专利名称：筛选治疗剂的方法
技术领域：
本发明涉及核苷酸序列，特别是授予TGFβ和活化素和结合Smad蛋白的转录调控序列，涉及该序列在例如筛选用于治疗与Smad-介导的TGFβ-诱导的基因不正常表达相关的疾病的药剂中的用途。
β转化生长因子(TGFβ)属于细胞因子家族，包括活化素和骨形态发生蛋白，其由很多细胞类型合成并且具有多种细胞和生物作用，包括控制增殖，分化，迁移，免疫性和调节胞外基质的更新。其中很多涉及TGFβ，以TGFβ-1为例，作为转录激活因子而起作用。已知几种启动子由TGFβ诱导，包括1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAl-1)，α2(Ⅰ)前胶原，TGFβ-1本身，种系Ⅰgα恒定区，依赖于细胞周期蛋白的激酶(CDK)抑制剂p21和p15。
蛋白质Smad家族成员在通过没有完全阐明的机理介导TGFβ和活化素转录活化中起着必不可少的作用。已经证明果蝇属MAD定向进化同源蛋白的氨基末端部分结合对于转录调控是重要的退化基因的增强子(Kim等，自然，1997，388，304-308)。非洲爪蟾属Smad2和Smad4蛋白是称之为活化素-应答因子(ARF)也包含FAST-1转录因子的蛋白质复合体的成分。ARF结合诱导活化素的非洲爪蟾属Mix.2启动子的能力是FAST-1赋与的并且提出Smad2/Smad4作为辅激活物起作用(Chen等，自然，1996，383，691-696；Chen等，自然，1997，389，85-89)。在涉及TGFβ信号的那些Smad蛋白中，已知Smad6和7作为TGFβ信号途径的抑制剂而起作用，已知Smad2和3介导TGFβ信号途径，并且已知Smad4形成包含至少Smad2和3的异型寡聚物(Heldin等，自然，1997，390，465-471)。已经证明Smad4结合制备的构建物的DNA序列，但是这种结合活性不带来依赖TGFβ的转录活性作用(Yingling等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，1997，17，7019-7028)。
现在我们证明了包括两种蛋白质Smad3和Smad4和DNA的复合体的存在，并且证明Smad3，Smad4是DNA结合蛋白。我们还证明在外显子中剪接的Smad2是一种DNA结合蛋白。此外，我们鉴定了TGFβ响应启动子中的Smad3/4-结合序列并且证明Smad3/4的结合对于TGFβ诱导的转录作用是必须的。
已知很多疾病状态与TGFβ控制的基因表达的变异有关，包括纤维变性疾病，异常的伤口愈合，异常的骨生成，癌发生，造血，神经保护和免疫和炎症疾病。研究最多的是PAL-1基因，其是TGFβ激活的基因之一。由几种细胞类型产生PAL-1蛋白质，包括内皮细胞，成纤维细胞，上皮细胞和肝实质细胞。其依靠其对各自催化从纤溶酶原生成纤溶酶的尿激酶(U-PA)和组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的抑制作用间接控制丝氨酸蛋白酶纤溶酶的活性。
纤溶酶直接地通过消化基质成分和间接地通过其激活基质降解酶的潜伏形式而在胞外基质的生成和保持中起着重要的作用。纤溶酶的主要作用是去除血纤蛋白凝块。因此纤溶酶对于维管结构(即血纤蛋白)和基质具有双重特异性。因为纤溶酶的水平是由PAL-1控制的，因此PAL-1在影响纤溶性平衡和控制纤维病变的量中起着重要作用。调节基质沉积的能力对多种指征在治疗上是重要的，所述指征包括伤口愈合，肥大伤疤，瘢痕瘤，scleroclerma，肝和胆囊纤维化，肺纤维化，肾纤维化，血管纤维化和术后粘连(Franklin,Int.J.Biochem.CellBiol.,1997,29,78-89)。当前没有对于纤维变性的治疗方法。
我们发现Smad3，Smad4和在外显子3中剪接的Smad2是DNA结合蛋白，其结合TGFβ激活的启动子，例如PAL-1，这一发现为开发出治疗与通过调节Smad3或Smad4或外显子3中剪接的Smad2(或者事实上任何包含Smad3或Smad4的蛋白质复合体)与其识别序列的结合或转录活性而完成的Smad-介导的TGFβ基因调节相关的疾病的新的方法铺平道路，从而影响筛选能调节TGFβ-调控基因表达，通过影响包含Smad的复合体(即Smad3和Smad4和在外显子3中剪接的Smad2)结合其识别序列的程度，或结合于其基因启动子中的识别序列的Smad的复合体(即Smad3和Smad4和在外显子3中剪接的Smad2)的转录能力而用于治疗的基因药剂的方法。
因此，根据一个方面，本发明提供筛选用于治疗与通过Smad和TGFβ或活化素进行的基因调控相关的疾病的试剂的方法，所述方法包括检测或分析在所述试剂存在下Smad蛋白或其DNA结合片段和包括5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的双链寡核苷酸之间的转录活性或结合的程度和结果，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
我们将该序列称之为CAGA盒。如这里所使用的，术语CAGA盒用来不只是指我们在PAL-1启动子中鉴定的该序列而且指功能上与这样一个序列相同的任何序列，即指能各个地或者作为Smad蛋白复合体的一部分结合Smad蛋白，从而使这样的结合对于这样的功能等价序列控制下的基因的TGFβ和活化素调节是必须的步骤的任何核苷酸序列。
如这里所使用的，术语“筛选”包括研究能调节，改变，影响或干涉Smad蛋白和CAGA盒之间的结合或者与CAGA盒结合的Smad蛋白的转录能力的制剂的作用的任何方法或测试，包括其中研究单一试剂或化合物的结合测定法，以及其中测定一种以上化合物，例如一批化合物或一组化合物的测定法.在测试一种以上试剂的情况下，这些测试可以同时或依次进行。这样的试剂的作用可以是或者干涉Smad蛋白例如Smad3或Smad4或在外显子3中剪接的Smad2与CAGA盒序列的结合，或者它们可以增强Smad蛋白和CAGA盒之间的结合。这样的试剂的作用还可以是调节与CAGA盒序列例如Smad3或Smad4在外显子3中剪接的或Smad2结合的Smad蛋白的转录活性，即降低与CAGA盒结合的包含Smad的复合体的转录活性，或者它们增强与CAGA盒结合的包含Smad的复合体的转录活性。检测和测定方法包括是否存在任何结合或转录活性，和受试试剂的作用的任何定量，定性或半定量测试。对于筛选治疗与Smad3/Smad4/在外显子3中剪接的Smad2/TGFβ/活化素调控相关的疾病中有治疗意义的试剂，其优选是筛选试验所研究的对Smad3/Smad4/在外显子3中剪接的Smad2/DNA复合体形成或者转录活性有调节作用的化合物。
这里所使用的术语“Smad蛋白”指具有结合其受体序列(CAGA盒)的或者单独或者作为蛋白复合体的例如Smad3或Smad4或在外显子3中剪接的Smad2的Smad蛋白结合特征的蛋白质或蛋白复合体，并且包括这些蛋白的DNA结合片段，包含这些蛋白的融合蛋白和修饰物，以及指Smad3和Smad4和在外显子3中剪接的Smad2的蛋白本身。
