专利名称：具有类甾族化合物结构的物质、其制造方法和含有该物质的抗肿瘤剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及从冬虫夏草中分离具有抗肿瘤活性的活性馏分和其中所含活性成分的方法以及该活性成分的化学结构。并且涉及含有该活性馏分或活性成分的抗肿瘤剂。
背景技术：
冬虫夏草是一种子实体，它寄生于蝶蛾类鳞翅目和鞘翅目的昆虫或其幼虫体内，在它们的体内形成菌核，然后在夏季形成于作为宿主的昆虫或其幼虫的虫体表面上。已知在世界上的冬虫夏草约有350种，自古已知，冬虫夏草对人体完全没有毒性并且显示各种各样的效果，因此它是一种可作为中药经口服用的物质，今日在中国已将冬虫夏草录载于作为与中药有关的书刊的“中草药学”或“中药大辞典”等书刊中，即使在日本也已将冬虫夏草记载入“新订和汉药”及其他许多中文书籍中。
作为记载于各种书籍中的药理作用，冬虫夏草具有增强精力、滋养强壮、治疗循环器官系统疾病(日本药理学会志，67卷，213页，1995年)、糖尿病[Biol．Pharm．Bull16卷，1291-1293页(1993)；同一杂志，19卷，294-296页(1996)]、肝病[Prog．Med12卷，1172-1174(1992)]等效果。另外，通过近年来的药理学研究证实，冬虫夏草真菌在许多方面具有活性和药理作用，还报导了它的抗肿瘤和免疫增强作用等[《日本免疫学会学术记录》18卷，665页(1988年)；《日本细菌学会志》45卷，763页(1990年)；J．Kanazawa《Med．Univ》17卷，330-335页(1992)]。
然而，对完全纯化的冬虫夏草的活性成分进行的研究和在临床上应用的例子却很少[J．Am．Pharm．Ass46，114-118(1957)；特开平8-81386号公报]，因此，在把未经纯化的提取物用于投药时，必须使用较多量的冬虫夏草原未或锭剂，这是存在的问题，另外，在药理作用的均一性和可靠性方面也存在问题。另外，关于从冬虫夏草提取的活性物质的分类或限定以及其药理作用的机制方面的研究几乎未见报导，即使在已被确认具有最多种类冬虫夏草生长的以中国为首的亚洲诸国中，冬虫夏草也是被作为葛根汤等汤剂处方中的药草煎汤服用，只是根据不同地区的习惯和信仰有不同的服用方式，这是目前的现状，在此情况下不能达到确实地维持稳定的药理效果的目的。
因此，为了能够确实而且有效地利用冬虫夏草的药理作用，特别是其抗肿瘤和增强免疫力等药理效果，人们强烈地希望开发一种用于从冬虫夏草的成分中分离出具有上述活性的活性成分的分离方法。
发明内容
本发明着眼于冬虫夏草所具有的抗肿瘤效果，其目的是提供一种能够以纯品状态获得具有上述效果的化合物的分离方法。另外，本发明的另一个目的是提供一种具有上述抗肿瘤效果的化合物。进而，本发明的再一个目的是提供一种含有上述化合物的抗肿瘤剂。
对附图的简单说明
图1A是本发明用于从冬虫夏草中提取活性馏分和活性成分的一般流程图。
图1B是在实施例1中使用的本发明从冬虫夏草中提取活性馏分和活性成分的流程图。
图2是色谱图，其中示出了在实施列1中获得的按本发明分离纯化的化合物(Ⅱ)的反相色谱。箭头所指处是化合物(Ⅱ)的峰。其中示出的保持时间是以样品注入时间作为0分测得的时间。
图3是质谱图，其中示出了在实施例1中获得的作为本发明活性成分的化合物(Ⅱ)的质谱数据。
图4是表示本发明的活性馏分(图1B的C5馏分)对细胞增殖的抑制作用(浓度相关性)的曲线图。图中分别示出了在使用纤维芽细胞(以○表示)和Hela细胞(以●表示)时的结果。
图5表示按照本发明方法分离、提取的各馏分(图1B的C1～C10馏分)对Vero细胞所起的细胞增殖抑制作用。
图6表示按照本发明方法分离、提取的各馏分(图1B的C1～C10馏分)对Hela细胞所起的细胞增殖抑制作用。
图7是照片，其中示出了DNA碎裂的结果和Hela细胞内的染色质凝聚(24小时)的情况。
图8是照片，其中示出了DNA碎裂的结果和Hela细胞内的染色质凝聚(72小时)的情况。
