专利名称：槐果碱作为制备柯萨奇b病毒性心肌炎病因治疗药物的用途及其制法的制作方法
技术领域：
本发明揭示一种治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的药物——槐果碱的用途及其制法，属于药物制造领域。
国内病毒性心肌炎有日益增多趋势，据估计在一次急性病毒性感染中，约有5％的病人的心肌受染，在普通感冒中，有1/3患者可出现心电图异常。国外在常规尸检中约有3.4-9.3％的患者有局灶性或弥漫性心肌炎。若加用免疫荧光技术进行调查，则30％的心脏标本有柯萨奇B病毒抗原。本病的发病率仅次于冠心病，其病原病毒以柯萨奇B(CVB)病毒占首位(占60％以上)，其所致心肌炎临床表现轻重不一，重者可出现泵衰竭、严重心律失常，甚至猝死，有的突然出现心前区疼痛加剧，急性心肌梗死而危在旦夕，有的呈顽固性反复发作或临床表现呈不明显，但其潜在发展所致扩张型心肌病3/4于起病5年内死亡，后果十分严重。但近年来由于分子生物学引入本病的研究，认为本病的病因是由于“柯萨奇B病毒”持续感染所致。以上现状皆因迄今为止尚未发现对抗柯萨奇B病毒的有效药物所致，所以当务之急是寻找对抗柯萨奇B病毒的有效药物。
对于病毒性心肌炎，目前所采用的治疗全为对症治疗，如葡萄糖、氯化钾、胰岛素、辅酶Q10、维生素、抗心律失常药物等。晚近曾有学者报导干扰素在实验小鼠感染CVB3的同时或感染后24小时内使用能有效地减轻心肌炎症状，而在病毒感染24小时后使用则未能阻止心肌炎病毒的增殖。三氮唑核苷虽能抑制病毒RNA的合成，但该药的有效治疗浓度对人体已有毒性。免疫抑制剂和环孢霉素等治疗小鼠急性病毒性心肌炎无有效报导，却有报导用此药物仅可使病情恶化。故以上述及的干扰素、三氮唑核苷、免疫抑制剂和环孢霉素等都不是有效的抗柯萨奇B病毒有效药物。
为寻找对抗柯萨奇B病毒有效药物，我们通过实验从众多的中药中仅筛选出一味苦参，它低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的作用。已有技术中苦参是我国历史悠久的传统中药之一，无论是古代还是现代，对它的研究和应用一直是十分活跃的。苦参始载于我国最早的医学文献《神农本草经》，列为中品，具有清热燥湿、祛风杀虫的功能、主治心腹痞满胀气、症瘕积聚、黄疸，溺有余沥，逐水除痈肿，补中明目止泪，养肝胆气，安五脏，平胃气，令人嗜食、轻身、定志，益精利九窍，除伏热肠癖，止渴醒酒，小便赤黄，疗恶疮下部。我国药典一九七七年版及部分地方药品标本已将《苦豆草流浸膏片》收载主治菌痢及肠炎[中草药学(中册)，一九七六年八月第一版，P494-495，江苏人民出版社]。晚近的动物实验证明，苦参生物碱对中枢神经有抑制、镇痛及降温作用，能提高机体免疫能力，并有抗癌作用。苦参提取物苦参生物碱能治疗乙肝，有改善临床症状及肝功能，使部分患者HbeAg转阴。有文献报导苦参生物碱具有平喘及抗心律失常的作用。江西南昌妇幼保健院曾用苦参生物碱治疗恶性葡萄胎112例[中医杂志，1980年第10期(总767期)，P47]。第三军医大学曾用苦参生物碱对254例喘息型慢性气管炎及支气管哮喘病人进行治疗，证明是一种有效的平喘药物，安全而副作用小[中草药，1980年第12期，P555]。但至今未见苦参生物碱能对抗柯萨奇B病毒的作用及用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的报导。
已有技术中，从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescensAit)及豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥根及其地面部分中所提取的物质，已可分离出20余种生物碱，其中有一种主要的生物碱是槐果碱(Sophocarpine)，分子式为C15H22ON2，熔点为53-54℃,[α]D-32.9°,(t=15，乙醇)，结构式为 参见南京药学院《中草药学》编写组编《中草药学》(中册)，江苏人民出版社8月第一版，P494-495。