在一个优选的方面，双链寡核苷酸包括序列AG(C/A)CAGACA，其是我们在PAL-1启动子中鉴定的序列。我们已经鉴定序列AG(C/A)CAGACA存在于已知介导TGFβ转录诱导的区中人PAl-1启动子中的三个拷贝中。在已知TGFβ可诱导的其它启动子和增强子包括α2(Ⅰ)前胶原，种系Igα恒定区和TGFβ-1启动子本身中也已经鉴定出了该序列和与该序列非常相似的包括-CAGA-基序的序列。这些序列在表1中列出并且包括在术语CAGA盒中。
表1
在一个方面，用于本发明筛选试验的寡核苷酸包括CAGA盒本身。但是，CAGA盒可以包括位于一端或两端的侧翼序列。这样的序列可以将CAGA盒的一个链的长度延长例如3个核苷酸至总共12个核苷酸，或者在一端延长3个核苷酸，或者在一端延长2个核苷酸，而在另一端延长1个核苷酸，或者它们可以将该序列延长6个核苷酸至总共15个核苷酸，所增加的碱基位于CAGA盒自身的一个终端或分布在其两端，或者侧翼序列可以将CAGA盒的一条链进一步延长至总共20个核苷酸或者更多，例如最多30，40或50个核苷酸。在本发明中使用的寡核苷酸可以包括CAGA盒本身，或者延长10个核苷酸，优选延长最多20个核苷酸和优选延长最多50个核苷酸的CAGA盒。任选地带有侧翼序列的CAGA盒可以在本发明中使用的寡核苷酸中重复例如最多50次，优选最多20次，例如最多10次。这里所使用的术语试验寡核苷酸包括CAGA盒和以CAGA盒为基础的所有这些寡核苷酸。优选地，该序列与AP-1结合位点不同。
在一个优选方面，Y代表C，A或G。
对于在本发明方法中的应用，试验寡核苷酸可以是化学合成的或者它们可以是基因组的或者cDNA片段或者插入到重组载体中的，例如以质粒或噬菌体为基础的载体。
在一个方面，本发明涉及比较存在试验试剂下和不存在所述试剂的条件下，Smad蛋白和试验寡核苷酸之间的结合或者与试验寡核苷酸结合的包含Smad的蛋白复合体的转录活性。
我们证明了在Smad介导的TGFβ诱导中，特别涉及TGFβ诱导的CAGA盒。因此，当克隆在TK启动子上游多个拷贝中时，发现CAGA盒序列具有在HepG2细胞中产生TGFβ介导的转录诱导的性能，但是该序列的突变形式，AGCTACATA，即包含3个位点突变的序列不具有TGFβ诱导的性能。我们证明了在从缺乏Smad4的乳腺癌衍生的人上皮细胞MDA-MB4648细胞中，在TGFβ介导的诱导中Smad4是必需的，其中TGFβ对于CAGA报道基因结构的表达没有作用，但是当用编码Smad4的表达结构共转染该细胞系时，发现了TGFβ的诱导作用。我们使用HepG2核抽提物的电泳迁移率变动分析(EMSA)，证明了TGFβ和对于不同的Smad蛋白的抗体存在下，CAGA序列的结合性能，表明Smad3和4存在于TGFβ-依赖性CAGA盒结合复合体中，并在表达Smad蛋白的大肠杆菌的存在下，使用EMSA，我们证明Smad3和Smad4具有直接的和特异性DNA-结合活性。此外，我们证明了密切相关的Smad2蛋白不能激活CAGA-介导的转录。我们证明了Smad2基因中外显子3编码的结构域阻止Smad2结合CAGA序列，而不存在相应于外显子3的结构域的Smad2形式不能结合并激活自CAGA盒的转录。
在TGFβ调节的启动子的其它TGFβ诱导区，例如α2(Ⅰ)前胶原基因，种系Ⅰgα恒定区基因和TGFβ-1启动子中鉴定了类似于我们的CAGA盒的序列。这些序列在表1中列出。
用于筛选以单独或复合体形式调节转录能力或一种或几种Smad蛋白的结合的潜在的有用的药剂的筛选方法。该复合物位于含有CAGA盒的序列或功能等同序列之上，最终改进Smad-TGFβ诱导调控的基团的表达。
在直接类型的方法中，分析了一种蛋白质(即Smad或者其CAGA结合片段)和一种试验寡核苷酸或者包含CAGA的核苷酸序列之间的结合复合体的生成。为此可以使用本领域公知的各种各样的技术，使用具有与CAGA相关的识别序列形成复合体的Smad蛋白作为蛋白质元件，例如哺乳动物Smad3和/或Smad4或在外显子3中剪接的Smad2蛋白或者其CAGA盒结合片段单独地或者作为重组多肽的一部分，其可以从本领域公知的细胞或者从表达系统中纯化，包括使用细菌例如大肠杆菌的原核表达系统或者真核表达系统例如酵母或杆状病毒，或者在体外表达系统中，例如以网织红细胞裂解物为基础的那些。这样的技术描述于例如Sambrook等，分子克隆实验室手册1989中。特异结合复合体的DNA部分可以包括包含CAGA盒的识别序列的试验寡核苷酸的寡核苷酸，这些寡核苷酸可以或者化学合成或者是基因组或cDNA片段，或者是例如以质粒或噬菌体为基础的那些重组载体的一部分。
筛选根据本发明的DNA和蛋白质之间的相互作用的方法是本领域公知的。这样，可以混合已知量的蛋白质和DNA，并且复合体生成后，可以测定没有复合的DNA或蛋白质的量。一旦分离了复合体，可以通过各种各样的技术测定没有复合的蛋白质，包括例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的抗体检测和标准蛋白质测定技术，例如劳里测定，双缩脲测定或Bradford测定。也可以通过本领域公知的各种各样的技术测定没有复合的DNA，例如通过用检测标记探针例如生物素或放射性标记杂交，其中探针可以是固定的或者是存在于溶液中的。多肽和DNA之间的复合体自身也可以使用本身已知的技术测定，包括足迹法，EMSA，闪烁亲近测定法(SPA)，biacore或生物芯片/DNA芯片技术。
或者，可以根据其对转录的作用测定多肽-DNA复合体生成的程度或者多肽-DNA复合体的转录能力。在已知为转录筛选的方法中，本发明可以用来筛选激活或抑制自细胞膜至细胞核的TGFβ或活化素转导途径的试剂，其最后导致CAGA盒介导的转录调控。在这样的一种方法中，包含CAGA盒的寡核苷酸序列可以在一种载体例如报道基因载体中例如与一种启动子和/或控制表达可检测蛋白的核苷酸序列的增强子操作连接的质粒中克隆，所述可检测蛋白质是例如荧光素酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰基转移酶，β-半乳糖苷酶，其中，在这样一种结构中，这样一种报道基因的表达水平可以在报道基因结构瞬时或稳定转染到真核细胞中后检测。在这样一种转录筛选中，包含CAGA盒的寡核苷酸序列整合到一种基因的调控区内，其产物可以在体外系统中检测到，并比较在试验试剂存在下(和在存在或不存在TGFβ或活化素下)培养的转染细胞中表达的产物的水平与试验试剂不存在下(和在存在或不存在TGFβ或活化素下)培养的转染细胞中表达的产物的水平。
优选地，在该方法的这方面使用的报道基因载体中，将提供合适的表达控制序列，例如除了启动子/增强子区例如多腺苷酸化信号等等之外的翻译，例如终止密码子，起始密码子和控制因子。