图9是表示Hela细胞DNA的电泳结果的照片。其中，泳道1～4表示在24小时之后的结果，泳道5～8表示在48小时后的结果，泳道9～12表示在72小时后的结果。M和数字分别表示分子量标记和标记用分子量。
用于实施发明的最佳实施方案A．本发明是一种用于分离冬虫夏草中所含的抗肿瘤活性馏分和活性成分的方法，其特征在于，将冬虫夏草的子实体部分干燥，再将该已干燥的子实体部分粉碎以制成干燥的粉碎试料，将该试料用水溶性溶剂提取以制成提取液，将该提取液浓缩以制成粗提取物，将该粗提取物用硅胶柱色谱法至少处理1次以分离出具有肿瘤细胞增殖抑制作用的洗脱馏分，以此作为活性馏分，然后将该活性馏分用色谱法分离纯化，获得具有肿瘤细胞增殖抑制作用的活性成分(图1A)。
对于作为适用于本发明中的提取原料的冬虫夏草的子实体，没有特别限制，只要是能够寄生于一般公知的蝶蛾类鳞翅目和鞘翅目的昆虫及其幼虫体内并在其中形成菌核，到夏季时就形成于作为宿主的昆虫及其幼虫的躯体表面上的子实体即可。在本发明中，作为特别适用的冬虫夏草，可以举出那些能够寄生在蝙蝠蛾科的幼虫(Hepialus armoricanusOber)体内并在其中形成菌核，到夏季时就从该昆虫头部形成根棒状的子实体的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)。另外，在Cordyceps sinensis以外的冬虫夏草中，作为生药具有药效的冬虫夏草已知的还有Cordyceps sobolifera B和蛹虫草(Cordyceps militaris Link)和Cordyceps nutans Pat等，这些冬虫夏草也很适用于本发明中。只要这些冬虫夏草能够产生具有如下所述的抗肿瘤效果，就可以利用本发明的方法从其中提取(分离)出这些活性成分。另外，使用本发明的方法，可以无区别地对子实体或被子体进行提取，但是为了获得特别高的产率，优选是从冬虫夏草的子实体中提取。
作为从该原料中提取分离具有抗肿瘤活性的活性馏分或活性成分的方法，可以使用通常用于从植物中提取物质的方法，对此没有特别限制，但是本发明在下文示出了特别好的提取分离方法。另外，在分离这些具有抗肿瘤活性的活性馏分或活性成分时使用的对该活性的判定方法也没有特别限制，可以容易地选择使用通常公知的方法。具体地说，可以选择特定的肿瘤细胞，然后根据对该细胞的增殖所起的抑制效果来进行判定。
如图1A所示，本发明的方法一般由以下的工序构成。
(1)对作为原料的冬虫夏草的子实体部分进行干燥的工序，使用该工序的原因是在作为原料的冬虫夏草的含水量非常高的情况下，在后续的提取工序中极性物质也一起被提取出来，因此在多数情况下都会对利用色谱法的分离纯化处理产生不良影响。对该干燥方法没有特别限制，但是优选使用适当大的干燥箱。另外，对干燥温度也没有特别限制，但优选是在35～60℃左右的温度范围内。在必要时优选进行送风干燥。另外，为了防止不必要的光分解，优选是在黑暗场所进行干燥。
(2)通过把工序(1)中干燥了的子实体部分粉碎来制备干燥粉碎试料的工序，通过该工序可以提高后续的提取效果。对粉碎的方法没有特别限制，可以使用通常的研磨机或粉碎机进行研磨或粉碎。
(3)使用溶剂来浸取在工序(2)中获得的干燥粉碎试料的工序，通过该工序可以在除去溶剂后获得粗提取物。作为适用于本发明中的提取溶剂，可以是水溶性溶剂或非水溶性溶剂。作为水溶性溶剂，具体地可以举出甲醇或其他低级醇，它们可以单独使用或者与缓冲液、水组合使用。另外，作为非水溶性溶剂，具体地可以举出乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等。特别优选是甲醇或乙酸乙酯，用这两种溶剂进行提取可以获得最高的回收率与提取率。
(4)通过除去提取溶剂和浓缩来制备粗提取物的工序，对该工序没有特别限制，例如可以在减压下除去溶剂。另外，在必要时也可以在减压下将粗提取物干燥。
(5)利用柱色谱法处理在工序(4)中获得的粗提取物以便从其中分离出具有肿瘤细胞增殖抑制作用的成分的分离工序，通过该工序可以获得含有该成分的洗脱馏分。如有必要优选将该工序重复操作2次以上。这时，为了判别具有抗肿瘤活性的活性馏分，可以顺次地测定洗脱的各级馏分的抗肿瘤活性。
