇，它们以1-20％(w/w)的浓度存在于终制剂中。
14.根据权利要求11或13中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是戊二酸二钠盐、琥珀酸二钠盐或丙二酸二钠盐，该盐在终制剂中的浓度为1-20％(w/w)。
15.根据权利要求11或14中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是羧甲基纤维素，该多聚体在终制剂中的浓度为1-10％(w/w)。
16.根据权利要求11或15中任一个的酶制剂，其特征在于该稳定剂是藻酸钠，该多聚体在终制剂中的浓度为1-10％(w/w)。
17.根据权利要求2-5或11中任一个的酶制剂，其特征在于该肌醇六磷酸酶单体通过戊二醛的加入而交联。
18.根据权利要求2-5或11中任一个的酶制剂，其特征在于该肌醇六磷酸酶单体被交联，方法是用高碘酸钠使糖残基氧化，随后加入己二酸二酰肼。
19.一种制备用于单胃动物的饲料组合物的方法，其特征在于该饲料用根据权利要求1-18中任一个的稳定的干燥或液体酶制剂处理。
20.一种用于单胃动物的饲料组合物，其特征在于该饲料包含一种根据权利要求1-18中任一个的稳定的干燥或液体酶制剂。
21.一种给单胃动物提供磷饮食需要的方法，其特征在于用根据权利要求20的饲料饲养该动物，并且不向饲料中加入另外的磷。
22.一种制备干燥或液体肌醇六磷酸酶制剂的方法，其特征在于使用一种根据权利要求1-18的稳定的肌醇六磷酸酶。
全文摘要
公开了一种稳定的酶制剂,它包含肌醇六磷酸酶和至少一种稳定剂,该稳定剂选自:a)C
文档编号A61K47/10GK1241634SQ9910886
公开日2000年1月19日 申请日期1999年6月28日 优先权日1998年6月29日
发明者R·布鲁格, M·莱曼, M·怀斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司