在一个优选的方面，本发明方法可以用来筛选在疾病治疗中有潜在应用的试剂，已知TGFβ控制的基因的未调控表达涉及例如纤维变性，异常伤口愈合，癌症，造血或免疫性或炎症疾病。特别是，通过干涉TGFβ或活化素介导的Smad与DNA的结合或者通过干涉结合于DNA的Smad的转录能力，该试剂将调节1型纤溶酶原激活物抑制剂的合成，从而影响纤溶酶的水平，从而调控基质生成和/或血纤蛋白溶解作用。
从另外一方面看，本发明提供用于筛选适合治疗与Smad介导的TGFβ或活化素激活相关的疾病的试剂的试剂盒，所述试剂盒包括-一种如上定义的Smad蛋白-TGFβ或活化素-如上定义的包括序列5'WXYCAGACZ3'的双链DNA分子，所述序列任选地与启动子序列和其产物是可检测的基因的编码区操作连接。
为TGFβ或活化素转录调控所必需的，借助于Smad而完成的本发明的CAGA相关序列的识别提供了治疗疾病的新的遗传学方法，所述疾病是纤维变性，异常伤口愈合，造血或免疫性或炎症疾病和癌症，其与某些基因的TGFβ调控相关。
从另一方面来看，本发明包括与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的治疗方法，所述方法包括施用包括如上定义的5'WXYCAGACZ3'序列的双链寡核苷酸。
在这样一种方法中，通过外源施用的DNA螯合Smad蛋白，从而防止TGFβ介导的内源基团诱导。
从另一方面来看，本发明提供包括如上定义的5'WXYCAGACZ3'序列的分离的双链DNA分子。优选地，该序列是AG(C/A)CAGACA。本发明还提供包括如上定义的试验寡核苷酸的分离的DNA分子。
从又一方面来看，本发明提供上述筛选鉴定的所有试剂，和它们在治疗与Smad/TGFβ基因激活相关的疾病中的用途。
作为又一方面，本发明提供抑制或激活一种或多种Smad蛋白与TGFβ或活化素基因调控中涉及的启动子或增强子的转录活性或结合的任何试剂，所述启动子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或者其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
这样的试剂可以是任何类型的分子，包括小的有机分子，蛋白质或多肽，或核酸分子。鉴定为具有期望作用的试剂可以在纤维变性，异常伤口愈合，癌症，造血或免疫性或炎症疾病的合适的模型中进一步试验。
实施例在已知为转录筛选的方法中，本发明可以用来筛选激活或抑制最后导致CAGA盒介导的转录调控的自细胞膜至细胞核的TGFβ或活化素转导途径的试剂。
可以通过在包含报道基因，例如萤火虫荧光素酶的质粒中克隆带有CAGA盒的转录区来产生报道基因载体，使得该包含CAGA的转录区控制该报道基因的转录。特别是，PAl-1启动子可以克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游。
或者，可以合成人工结构，其中化学产生的含有CAGA序列的寡核苷酸克隆在一个启动子或增强子结构中，使得它们控制萤火虫荧光素酶基因的转录。
图1中描述了这样的结构，其中CAGA寡核苷酸克隆在TK或MLP启动子的上游。这种含有TGFβ诱导的CAGA序列的报道基因载体必定通过各种各样的和常规的方法转染到真核细胞中，优选转染到哺乳动物细胞系中，例如HepG2细胞系，所述方法是例如磷酸钙沉淀法，DEAE-葡聚糖法，脂质体介导的方法或者电穿孔方法。
优选地，转染产生稳定表达包含CAGA盒的报道转基因的克隆细胞系。这一目的可以通过编码对药物，例如新霉素或潮霉素的抗性基因的抗性质粒的共转染，筛选通过抗提到的药物的抗性质粒的稳定整合获得的转染细胞而实现。
优选地，稳定的细胞系稳定整合了另一种转基因，例如renilla荧光素酶，其表达产物具有可检测活性。该转基因的表达应该不受TGFβ或活化素调控，即在其调控区中不包含CAGA序列。例如renilla荧光素酶基因可以从RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子或SV(猿猴病毒40)启动子转录。当筛选改变萤火虫荧光素酶转基因的表达的药剂时，即具有通过CAGA序列所起的作用，renilla荧光素酶转基因的表达用作特异性对照。这意味着通过CAGA盒-介导的转录的特异性作用试剂会对萤火虫荧光素酶活性具有影响，而对于renilla荧光素酶活性则没有。特别是，当筛选CAGA盒-介导的转录的抑制剂时，renilla荧光素酶活性在特异性抑制CAGA盒-介导的转录的试剂和有毒性的那些之间有区别。
测试混合物包括在合适的细胞培养基中培养的转染细胞和一种或几种候选药剂。在筛选抑制剂情况下，为了激活CAGA序列-介导的转录，细胞培养基中含有TGFβ或活化素(优选0.1ng/ml至50ng/ml的浓度)。在筛选激活剂的情况下TGFβ或活化素的存在是可有可无的。存在一种或几种候选药剂的混合物和没有所述候选试剂的混合物之间萤火虫荧光素酶活性的差异表明，这种或这些试剂能调节通过Smad蛋白结合该CAGA序列而介导的转录活性。
候选试剂包括多种化合物类型，但是典型地是有机化合物，优选是分子量常常在50和2500之间，更优选小于大约1000的小的有机化合物。候选试剂还包括肽类，糖类，脂肪酸类，甾类，嘌呤，嘧啶，它们的衍生物，结构类似物或组合物在内的生物分子。候选试剂从多种多样的来源获得，包括随机和定向合成，组合化学和合成的或天然的化合物的文库。
这里所描述的方法特别适合高产率筛选。为了使该方法自动化，在96孔或384孔微量培养板中接种转染细胞并培养。对由计算机控制的包括一个轴向可转动臂的电动机械自动装置进行编程，以便执行该项试验的不同步骤细胞接种，用存在或不存在TGFβ或活化素培养基培养，用试验药物培养，细胞冲洗和荧光素酶活性揭示。使用商售试剂盒，用常规方法揭示荧光素酶活性，优选使用与电动机械自动装置连接并且能对微量培养板读数的双注射器发光计。
本发明现在将参照下面非限制性实施例描述，其中图1CAGA盒是TGFβ-可诱导的DNA因子。
图1A在人PAl-1启动子中，描述了用粗线框表示相应于人TGFβ的两个区。给出了在该启动子中发现的三个CAGA盒的序列。
图1B用包含HSV1-胸苷激酶启动子(TK)上游克隆的CAGA序列的9个拷贝的不同载体转染HepG2细胞。AGCCAGACA是在PAl-1启动子中-730位置发现的序列，AGACAGACA是在PAl-1启动子的另外两个CAGA盒的序列(位置-580和-280)。最后的构建物包含突变的CAGA盒，如所指出的有三个核苷酸不同。证明了荧光素酶活性并指出了TGFβ诱导的倍数。
图1C用p3TP-Lux或者包含最小腺病毒主要晚期启动子(MLP)上游CAGA盒的9个或12个拷贝的载体转染HepG2和Mv1Lu细胞。对于HepG2细胞给出了TGFβ诱导的倍数。对于Mv1Lu转染细胞给出了基础的和TGFβ诱导的荧光素酶水平。