本发明目的在于提出一种能用于治疗柯萨奇B病毒所引起的病毒性心肌炎对抗病因的有效药物的用途和制备方法。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的我们通过体外以及Balb/c小鼠的柯萨奇B病毒性心肌炎的动物模型体内，从众多的中药中筛选出一味能对抗柯萨奇B病毒的苦参，在苦参的众多生物碱中再筛选出其有效成分——槐果碱，实验证明当其浓度在312ug/ml以下时对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有效果。当细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/m1至200ug/ml浓度间仍能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，对病毒血症期的小鼠能从血中清除柯萨奇B病毒95.63％-99％。通过3HdR掺入法、MTT比色法、结晶体染色法，证明槐柯碱在200-3.125ug/ml时对Hela细胞的DNA合成代谢、细胞能量合成代谢、细胞存活率都有不同程度的保护，与剂量呈正相关。对患CoxB病毒性心肌炎的小鼠如用槐果碱治疗，大于60％的小鼠均能存活50天以上，且心肌无病理变化，而不用药的对照组100％死于8天内，心肌细胞明显坏死伴淋巴细胞浸润，证实槐果碱是一种低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用，具有用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的用途，从而可以用来制备作为治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的药物。
槐果碱作为柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的制备方法，其技术特征在于a．将苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；b．对总生物碱经甲苯萃取，并通过5-10％盐酸提取槐果碱；c．调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；d．溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；
e．通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。
本发明的技术方案通过实验研究结果如下(一)体外实验(1)建立微量细胞培养法显示槐果碱注射液浓度低于312ug/ml对培养细胞的毒性消失，低于毒性浓度的槐果碱能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，在5ug/ml时仍有保护作用。
(2)建立病毒增殖减少试验表明细胞受感染数(5pFu/细胞)病毒感染时，槐果碱在6.25ug/ml至200ug/m1浓度间均能在Hela细胞上发挥抗CVB3m的作用。其抑制率分别为50％及90％，说明槐果碱在体外试验中能抑制CVB的增殖，并呈一定的剂量依赖性。
(3)建立SDS-PAGE电泳分离和Westernllot免疫印迹试验，通过微量细胞培养法，病毒蛋白质Westernllot，分析了槐果碱的不同浓度(0,6.25,12.5,25,50,100及200ug/ml)对病毒增殖和衣壳蛋白质含量的影响，表明槐果碱在体外试验中能抑制CVB3m的增殖，并呈一定的剂量依赖性。通过病毒吸附和穿入细胞前后槐果碱的比较，显示其能进入细胞内发挥抗病毒作用。它可能不影响CVB3m吸附、穿入等环节，而是影响CVB3m侵入细胞后某环节，特别是病毒的生物合成(包括蛋白的合成)。
(4)3H-TdR(掺入法测定)(氚标记胸腺嘧啶核甘)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的DNA合成代谢的保护作用(见下表1)。
(5)MTT微量检测法(甲基偶氮唑盐)测定槐果碱对CVB3m感染的Hela细胞的能量代谢的保护作用(见下表1)(6)结晶紫染色法(crystol violet)测定槐果碱对cVB3m感染的Hela细胞存活率的保护作用(见下表1)。
表1槐果碱对Hela细胞保护作用的测定MO 1:5