对于柱色谱法来说，可以使用公知的各种性质的柱材料，但是在本发明中，优选使用硅胶柱色谱法。另外，技术人员可以根据上述粗提取物的量、杂质的含量、所希望的分离程度(纯度)等适宜地选择可供使用的硅胶的种类、粒径、填充量、柱子长度等条件。另外，通过将硅胶柱色谱法重复操作两次以上，可以获得具有更高纯度的活性馏分。
作为最初(第1次)的硅胶柱色谱法的洗脱溶剂，没有特别的限制，可以是非极性溶剂、非极性溶剂与极性溶剂的组合或者仅仅是极性溶剂，它们可以单独使用或者组合使用。在本发明中特别优选使用正己烷-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇等的溶剂混合液，技术人员可以容易地在适宜调节这些溶剂混合物的混合比之后再加以使用。对洗脱的馏分级数没有特别限制，只要达到可以区别出各级馏分活性变化的程度即可(具体地在实施例1中如图1B所示，为5级左右)。在洗脱的各级馏分中，取得了活性(对肿瘤细胞具有特异增殖抑制作用的活性)最高的馏分(具体地是实施例1的图1B中示出的F4)。
在为了取得具有更高纯度的活性馏分或者为了单独分离出活性成分的情况下，可以将该馏分再用硅胶柱色谱法处理。在此情况下优选使用一种非极性程度更高的溶剂作为洗脱溶剂，具体地是利用二氯甲烷与甲醇的混合液，通过逐渐调节溶剂的混合比，可以获得具有更高纯度的活性馏分(具体地是实施例1的图1B中示出的C5)。对洗脱的馏分级数没有特别限制，只要达到可以区别出各级馏分活性变化的程度即可(具体地在实施例1中如图1B所示为10级左右)。
(6)用色谱法从工序(5)获得的活性馏分中单独分离出活性成分的工序，利用该工序可以从冬虫夏草中分离出其中所含的具有抗肿瘤活性的活性成分的化合物(1)。为了达到这一目的，可以使用各种具有高分离能力的色谱法，其中特别优选使用薄层色谱法(以下称为TLC)和／或高效液相色谱法(以下称为HPLC)。作为这些色谱法中的载体，可以是顺相载体或反相载体，其中特别优选是反相载体。通过该色谱法处理，可以获得一种在HPLC上显示单一峰的完全纯化的活性成分[化合物(Ⅰ)](图2)。可以利用在该条件下在HPLC上呈现的峰的位置(例如保持时间)或在TLC上的斑点的位置(例如Rf值)来比较并确认本发明的化合物(Ⅰ)。对于TLC载体的种类、展开溶剂或HPLC载体的种类、柱子的长度、洗脱溶剂的种类、溶剂的流量等条件，技术人员可以容易地根据通常公知的方法来选择。
使用本发明的方法，可以从100g冬虫夏草的子实体中获得100mg至10mg的上述化合物(Ⅰ)，但是也可以根据需要改变提取方法，这样也可能获得更高的产量和更高的收率。
B．如上所述，用本发明的方法分离纯化的在冬虫夏草中所含的作为抗肿瘤活性成分的化合物(Ⅰ)，根据各种物理化学的测定结果(根据其性状、各种化学特性试验、元素分析、分子量测定、质量分析、红外线共振吸收光谱、紫外可见光吸收光谱、核磁共振吸收光谱及其他化学结构分析方法等)，表明它是一种一般具有由以下通式(Ⅰ)表示的类甾族结构的物质。 其中，R通常是由-CO(CH2)nCH3表示的酰基(n是0～5的整数)。更具体地说，R是乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基。在实施例1中分离出的化合物是一种具有n=0的酰基的化合物(式(Ⅱ))。根据该结构可以认为，它是一种迄今为止尚未被人们所知的具有全新的类甾族骨架的化合物。应予说明，该化合物也包含其异构体(含几何异构体和光学异构体)。
这些化合物也可以按照上文说明的本发明的方法获得，但对此没有限定。根据这些化学结构式，利用以往公知的类甾体的化学合成方法可以较容易地设计一种合成线路并根据该线路合成出上述化合物。
C．本发明的抗肿瘤剂的特征在于，其中含有在上文A．和B．中说明的冬虫夏草中含有的具有抗肿瘤活性的活性馏分或活性成分。也就是说，按照上述方法获得的化合物(Ⅰ)对肿瘤细胞具有特异显著的增殖抑制效果。作为其作用机制，可以预料，这是由于化合物(Ⅰ)能够直接或间接地切断肿瘤细胞的DNA的缘故。也就是说，化合物(Ⅰ)尽管对正常细胞完全不显示增殖抑制作用，但是对肿瘤细胞却具有特异的增殖抑制效果，因此可作为抗肿瘤剂使用。