图2人PAl-1启动子的CAGA盒对于TGFβ诱导作用是必需的。通过定点诱变引入PAl-1启动子中CAGA盒的突变。用突变的AG(C/A)TACATA序列取代野生型AG(C/A)CAGACA位点。画叉的矩形代表突变的盒。给出了转染的HepG2细胞在不存在TGFβ的条件下的基础水平和存在TGFβ的诱导倍数。
图3对应于TGFβ和活化素信号但是不对应于BMPs途径的CAGA盒。
图3A用(CAGA)12-MLP-Luc报道基因结构和编码TGFβ，活化素或BMPs信号特异性丝氨酸/苏氨酸激酶受体的组成型激活形式的表达载体共转染的MvlLu细胞。Alk-2是ActR-1受体，Alk-3是BMPR-1A受体，Alk-4是ActR-1B受体，Alk-2是TGFβR-1受体和Alk-6是BMPR-1B受体。
图3B用(CAGA)12-MLP-Luc报道基因结构转染HepG2细胞，并且用BMP-7，活化素或TGFβ(分别为100ng/ml，20ng/ml和10ng/ml)诱导。
图4CAGA盒介导的TGFβ诱导的转录中所涉及的Smad蛋白质。
图4A用(CAGA)9-MLP-Luc报道基因结构和递增量的(0，10，15，20，30和40ng)编码Smad7抑制剂蛋白质的表达载体共转染的HepG2细胞。
图4B用(CAGA)9-MLP-Luc报道基因结构编码Smad4蛋白质的表达载体转染的MDA-MB468细胞并且和递增量的(0，250，500，750ng)。如图所示，用250ng Smad7表达载体和500ng Smad4表达载体共转染。
图5Smad3和Smad4直接结合TGFβ诱导的CAGA盒。
图5A使用包含CAGA序列的33p-标记的探针进行EMSA，并且使用被TGFβ诱导30分钟或者没有诱导的HepG2细胞的细胞核抽提物。指明了相应于特异性TGFβ诱导的复合体的带。加入50或100摩尔过量的各种冷寡核苷酸作为竞争剂，包括野生型和突变的CAGA序列。
图5B特异性抗-Smad抗血清在与CAGA探针混合之前与TGFβ诱导的HepG2细胞核抽提物培养。指明了超级移动的复合体。在第7和9泳道中加入用来产生反应性抗血清的抗原肽来证明抗-Smad3和抗-Smad4抗血清的特异性。
图5C表达GST-Smad1，2，3和4蛋白质并且缺失保守的羧基末端MH2区的大肠杆菌与33P-标记的CAGA探针培养。当指示时加入50摩尔过量的冷寡核苷酸竞争剂。向泳道2中的探针加入TGFβ处理过的HepG2细胞的细胞核抽提物以便对细胞核DNA结合的复合体定位。
图5D图示了类似的试验，其中使用了在细菌中产生的与GST区融合的全长Smad蛋白质。
图6Smad3超表达能模拟TGFβ激活报道基因载体，而Smad2超表达不能。用(CAGA)9-MLP-Luc报道基因载体瞬时转染HepG2细胞。如图所示，用Smad表达载体共转染的细胞被断绝血清并且不用TGFβ处理。
图7对决定转录失活的Smad2结构域作图。
图7A人Smad2和Smad3蛋白质序列。黑框表示两种蛋白质的序列之间的不同。MH1和MH2分别用直线和虚线在下面划出。也指明了GAG和TID结构域。
图7BSmad2和Smad3结构域交换嵌合体图示。
图7CHepG2细胞中Smad2和Smad3突变体对(CAGA)9-MLP-Luc报道基因载体的诱导。用(CAGA)9-MLP报道基因载体和等浓度标明的空变结构转染细胞，并测定没有TGFβ存在下荧光素酶活性。
图7D表达Smad2或Smad3突变体的HepG2细胞抽提物的蛋白质印迹分析。转染后，用Dual-荧光素酶分析试剂盒(Promega)提供的溶胞缓冲液溶解细胞，蛋白质在8.5％SDS-PAGE上分离后用抗Smad2/Smad3多克隆抗体(sc-6032，Santa Cruz)印迹。也用抗-β-肌动蛋白多克隆抗体(sc-1615，Santa Cruz)对溶胞产物免疫印迹，以测定相等的蛋白质负载量。通过化学发光法用与马过氧化物酶偶联的二次抗体指明初次抗体。
图8抑制Smad2结合CAGA序列的TID结构域。
图8A体外翻译的Smad2和Smad3突变体的SDS-PAGE分析(上一组)和使用这些体外翻译的蛋白质对CAGA寡核苷酸的凝胶移位试验(下一组)。
图8B使用Smad突变体对突变的CAGA探针的凝胶移位试验。
实验方法质粒结构使用pGL3基础质粒(Promega)产生CAGA报道基因载体。对TK或MLP启动子进行PCR扩增并且插入到Bgl和HindⅢ位点之间。将包含CAGA盒的寡核苷酸克隆到XhoⅠ位点。克隆的寡核苷酸的序列是包含CAGA盒的寡核苷酸
5＇TCGAGAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAC 3＇3＇CTCGGTCTGTTTTTCGGTCTGTAAATCGGTCTGTGAGCT 5＇5＇TCGAGAGACAGACAAAAAGACAGACATTTAGACAGACAC 3＇3＇CTCTGTCTGTTTTTCTGTCTGTAAATCTGTCTGTGAGCT 5＇CAGA突变体寡核苷酸5＇TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3＇3＇CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5＇通过将人PAl-1启动子的PCR扩增的806+72片段插入到pGL3-基础载体(Promega)的SacⅠ/BgⅢ位点产生PAl-1-Luc载体。使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene)根据说明书进行人PAl-1启动子的定点诱变。为了产生包含或不包含GAG和TID结构域的Smad2和Smad3突变体，通过编码Smad2和Smad3的表达载体中的定点诱变(QuickChange定点诱变试剂盒，Stratagene)插入AgeⅠ限制位点。类似地将BsmBⅠ限制位点插入Smad3表达载体中。限制位点的插入不改变该蛋白质的氨基酸序列。对所有的结构测序。
细胞培养物从美国典型培养物保藏中心购得人肝癌细胞系HepG2(HB8065)，人乳腺癌细胞系MDA-MB468(HTB132)和Mv1Lu水貂肺上皮细胞系(CCL64)。HepG2和Mv1Lu细胞分别在补充有10％胎牛血清，10mM丙酮酸钠，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的BME或MEM培养基(Life Technologies，Inc.)(完全培养基)中，在5％CO2-95％空气中生长。MDA-MB468细胞在补充有10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12(1∶1)培养基(Life Technologies，Inc.)(完全培养基)中，在7.5％CO2-92.5％空气中生长。