上表(表1)所示当MO 1:5时，槐果碱在200ug/ml至3.125ug/ml时，均对Hela细胞有不同程度的保护作用。在DNA合成代谢、细胞能量合成代谢及细胞存活数的测定值随浓度而增加，呈正相关关系。R分别为0.9818,0.9727,0.9219。
(7)体外病毒增殖抑制试验(即空斑形成减少试验)
注病毒增殖抑制试验，即病毒感染后，在细胞内繁殖，由于细胞用琼脂糖覆盖，病毒只能经细胞-细胞途径进行传播，杜绝了细胞-液体-远处细胞的传播途径。由于一个局部地区细胞的破坏，不能摄取活性饮料中性红，在红色的背景下出现一个空斑，每个空斑由一个病毒感染单位所形成，空斑计数可以准确地表示病毒地滴度。同样，空斑形成减少试验也能准确反映槐果碱抑制CVB3m增殖地程度。表2结果表明随着槐果碱浓度的增高，病毒空斑数逐渐减少，药物浓度与病毒空斑呈直线负相关(r=0.9518)，即槐果碱对CVB3m增殖的抑制作用呈剂量依赖关系，经计算，当槐果碱浓度为200ug/ml时，对CVB3m的抑制率为92％，而低浓度25ug/ml时，其对CVB3m的抑制率仍有67.9％。
(二)体内试验1．槐果碱对CVB3m心肌炎模型病毒血症期增殖抑制作用的微量法测定。
(1)制作病毒性心肌炎的槐果碱治疗模型取小鼠18只，分A、B、C三组。
A．治疗组每鼠接种0.8ml CVB3m悬液，2小时后用槐果碱注射液治疗，50mg/kg分2次/日腹腔内注射。
B．对照组每鼠接种0.8ml CVB3m悬液，2小时后用无菌生理盐水0.2ml二次/日腹腔内注射。
C．空白组每鼠0.2ml生理盐水0.2ml二次/日腹腔注射。
(2)小鼠血清标本的收集至第3天，用75％酒精消毒每小鼠颈部皮肤，置于超净工作台内以无菌手术刀断其一侧颈总动脉，以无菌试管收集血液，静置于室温，待血清析出，将各组内6只小鼠的血清等量混合，每个小鼠0.1ml，三组各0.6ml，分别加入青链霉素，浓度为2000u/ml，置4℃冰箱2小时灭活。
(3)微量法测定各组标本的TCID50(Tissue cultureinfections dose)将上述三组标本10倍递减稀释，从10-1至10-8，在40孔板上，每个梯度做3个复孔，每孔滴25ul样本，另补25ul培养基，最后加50ul浓度为3×105/ml的Hela细胞悬液(含小牛血清浓度为4％)，37℃,5％CO2孵育至第四天观察结果。
(4)空斑减少法测定槐果碱对CVB3m病毒血症的抑制作用将3种标本以各稀释度0.3ml接种于第4天的单层Hela细胞上，每个稀释度做2个复瓶，37℃吸附1小时后，弃标本液，用无牛血清培养基洗2次，用微量法观察三组小鼠血清标本不同稀释度下对Hela细胞的致病变作用。见表3。
上表3表明经计算治疗组血清病毒滴度为
，对照组为
，槐果碱在体内对CVB3m的抑制率为99％。2．体内槐果碱注射液在体内对CVB3m增殖抑制作用的空斑法测定，二组小鼠血清标本不同稀释下，空斑数测得如下
表4表明经空斑法测定，治疗组小鼠血清病毒滴度为26×104÷0.3=8.3×105pFu/ml，对照组为57×105÷0.3=1.9×107pFu/ml，槐果碱对CVB3m的抑制率为1-(8.3×105)÷(1.9×l07)=95.63％。结果表明槐果碱对小鼠急性期CVB3m病毒血症的抑制率为95.63％。
3．槐果碱对柯萨奇B3m病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型心肌病理变化的保护通过槐果碱注射液对造型小鼠体内对抗病毒的研究，均显示出其低毒和明显的抗CVB3m的作用，对用药治疗组的小鼠都能存活50天以上，且心肌无病理变化，而不用药的对照组100％死于8天内，心肌细胞明显坏死伴淋巴细胞浸润。故槐果碱对抗CVB3m的作用，从而对病毒性心肌炎有明显治疗效果。
4．槐果碱在体内诱生干扰素槐果碱能在小鼠脾细胞上诱生干扰素，在L929细胞上以VSL测定干扰素效价，与对照组相比明显增加。
5．槐果碱对培养心肌细胞搏动次数及变化的影响用槐果碱后对已感染CVB病毒的心肌细胞搏动不减，有明显保护作用，对已感染病毒而未用槐果碱处理的对照者，其心肌细胞搏动甚微，甚至消失。前者上清液中心肌酶活性和LDH释放甚少；后者则明显增加。