在将化合物(Ⅰ)作为医药品制剂使用时，可以将其单独使用或者与公知的抗癌剂、甾类等的治疗药组合使用，可以将其直接使用或者与公知的赋形剂一起制成锭剂、胶囊剂、注射剂、栓剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、洗剂、气雾剂、口腔剂、硬膏剂、敷剂、点眼剂等适宜的药物剂型使用。
通常可以按全身的或局部的、经口的或非经口的方式投药。投药量可以根据患者的症状、年龄、性别等适宜地决定，通常在对成人投药时，可以将式(Ⅰ)的化合物按照每次投药量10～500mg左右和每天约1至数次的用量投药。
下面示出本发明的实施例，但本发明不受下面实施例中记载的内容的任何限制。
(实施例1)抗肿瘤活性成分的提取按照图1B的流程进行。将100g冬虫夏草的子实体部分置于干燥箱(温度为45～50℃的暗处)中加热干燥，用粉碎机粉碎后用10倍量的甲醇(W／V)浸泡24小时，将浸出液减压浓缩。然后将粗提取物吸附于第1阶段的硅胶色谱柱(35×300mm，Silica gel 60，63～100μm，Merck公司制)中，使用正己烷、1∶1的正己烷／乙酸乙酯、乙酸乙酯、1∶1的乙酸乙酯／甲醇、甲醇作为溶剂，这些溶剂的极性依次逐渐增加，分离出被1∶1的乙酸乙酯／甲醇洗脱的部分(F4层)。
然后，将F4层吸附于第2阶段的硅胶色谱柱(35×300mm，Silicagel60，63～100μm，Merck)中，使用二氯甲烷与甲醇的混合液作为提取溶剂，在逐渐提高甲醇的混合比的条件下进行洗脱，获得了C5层的洗脱部分。进而为了获得活性成分，用正己烷／乙酸乙酯(1∶1V／V)作为展开液，使硅凝胶薄层色谱(TLC Plate Silica gel 60，F254，Merck公司制)展开2次以除去C5层的杂质，回收Rf值在0．5～0．7范围内的试料。
然后把回收的试料添加入反相式高效液相色谱仪中，该色谱仪使用含有1％(V／V)甲醇的二氯甲烷作为洗脱溶剂，以二氧化硅柱(3．9×150mm，Nova-Pak C18，Nova Biochemicals公司制)作为柱子固定相，将洗脱溶剂的流速设定为1ml／min，将紫外光谱测定器的波长设定为254nm，获得了完全纯化的活性成分50mg。用反相色谱法对该完全纯化的化合物进行分析，结果示于图2中，在该条件下显示出单一的峰。另外，所获的活性成分化合物具有下述物理化学性质(1)性状茶褐色，油状(室温)(2)分子式C31H58O6(3)碎片质谱法(FAB)(m／z)512(基峰，下同)、482、437、393、349、305、261、217、175、149、133(图3)(4)红外吸收光谱(cm-1)3300(OH)、1725(C=O)、1645(C=C)、1430(CH3)、1370(CH3CO)、1172(C-CO)、1138(C-O)(5)紫外吸收光谱(λmax；nm)225由这些结果可以推断，上述获得的化合物的化学结构式符合以下的式(Ⅱ)。 (试验例1)为了证明含有从冬虫夏草提取的活性化合物的活性馏分对肿瘤细胞的增殖具有特异的抑制作用，使用Vero和Hela细胞进行了增殖抑制作用的研究。此处，Vero是由小猴子的肾脏获得的肿瘤细胞系统，Hela是由人的子宫颈获得的肿瘤细胞系统。
将这些细胞用FCS-MEM培养基培养，用胰蛋白酶处理各细胞，然后用不含FCS的RPMI培养液洗涤3次。将试验前的细胞密度调整为50000个／ml。向一块具有96个凹孔的平底凹孔板上滴下含有各种细胞的悬浮液，每一个凹孔中滴下200μl悬浮液。
一天以后，吸取培养液，向试验孔中滴下活性成分溶液200μl，向对照孔中滴下DMSO溶液200μl，在5％的CO2气氛中和在37℃的温度下培养3天。向每个凹孔中添加10μl作为染色试剂的Alarmer Blue试剂，进而培养3小时，然后根据分光学的测定(570nm和600nm)按照以下公式决定肿瘤细胞增殖抑制作用。
