专利名称：诱导抗黑素瘤患者肺转移的抗－肿瘤应答的方法
相关申请的交叉参考根据35 U.S.C.§119，本申请要求了1998年4月9日提交的临时专利申请系列号No.60/081256的优先权，其全部公开内容引作参考。政府资金参考本文所描述的本发明是美国公共健康协会NIH资助号CA29348资助或授予的工作过程中完成的。美国政府对本发明享有一定权利。
Fujiwara等,J.Immunol.,1984,132,1571揭示结合半抗原三硝基苯(TNP)的小鼠肿瘤细胞将在鼠类系统中诱导抗未修饰肿瘤细胞的系统免疫性，前提是在没有半抗原特异性抑制T细胞存在下小鼠首先对半抗原致敏。得自处理过的小鼠的脾细胞完全地特异性地抑制未处理受体动物体内肿瘤的生长。Hood等,I Immunol.,1987,138,3573揭示用结合TNP的紫外光诱导的“退化性”肿瘤免疫的小鼠能排斥非免疫性的结合了TNP的“进行性”肿瘤。此外，这些小鼠接着抵抗未结合的“进行性”肿瘤的攻击。在另一个实验体系中，Fujiwara等,J.Immunol.,1984,133,510证明环磷酰胺预处理后对三硝基氯苯(TNCB)敏感的小鼠通过肿瘤细胞的原位半抗原化作用可能会治愈大的肿瘤(10mm)；接着，这些动物特异性抵抗未结合的肿瘤细胞的攻击。但是，这些结果不能证明从人自身性肿瘤分离到的半抗原化细胞在免疫治疗中是否是有效的和是否能诱导肿瘤退化。
最近证实了与未修饰的组织起交叉反应的T细胞的存在。Weltzien和同事的揭示从用TNP-修饰的同源淋巴细胞免疫的小鼠产生的Ⅰ类MHC-限制的T细胞克隆对MHC-相关的，TNP-修饰的“自身”肽产生应答。Ortmann,B.,等,J.Immunol.,1992,148,1445。另外，已经确定了用TNP-修饰的淋巴细胞免疫小鼠导致脾T细胞的发育，其显示体外对TNP-修饰的细胞第二增殖和细胞毒性响应。Shearer,G.M.Eur.J.Immunol.,1974,4,527。
这些实验共同特性是用其中没有诱导抑制细胞的介质中的半抗原致敏。来自环磷酰胺预处理的TNCB-致敏的小鼠的脾细胞表现出放射抗性“扩增的辅助细胞功能”，即它们特异性地扩大抗-TNP细胞毒性的体外产生。此外，一旦这些扩增的辅助细胞被体外暴露给TNP-结合的自身淋巴细胞激活，则它们能增加对不相关抗原(包括肿瘤抗原)的细胞毒性(Fujiwara等，1984)。Flood等(1987)，上文，证明这种增强的辅助细胞活性由具有Lyt-1+,Lyt-2-,L3T4+,I-J+表型的T细胞介导，并且推测这些细胞是抗抑制细胞，即一类新的免疫调节T细胞。
用黑素瘤对患者的免疫治疗表明，用第一抗原匙孔血蓝蛋白致敏之前三天，以高剂量(1000mg/M2)或低剂量(300mg/M2)给予环磷酰胺显著增强了对该抗原的迟发型超敏反应的获得(Berd等,Cancer Res.,1982,42,4862；Cancer Res.,1984,44,1275)。低剂量环磷酰胺预处理使转移性黑素瘤患者对由于注射自身性黑素瘤疫苗应答的自身性黑素瘤细胞产生迟发型超敏反应(Berd等，Cancer Res.,1986,46,2572；Cancer Invest.,1988,6,335)。给予环磷酰胺导致外周血淋巴细胞非特异性T抑制细胞功能的减弱(Berd等.,CancerRes.,1984,44,5439；Cancer Res.,1987,47,3317)，可能是由于减少了CD4+，CD45R+抑制性诱导T细胞(Berd等，Cancer Res.,1988,48,1671)。该免疫治疗方案的抗肿瘤效果显示受到开始给予疫苗和对肿瘤细胞产生迟发型过敏反应之间过长的间隔的限制(Berd等，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,1988,29,408(#1626))。因此，对于提高这样一种疫苗的治疗效果使其更具免疫原性存在要求。
现在，大多数肿瘤免疫学家赞同T淋巴细胞浸润肿瘤块是通过免疫系统破坏肿瘤细胞的先决条件。结果，注意力主要放在什么变成已知为“TIL”治疗，在这方面NCI的Dr.Stephen Rosen berg是先驱者。Dr.Rosen berg和其它人从人癌转移灶提取出了几种天然存在的T淋巴细胞，并且通过将其在体外与白细胞介素2(IL-2)(一种T淋巴细胞生长因子)一起培养而将其数量大大扩大。Topalian等，J.Clin.On Col.,1988,6,839。但是这种治疗还不是非常有效的，因为注射的T细胞的局限性在于它们有“回到”肿瘤位点的能力。
据信人黑色素瘤表达独特的为T淋巴细胞识别的表面抗原。Old,L.J.,Cancer Res.,1981,41,361；Van der Bruggen,P.,等，Science,1991,254,1643；Mu kherji,B.,等，J.Immunol.,1986,136,1888；和Anichini,A.,等，J.Immunol.,1989,142,3692。但是，本发明人所做工作之前的免疫治疗方案的局限性在于难以体内诱导对于该抗原的有效的T细胞-介导的应答。