转染和荧光素酶测定使用磷酸钙共沉淀方法用指明的结构和内控制pRL-TK载体瞬时转染HepG2和MDA-MB468细胞。当转染增加量的表达载体时，通过加入pCMV5保持总DNA不变。在用7ng/ml人重组TGFβ1(R&D)刺激之前对细胞断绝血清8小时并且14小时后使用Dual荧光素酶试验(Promega)定量测定荧光素酶活性。对于活化素和BMP-7(CreativeBiomolecules)诱导，分别使用20ng/ml和100ng/ml。用从pRL-TK表达的renilla荧光素酶活性校正所得值。使用DEAE-葡聚糖方法转染Mv1Lu细胞。图中给出的荧光素酶的值代表进行至少三次转染实验的结果。
细胞核抽提物从对照和TGFβ-处理的HepG2细胞制备细胞核抽提物。处理后30分钟收集细胞并且根据Sadowski和Gilman方法加工(Sadowski和Gilman，1993)。简单地讲，用磷酸缓冲盐水冲洗来自8个10mm皿的融合细胞并刮取。又一次冲洗后，细胞悬浮于2ml冷的缓冲液A(20mM HEPES pH7.9，20mM NaF，1mM Na3VO4，1mM Na4P2O7，0.13μM冈田酸acid，1mM EDTA，1mM EGTA，0.4mM钼酸铵，1mM DTT，0.5mM PMSF和各为1μg/ml的亮抑酶肽，抑蛋白酶肽和抑胃酶肽)中。使细胞在冰上膨胀15分钟后通过30次冲程的Dounce全玻璃匀浆器溶解。离心细胞核成丸状并且再次悬浮于600μl冷的缓冲液C(缓冲液A，420mM氯化钠和20％甘油)中。通过15次冲程的Dounce全玻璃匀浆器溶解细胞核膜。得到的悬浮液在4℃下搅拌30分钟。将上清液分成等份并在-80℃下冷冻。
电泳迁移率变动分析使用DNA聚合酶的Klenow片段，用[α-33P]dCTP和[α-33P]dATP末端标记寡核苷酸。包括10μg细胞核抽提物或400ngGST-Smad蛋白或16μl体外翻译的Smad蛋白和2ng标记的寡核苷酸的结合反应在37℃下在18μl结合缓冲液(20mM HEPES pH7.9，30mM氯化钾，4mM氯化镁，0.1mM EDTA，0.8mM NaPi，20％甘油，4mM亚精胺，3μg聚dl-dC)中进行20分钟。在含有0.5xTBE的5％聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质-DNA复合体。用作探针的双链寡核苷酸的序列是
5＇TCGAGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAAGGAGCCAGACACCTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTGAGCTC 5＇竞争剂CAGA突变体寡核苷酸的序列是5＇TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3＇3 CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5＇包含其它转录结合位点的竞争剂寡核苷酸是Fast-1位点5 ＇TCGAGGCTGCCCTAAAATGTGTATTCCATGGAAATGTCTGCCCTTCTCTC 3 ＇3 ＇CCGACGGGATTTTACACATAAGGTACCTTTACAGACGGGAAGAGAGAGCT 5 ＇AP-1位点5＇CCGGGATGACTCAGC 3 ＇3 ＇ CTACTGAGTCGGGCC 5＇NF-1位点5＇CCGGTTTGGATTGAAGCCAATATG3＇3＇AAACCTAACTTCGGTTATACGGCC5＇Sp1位点5＇TCGAGGACAGGGGGCGGAGCCTC 3＇3＇CCTGTCCCCCGCCTCGGAGAGCT 5＇在使用体外翻译的蛋白质实现的凝胶移动实验中，使用TNT T7Quick偶联转录/翻译系统(Promega)根据厂商说明制备Smad蛋白。在EMSA使用之前对用[35S]甲硫氨酸标记的体外合成的蛋白质进行SDS-PAGE和放射自显影。
Smad融合蛋白的产生和纯化在大肠杆菌中表达全长Smad蛋白和与GST融合的MH2-缺失的突变体，并且使用Pharmacia's方法通过柱色谱部分纯化。简单地讲，细菌在2xYTA培养基中生长，并且用0.1mM IPTG诱导。超声处理后，使用谷胱甘肽琼脂糖4B分离GST-融合体，冲洗三次，洗脱，然后对补充有2mM DTT和0.5mM PMSF的PBS透析。
实验结果CAGA盒是TGFβ可诱导的DNA元件我们提出了共同序列基序可能存在于对人PAl-1启动子已经鉴定的TGFβ-应答区的可能性。为了证明这个问题，我们找到一个短的DNA同源性因子并且注意到在已经证明介导TGFβ-转录诱导的区中的人PAl-1启动子中位点-730，-580和-280处的三个拷贝中存在序列AG(C/A)CAGACA(图1A)。我们将该序列称为CAGA盒并且在转录报道基因系统中克隆以确定其涉及TGFβ-诱导的转录。当在胸苷激酶(TK)启动子上游多个拷贝中克隆时，该DNA序列赋与HepG2细胞中TGFβ-诱导的转录性能(图1B)，而不影响该载体的基础活性。在MvlLu细胞(图1C)或者在NIH3T3细胞(数据没有给出)中观察到相同的结果。当在由TATA盒和腺病毒主要晚期启动子(MLP)起始密码子序列组成的最小启动子上游克隆多个CAGA盒时，HepG2细胞中获得数百个TGFβ-介导的折叠诱导(图1C)。使用广泛使用的TGFβ-诱导的p3TP-Lux质粒，则该诱导较低。值得注意的是p3TP-Lux包含带有-730CAGA盒的PAl-1启动子的-740/-636区。作为特异性对照，含有相对于源序列的三个突变点的突变序列AGCTACATA，不能赋与TGFβ对TK启动子的诱导性能(图1C)。
人PAl-1启动子中CAGA盒的突变取消了TGFβ反应性野生型人PAl-1启动子包含三个CAGA盒。为了解释在该启动子的TGFβ介导的诱导中这些盒的生物意义，我们通过引入非TGFβ诱导的突变体序列而诱变了三个天然序列的每一个(图2)。与野生型启动子相比，三个位点之一的突变导致TGFβ诱导45％的降低(图2，参见Δb1，Δb2和Δb3突变体)。两个位点的突变，降低得更多一些(图2，参见Db1+Db2，Δb1+Δb3和Δb2+Δb3突变体)，当所有三个位点都突变了时，PAl-1启动子几乎不能对TGFβ作出反应(图2，参见Δb1+Δb2+Δb3突变体)。这些CAGA盒显示不明显控制该启动子的基础活性，因为在没有TGFβ存在下，突变体启动子的转录和野生型PAl-1启动子的转录的速度是相当的。