公式增殖抑制作用=100％-[(试验孔的吸光度／对照孔的吸光度)×100％]另外，使用同样的实验对纤维芽细胞进行评价。结果示于图4～图6中。
图4示出了活性馏分C5对肿瘤增殖细胞的抑制作用与浓度的依赖关系，可以看出，对于各种细胞都可看到与提取物用量有关的抑制作用。图5示出了各馏分C1～C5(以及作为对照物添加的DMSO)对Vero细胞增殖的抑制作用(以细胞存活率表示)，可以看出，与对照物相比，本发明所有馏分都具有显著的抑制作用。另外，图6示出了各馏分C1～C5(以及作为对照物添加的DMSO)对Hela细胞增殖的抑制作用(以细胞存活率表示)，可以看出，与对照物相比，特别是C5馏分具有十分显著的抑制作用。
从这些结果可以看出，本发明的活性馏分和活性成分对肿瘤细胞显示特别显著的增殖抑制作用。
(试验例2)为了证明从冬虫夏草提取的活性馏分对肿瘤细胞的DNA显示特异的切断作用和具有抗肿瘤作用，研究了该活性馏分对Hela细胞中的DNA的切断作用。在一个φ10cm的培养皿中配制一种细胞密度为1×106个／ml的Hela细胞悬浮液，将其培养，然后向其中滴下200μl活性馏分溶液。然后分别在24、48、72小时之后各取50μl细胞，将其置于400μl的培养液(含有Tris-EDTA、SDS、Proteinase K)中，在5％CO2气氛中于37℃下培养一夜。将其添加到盐中，离心分离分解的蛋白质，将上清液加入乙醇中以进行沉淀。
将该沉淀物悬浮于一种含有RNase A的Tris-EDTA缓冲溶液中，2小时后将其在琼胶上展开，在用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后将其进行电泳，在紫外光的照射下进行观察。结果如图7和图8所示，可以确认在细胞核内有染色质凝集，另外，如图9所示，电泳的结果也表明DNA已发生低分子量化，因此可以看出，由于活性化合物的作用，使得在肿瘤细胞内产生了细胞凋亡。
工业实用性本发明可用于分离冬虫夏草中所含的抗肿瘤活性馏分或活性成分。另外还查明了具有该活性的成分的化学结构。并且可以提供一种含有在冬虫夏草中所含的抗肿瘤活性馏分或活性成分的抗肿瘤剂。
权利要求
1．冬虫夏草中的抗肿瘤活性馏分和活性成分的分离方法，其特征在于，将冬虫夏草的子实体部分干燥，再将该已干燥的子实体部分粉碎以制成干燥的粉碎试料，将该试料用水溶性溶剂提取以制成提取液，将该提取液浓缩以制成粗提取物，将该粗提取物用硅胶柱色谱法至少处理1次以分离出具有肿瘤细胞增殖抑制作用的洗脱馏分，以此作为活性馏分，然后将该活性馏分用色谱法分离纯化，获得具有肿瘤细胞增殖抑制作用的活性成分。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述的活性成分是一类满足下述(1)～(5)的特性的化合物，所说特性是(1)性状茶褐色，油状(室温)(2)分子式C13H58O6(3)碎片质谱法(FAB)(m／z)512(基峰)、482、437、393、349、305、261、217、175、149、133(4)红外吸收光谱(cm-1)3300、1725、1645、1430、1370、1172、1138(5)紫外吸收光谱(λmax；nm)225
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述活性成分是由下述式(1)表示的化合物 式中，R是由-CO(CH2)nCH3表示的酰基，式中的n是0～5的整数。
4．含有权利要求1所述活性馏分的抗肿瘤剂。
5．含有权利要求1所述活性成分的抗肿瘤剂。
6．含有权利要求2所述化合物的抗肿瘤剂。
7．含有权利要求3所述化合物的抗肿瘤剂。
全文摘要
本发明提供一种能够以纯品状态从冬虫夏草中分离出具有抗肿瘤效果的化合物。进而,本发明查清了上述具有抗肿瘤效果的化合物的化学结构。另外,本发明的目的是提供含有该化合物的抗肿瘤剂。
文档编号A61P35/00GK1291989SQ9980332
公开日2001年4月18日 申请日期1999年2月25日 优先权日1998年2月27日
发明者潘台龙, 后藤茂, 陈肇隆 申请人:久光制药株式会社