6．用定性定量PCRCVBRNA的方法(激光扫描)检测CVB3m造型Balb/c小鼠心肌匀浆中CVBRNA，用槐果碱注射液治疗后与不用槐果碱治疗者二者相比，心肌匀浆中CVBRNA的清除率为99.38％。
(三)槐果碱的临床研究我院已总结70例用槐果碱注射液[沪卫药剂(95)-005(仁剂)]静脉滴注治疗的病毒性心肌炎(CVBRNA持续感染者)，并与50例用GIK-葡萄糖、胰岛素、氯化钾静脉滴注者作对照，静脉点滴槐果碱后临床症状疗效达87-95％，抗心律失常疗效达75-87.5％，ST段回升，EF％、SV、CO、CI均上升，细胞免疫提高，与GIK相比P＜0.01，对血中CVBRNA持续阳性者用槐果碱5-6mg/kg时，CVBRNA清除率为45.8％,7mg/kg时为55.5％,8-9mg/kg时为81.25％。采用高效液相色谱法(HPLC)测定槐果碱的血浓度，证明CVBRNA的清除率与所用槐果碱的用药剂量与血中所测血药峰浓度呈正相关，无明显副反应。
本发明的明显特点是1．槐果碱可以作为一种治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的有效药物。
2．治疗病毒性心肌炎重在治本，即重在病因治疗。槐果碱将病毒清除后，心律失常得以控制，胸闷气促得以解除，本药源于清热化湿药，故低热、全身乏力、酸痛等解除。
3．心肌内病毒清除后，心排量得以增加，心功能得以恢复，免疫力得以提高。
4．药源丰富，制备方法操作简便，成本低，适用于工业化生产。
下面结合实施例，对本发明作进一步描述实施例将10千克苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，8％硫酸萃取，获得总生物碱，再经甲苯萃取，并通过足量7％盐酸提取槐果碱，调节pH值为8，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品，得率为0.12％。取一定量的槐果碱精品溶解于注射用水中，经过滤，含量测定，调节pH值为4，再通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，最后经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。
权利要求
1．槐果碱作为制备柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的用途，它的结构式为 本用途的特征在于槐果碱是一种低毒并具有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用，具有用于治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的用途，从而可以用来制备作为治疗柯萨奇B病毒性心肌炎疾病去除病因的药物。
2．如权利要求1所述的槐果碱作为柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物的制备方法，其特征在于a．将苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；b．对总生物碱经甲苯萃取，并通过5-10％盐酸提取槐果碱；c．调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；d．溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；e．通过0.65μm微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。
全文摘要
本发明是一种对柯萨奇B病毒性心肌炎病因治疗药物——槐果碱的用途及其制法,它具有低毒而有明显对抗柯萨奇B病毒的生物合成(包括蛋白的合成)和进入细胞内发挥抗病毒作用的特点,其制造工艺亦具有成本低,药源丰富,制备方法操作简便,适用于大规模生产等特点。
文档编号A61P31/12GK1303673SQ99119850
公开日2001年7月18日 申请日期1999年10月26日 优先权日1999年10月26日
发明者陈曙霞, 刘晶星, 王平全, 张军胜 申请人:上海第二医科大学附属仁济医院