CAGA盒响应TGFB和活化素。而不响应BMP特异性丝氨酸/苏氨酸激酶Ⅰ型受体转导TGFβ家族成员的细胞内信号BMPR-ⅠA(ALK-3)，BMPR-ⅠB(ALK-6)和ActR-Ⅰ(ALK-2)是Ⅰ型BMP受体，而TGFβ和活化素分别通过TβR-Ⅰ(ALK-5)和ActR-ⅠB(ALK-4)发出信号。为了试验CAGA盒相对于TGFβ超家庭成员的特异性，我们用编码Ⅰ型受体的组成型激活形式的表达载体转染对TGFβ，活化素和BMP-7有反应的MvlLu细胞。如图3A所示，ALK-4/T206D和ALK-5/T204D的表达导致CAGA盒报道基因载体的转录激活。相反，ALK-2/Q207D，ALK-3/Q233D和ALK-6/Q204D的表达没有表现出任何作用，证明在MvlLu细胞中，TGFβ和活化素激活CAGA序列，但是BMP-诱导的信号不能激活。在用Ⅰ型受体的组成型激活形式转染的HepG2细胞中获得类似的结果(没有给出数据)。为了试验更多的生理条件，我们用CAGA盒报道基因载体转染了对活化素和BMP-7有反应的HepG2细胞，并且用活化素和BMP-7培养细胞(OP-1)。如图3B所示，包含CAGA盒的报道基因在活化素和TGFβ存在下分别被诱导25和200倍，而BMP-7没有表现出任何明显作用(2倍诱导)。因此，CAGA盒特异性响应活化素和TGFβ但是不响应BMP信号。
Smad蛋白参与CAGA盒介导的TGFB-诱导的转录为了检查Smad蛋白是否涉及用CAGA盒发现的TGFβ诱导的转录激活，我们用CAGA报道基因结构和已知编码抑制TGFβ/Smad-介导的转录作用的Smad7蛋白的表达载体共转染HepG2细胞。如图4A所示，Smad7的超表达导致CAGA盒报道基因结构TGFβ诱导的转录的50％抑制。来自乳腺癌的MDA-MB468细胞是内源Smad4表达缺陷的人上皮细胞。在这些细胞中，TGFβ对CAGA盒报道基因结构没有作用(图4B)。但是，编码Smad4的表达载体的共转染恢复包含CAGA盒的载体的TGFβ转录诱导，证明Smad4对于该序列介导的TGFβ转录作用是必需的。
Smad3和Smad4存在于结合CAGA盒的转录因子核复合体中在下一个步骤中，我们使用HepG2细胞核抽提物进行电泳迁移率变动分析(EMSA)，试图鉴定对TGFβ-反应CAGA序列的DNA-结合活性。我们只有用来自TGFβ诱导的细胞的细胞核抽提物才可以鉴定结合复合体的存在(图5A，比较泳道2和3)。最大结合需要30分钟的TGFβ诱导时间，而在10分钟诱导之后可以清楚地观察到该复合体(没有给出数据)。这提示从头蛋白质合成不是必须的，而且已经存在的因子被快速地和翻译后修饰或者易位到细胞核中。该DNA-结合复合体是特异性的，因为是过量的冷CAGA寡核苷酸而不是突变的盒代替了相应的泳带(图5A，泳道4和5)。此外，该复合体不包含曾被建议为是TGFβ/活化素信号潜在中介体的转录因子，例如Sp1，AP-1，NF-1或FAST-1，因为其没有被相应的这些转录因子所结合的DNA序列置换(图5A，泳道6-10)。为了检查Smad蛋白是否存在于CAGA结合复合体中，将细胞核抽提物与特异性抗Smad1至Smad5抗血清培养。我们可以测定与抗-Smad3和抗-Smad4抗血清的TGFβ依赖性结合复合体的超移动(图5B，泳道6和8)。通过加入用来产生抗血清的免疫原性肽来竞争这些超移动，证明抗体识别的特异性(图5B，泳道7和9)。因为加入抗-Smad1，抗-Smad2和抗-Smad5抗血清没有作用(图5B，泳道4，5和10)，我们得出结论，CAGA盒DNA-结合核复合体包含TGFβ/活化素信号Smad3和Smad4蛋白质，但是不包含Smad蛋白也不包含BMP信号Smad1和Smad5蛋白质。这与证明CAGA报道基因结构由激活Smad3的TGFβ和活化素受体激活，而不由其信号通过Smad1和Smad5传导的BMP受体激活的转染实验相吻合(参见图3A和3B)。
Smad3和Smad4直接结合TGFB-诱导的CAGA盒我们前面描述凝胶移动实验证明细胞核CAGA序列-结合复合体中存在Smad3和Smad4，但是不能确定Smad3和Smad4与DNA的结合是否是直接的。为了证实这一点，我们在EMSA中使用了大肠杆菌表达的GST-Smad融合蛋白。如图5C所示，Smad3和Smad4缺失MH2区，直接并且特异性地结合包含CAGA盒的探针。在用超移动实验的系列里，Smad1ΔMH2和Smad2ΔMH2蛋白不结合DNA。此外，与果蝇Mad蛋白的实施例相反，细菌中产生的全长Smad4蛋白质对CAGA序列确实具有直接并且特异性的DNA-结合活性，而全长GST-Smad1，GST-Smad2和GST-Smad3不能结合DNA。
Smad2不激活CAGA-介导的转录如图6所示，TGFβ对CAGA报道基因的激活可以通过将Smad3表达载体的转染到HepG2细胞中模拟。但是，和Smad3具有92％相同性的Smad2蛋白的转染对CAGA-介导的转录没有作用，表明Smad2和Smad3不是功能等价的。Smad3的MH1结构域对于DNA特异性结合CAGA序列是足够的(参见图5C)。Smad2和Smad3 MH1区之间的比较表明，主要差别是Smad2中存在的两个氨基酸片段在Smad3中则没有(图7A)。我们将在Ser21和Gly30之间包含10个残基(主要是甘氨酸和丝氨酸)的短N-末端氨基酸序列称为GAG。从氨基酸Ser79至Thr108的30个残基长并且富含丝氨酸和苏氨酸的较大的序列称之为TID。为了确定这些序列是否涉及Smad2转录活性的缺失，我们制备了缺失两种序列的Smad2蛋白(图7B)。转染到HepG2细胞中的该突变体将CAGA报道基因激活到和野生型Smad3相当的水平(图7C)。Smad2ΔGAGΔTID突变体显示GAG或TID结构域涉及Smad2和Smad3之间观察到的功能差异。在下面步骤中，我们试图测定该转录差别是否归因于单一结构域。为了解决这个问题，我们缺失了Smad2中的GAG(Smad2ΔGAG)或TID(Smad2ΔTID)序列，并且测定了突变体对CAGA报道基因载体的作用。如图7C所示，Smad2ΔTID突变体明显地能激活CAGA报道基因，表明TID结构域与Smad2转录能力缺乏相关。我们未发现Smad2ΔGAG对CAGA报导基因有任何激活作用。不过，我们不能从该实验得出这样的结论，即GAG结构域与转录激活的缺乏无关，因为我们不能通过蛋白质印迹测定该突变体的表达(图7D，没有给出数据)。
为了补充用Smad2缺失突变体获得的结果，我们在Smad3中引入了GAG结构域或TID结构域。与先前数据一致，包含TID序列的Smad3突变体(即Smad3+GAG+TID和Smad3+TID)不能激活CAGA报道基因，再次表明涉及该序列。值得注意的是，这些转录失活突变体在所述细胞中表达，因为它们在蛋白质印迹测定中测定到(图7D)。将单一GAG结构域引入Smad3不改变其转录能力(参见Smad3+GAG，图7C)。这些结果清楚地表明Smad2和Smad3之间所观察到的转录差异归因于单一TID结构域而不是GAG序列。
相应于外显子3的TID区抑制Smad2结合CAGA序列
Smad3和Smad2之间的激活转录的能力的差异可以通过不同的DNA-结合能力来解释。事实上，因为TID结构域是Smad2和Smad3之间的转录差异的原因，有可能是该结构域抑制Smad2结合DNA。为了证实这种假设，我们使用体外转录/翻译系统制备了Smad突变体蛋白并且在凝胶移动测试中测定了它们的DNA-结合能力。如图8A所示，与Smad2不同，全长野生型Smad3结合CAGA寡核苷酸。值得注意的是，在该实验中，Smad3不与GST结构域融合，表明GST结构域在一定程度上改变了Smad3的DNA-结合能力(参见图5D)。该结合是特异性的，因为Smad3不能结合包含3个核苷酸突变形式的CAGA序列的寡核苷酸探针(图8B)。与转染实验相吻合，缺失两个序列的Smad2(Smad2ΔGAGΔTID)和Smad2ΔTID能结合CAGA探针而Smad2ΔGAG不能。在与先前所观察的转录活性总的相关性中，Smad3+GAG结合CAGA寡核苷酸，而且在Smad3中引入TID结构域(即Smad3+TID和Smad3+GAG+TID)阻止Smad3结合DNA。因此，该TID序列通过阻止其对CAGA盒的DNA-结合而防止Smad2激活转录。
明显地，Smad2中存在的TID序列确实相应于外显子3(Takenoshita等，Genomics,1998,48,1-11)。此外，在人胎盘中检测到在外显子3中剪接的Smad2形式(Takenoshita等，Genomics，1998，48，1-11)。可能地，该剪接可以调控和对于某些细胞类型和条件是特异性的。因为与全长Smad2不同，该较短形式不包含TID结构域，其类似于Smad3激活转录，并且用Smad3在其结合和激活自CAGA序列的转录能力上丰余至少一定程度。
CAGA-介导的转录筛选的具体实施例CAGA-报道基因细胞克隆产生包含稳定整合TGFβ-反应性CAGA盒的报道基因的两个细胞系，以进行高效率转录筛选。通过在HepG2细胞中稳定共转染(CAGA)9MLP-Luc载体(最小MLP启动子上游克隆的9个CAGA盒的控制下的萤火虫荧光素酶；如图1所示)和pRc/Renilla载体而获得第一个克隆细胞系，克隆F89。pRc/Renilla载体含有SV40启动子控制下的新霉素/遗传霉素基因抗性，而renilla荧光素酶基因由RSV LTR启动。通过将包含荧光素酶renilla基因的pRL-SV40(Promega)的HindⅢ/Xbal片段克隆到pRc-RSV载体的HindⅢ/Xbal位点中而获得pRc/Renilla载体(Invitrogen)。通过在HepG2细胞中稳定共转染野生型人PAl-1-Luc报道基因载体(人PAl-1启动子控制下的萤火虫荧光素酶；如图2所示)和pRc/Renilla质粒而获得第二个克隆细胞系，克隆1613。在这两种情况下，使用磷酸钙共沉淀方法稳定转染HepG2细胞。为了分离遗传霉素抗性克隆，使转染的细胞在1mg/ml遗传霉素(Gibco)存在下生长。然后分离F89和1613克隆并且在0.5mg/ml遗传霉素存在下扩增，以获得足够量的细胞用于循环的高产出筛选。
由于控制萤火虫荧光素酶转基因表达的转录调控区(即启动子)中存在CAGA盒，两种克隆在TGFβ存在下以剂量依赖方式存在高激活萤火虫荧光素酶活性。renilla荧光素酶的活性在TGFβ存在下几乎没有改变。因此，renilla荧光素酶活性可以用作内毒性对照。
表2表明在克隆F89和1613中在不存在或存在增加量的TGFβ下发现的相对萤火虫荧光素酶活性(诱导倍数)(数值1相应于没有TGFβ存在下获得的相对萤火虫荧光素酶活性)表2
表3表明在克隆F89和1613中在不存在或存在增加量的TGFβ下发现的相对renilla荧光素酶活性(诱导倍数)(数值1相应于没有TGFβ存在下获得的相对renilla荧光素酶活性)表3
自动控制的高产率转录筛选为了进行高产率筛选，在96孔微量培养板规格中自动进行细胞测试。整个过程由能进行平行操作并且控制周围设备(即轴转动臂，传送带，细胞清洗器，移液台站，细胞培养箱，发光计)并且优化该程序的时间进程的计算机系统(CLARA，Scitec)控制。用于该高产率筛选的一般程序如下第一天→第二天→ 第三天→接种细胞 去血清 荧光素酶定量 数据分析候选试剂培养加入TGFβ在第一天，使用多滴仪器，以每孔200μl含血清培养基中35000个细胞的浓度用CAGA-报道基因细胞(即F89或1613)接种40个(96孔)微量培养板。将这些培养板放置在自动线上的细胞培养箱中。对该培养箱设计一个门，使轴转动臂，可以进入操作细胞微量培养板。
18-24小时后(第2天)在100％DMSO中稀释的含有要测试的化合物的微量培养板被放置在传送带中，开始细胞培养程序。然后，由计算机系统协调各种周围的设备的动作，在存在TGFβ和要测试的化合物下培养细胞。
由轴转动臂将细胞和化合物微量培养板在自动控制线上移动到适当范围。冲洗细胞并且在无血清培养基中培养。由移液台的站实现不同操作，包括为了用TGFβ和要测试的化合物培养细胞而进行的初步稀释。该项试验中使用的TGFβ(购自R&D的rhTGFβ-1)的最终浓度是1ng/ml，在1％终浓度DMSO中的最终浓度是10μM下测定化合物。在加入TGFβ之前，用要测试的化合物培养细胞15-30分钟。试验反应的最终体积是150μl。A1孔至H10孔是试验孔并且含有要在TGFβ存在下用测试的化合物培养的细胞。每一个孔只含有单一一种化合物并且测定其对CAGA-介导的转录的影响。用第11和12栏作为对照。第11栏包括8个孔，其中在TGFβ存在下没有化合物培养细胞。第11栏测定将比较试验孔中测定的值以鉴定潜在的抑制剂或活化剂化合物的‘参照TGFβ-诱导的萤火虫荧光素酶值'。在孔A12至D12中，细胞在没有TGFβ的培养基中生长。用这些点获得的萤火虫荧光素酶值代表‘基础萤火虫荧光素酶活性’，并且经对照TGFβ诱导是正确的。在孔E12至H12中，在TGFβ存在下用细胞毒性化合物500μM CPO(环戊酮，Sigma)培养细胞。降低的萤火虫和renilla荧光素酶活性显示毒性(大约是第11栏中获得的活性的50％)。对照这些点，该试验对毒性化合物敏感。
12-18小时后(第3天)，开始定量测定荧光素酶程序。使用购自Promega的双荧光素酶测定试剂盒的试剂进行下面的反应。冲洗细胞并且加入10μl被动溶解缓冲液(Promega)溶解。搅拌15-30分钟后，在双注射器发光计(BMGlumistar)中读出培养板的荧光素酶活性。为了该目的，依次注入10μl荧光素酶测定试剂和50μl Stop&Glo缓冲液以定量测定两种荧光素酶的活性。然后用适当的软件处理和分析数据。
CAGA-介导的转录的抑制剂的描述在上述自动控制高产率转录筛选中测试了上千种化合物。发现α-氰基-4-羟基-3-乙氧基-5-苯基硫基甲基肉桂酰胺化合物(下文称之为化合物A)对两种克隆F89和1613的TGFβ-诱导的萤火虫荧光素酶活性具有抑制作用(IC50在5和10μM之间)，但是对renllia荧光素酶活性没有影响，并且给出了下面的结构式作为实例。 化合物A(α-氰基-4-羟基-3-乙氧基-5-苯基硫基甲基肉桂酰胺)表4证明增加浓度的化合物A在1ng/ml TGFβ存在下对克隆F89和1613的萤火虫荧光素酶活性的作用(数值100相应于没有化合物A存在下和1ng/ml TGFβ存在下所观察到的萤火虫荧光素酶活性)。
表4化合物A
权利要求
1．筛选用于治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的治疗剂的方法，所述方法包括检测或分析在所述试剂存在下，Smad蛋白或其DNA结合片段和包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的双链寡核苷酸之间的转录活性或结合的程度和结果，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
2．权利要求1的方法，其中双链寡核苷酸包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
3．权利要求1或2的方法，其中双链寡核苷酸包括序列5'AG(C/A)CAGACA3'或其功能等价物。
4．权利要求1或2的方法，其中双链寡核苷酸包括序列5'ATGCAGACA3'或5'GGCCAGACA3'，或其功能等价物。
5．权利要求1-3任一项的方法在治疗纤维变性疾病，异常伤口愈合，异常骨生成，癌症，造血，神经保护和免疫和炎症疾病中的用途。
6．筛选适合治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的药剂的试剂盒，所述试剂盒包括-一种如上定义的Smad蛋白-TGFβ或活化素-包括序列5'WXYCAGACZ3'或者其功能等价物的双链DNA分子，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C，所述序列任选地与启动子或增强子序列和其产物是可检测的基因的编码区操作连接。
7．治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的方法，所述方法对包括人的哺乳动物施用包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的双链寡核苷酸，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
8．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的双链寡核苷酸在治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病中的用途，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
9．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的双链寡核苷酸在制备用于治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的药物中的用途，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
10．治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的方法，所述方法包括对包括人的哺乳动物施用治疗量的一种药剂，其抑制或激活所述Smad蛋白与由TGFβ或活化素调控的基因调控中涉及的启动子或增强子的转录活性或结合，所述启动子或增强子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
11．治疗量的一种药剂在治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病中的用途，所述药剂抑制或激活一种或几种Smad蛋白与由TGFβ或活化素调控的基因调控中涉及的启动子或增强子的转录活性或结合，所述启动子或增强子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A和G且Z代表A或C。
12．抑制或激活一种或几种Smad蛋白与由TGFβ或活化素调控的基因调控中涉及的启动子或增强子的转录活性或结合的治疗量的一种药剂在制备用于治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的药物的用途，其中所述启动子或增强子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
13．治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的方法，包括对包括人的哺乳动物施用治疗量的权利要求1-4任一项的方法中定义的一种药剂。
14．治疗量的权利要求1-4任一项的方法中定义的一种药剂在治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病中的用途。
15．治疗量的权利要求1-4任一项的方法中定义的一种药剂在制备用于治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的药物中的用途。
16．包括序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物的分离的双链DNA分子，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A，G或T且Z代表A或C。
17．权利要求16的包括序列5'AG(C/A)CAGACA3'的分离的双链DNA分子。
18．权利要求16的包括序列5'ATGCAGACA3'的分离的双链DNA分子。
19．权利要求16的包括序列5'GGCCAGACA3'的分离的双链DNA分子。
20．抑制或激活由一种或几种Smad蛋白与由TGFβ或活化素调控的基因调控中涉及的启动子或增强子的转录活性或结合的一种治疗药剂，所述启动子或增强子包括核苷酸序列5'WXYCAGACZ3'或其功能等价物，其中在所述核苷酸序列中，W代表A或G，X代表G或T，Y代表C，A或G且Z代表A或C。
21.权利要求1-4任一项的方法中定义的治疗药剂。
全文摘要
本发明涉及一种筛选用于治疗与由一种或几种Smad蛋白和TGFβ或活化素调控的基因调控相关的疾病的治疗剂的方法,所述方法包括检测或分析在所述试剂存在下Smad蛋白或其DNA结合片段和包括序列5’WXYCAGACZ3’或其功能等价物的双链寡核苷酸之间的转录活性或结合的程度和结果,其中在所述核苷酸序列中,W代表A或G,X代表G或T,Y代表C,A,G或T且Z代表A或C。还要求了用这样一种方法鉴定的治疗药剂,以及它们在治疗与Smad－介导的TGFβ诱导的基因异常表达相关的疾病中的用途。
文档编号A61P7/00GK1296529SQ99804857
公开日2001年5月23日 申请日期1999年2月4日 优先权日1998年2月6日
发明者J·M·戈蒂尔, S·赫特, S·G·登勒 申请人:葛兰素集团有限公司