二十世纪六十年代末和七十年代初，英国St.Barthlomew’s医院R.Powles研究小组对化疗减轻症状之后的急性骨髓性白血病(AML)患者进行了一系列疫苗治疗研究。他们使用了带有BCG的异源AML细胞作为佐剂。进行了几次试验，都使用小的试样规格(N=10-15)。与单独的化疗相比，使用化疗和免疫治疗的组合在某种程度上延长了存活时间，但是没有延长不复发情况的存活时间。没有发现严重的毒性；没有发现自身免疫性(例如对正常骨髓的毒性。回顾起来这些试验存在一些技术问题1)使用的是同种异体白血病细胞而不是自体白血病细胞；2)疫苗中白血病细胞的剂量是过量的(最多109个细胞/剂)；3)BCG剂量非常高并且BCG给药的时间和部位与白血病细胞疫苗分离；和4)在患者接受细胞毒性药物(保持或者巩固化疗)的同时给予疫苗。
治疗人癌症所使用的常规治疗一般来说是不成功的。在本发明人工作之前，给予疫苗组合物也不能可靠地诱导细胞介导的免疫性的产生。因此，本领域仍然需求治疗癌症特别是癌转移的新方法。现在，申请人发现了在转移黑素瘤患者体内诱导抗肿瘤应答的有效方法，特别是诱导肿瘤消退的有效方法。
因此，一方面，本发明涉及通过对哺乳动物优选对人施用包括有效量的至少一种下述物质的组合物而诱导抗黑素瘤转移的抗肿瘤应答的方法(ⅰ)基本上处于非生长期的半抗原修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞，(ⅱ)半抗原修饰的黑素瘤细胞膜，(ⅲ)从所述半抗原修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(ⅳ)能介导抗肿瘤应答的T细胞。
本发明还涉及诱导至少一种下面的抗肿瘤应答肿瘤坏死，肿瘤消退，肿瘤炎症，通过激活的T淋巴细胞的肿瘤浸润，稳定疾病和患者存活时间的延长。
另一方面，本发明涉及诱导抗肺转移的抗肿瘤应答的方法，优选完全或部分消退转移和/或延长存活时间。
另一方面，本发明涉及分离的哺乳动物(优选人)的用半抗原修饰的黑素瘤细胞或膜，从这样的细胞和膜分离的肽，和能介导抗肿瘤应答的T细胞，以及它们的组合物。
另一方面，本发明提供含有治疗有效量的哺乳动物优选人的用半抗原修饰的黑素瘤细胞或膜，从这样的细胞和膜分离的肽，T细胞，或者其适合对患有转移黑素瘤优选肺转移的哺乳动物施用的组合的疫苗组合物和剂型。
在本发明的另一方面，所述组合物含有一种佐剂，例如卡介菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCG),QS-21，去毒的内毒素和细胞因子，例如白细胞介素-2，白细胞介素-4,γ-干扰素，白细胞介素-12，白细胞介素-15和GM-CSF。
发明的详细描述本文引述的所有专利，专利申请和参考文献在这里引作参考。在不一致的情况下，以本公开内容为准。
本发明涉及通过给予有效量的含有至少一种下述物质的组合物而诱导抗黑素瘤(优选肺转移)的抗肿瘤应答的方法(ⅰ)基本上处于非生长期的半抗原-修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞，(ⅱ)半抗原-修饰的黑素瘤细胞膜，(ⅲ)从所述半抗原-修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(ⅳ)能介导例如转移消退的抗肿瘤应答的T细胞。
本发明的细胞、膜、肽和T细胞具有诱导至少一种下述抗肿瘤应答的性质肿瘤坏死，肿瘤消退，肿瘤炎症，通过激活的T淋巴细胞的浸润，迟发型超敏反应，和患者生存时间的延长。所述细胞、膜，肽和它们的组合物能引发具有浸润哺乳动物肿瘤性质的T淋巴细胞，引发对哺乳动物肿瘤的炎症免疫应答，引发对哺乳动物肿瘤的延迟型超敏反应和/或体外刺激T淋巴细胞。
本发明的黑素瘤细胞、膜、肽和T细胞和它们的组合物可以用来治疗哺乳动物优选人的黑素瘤，包括治疗转移性和原发性黑素瘤。转移性黑素瘤可以包括淋巴结，肺和皮下转移。用本发明的制剂、组合物和方法可以治疗Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌症，优选治疗Ⅲ期和Ⅳ期。根据本发明治疗的肺转移优选是小的肺转移。为了本发明的目的，“小的”肺转移直径小于大约2cm，优选直径小于大约1.5cm，最优选直径小于大约1cm。在本发明的一个优选的实施方案中，哺乳动物黑素瘤转移局限于所述哺乳动物的肺部。根据本发明要治疗的肺转移可以是单个或多个小结。在一个实施方案中，本发明用来治疗家畜，例如猫科、犬科、马科和牛科的成员。
应该明白本说明书关于分离的黑素瘤细胞的使用的任何公开内容同样适用于使用黑素瘤细胞、膜、肽、T细胞或者它们的组合。本发明的制剂和它们的组合物黑素瘤细胞、膜、肽和T细胞在本文中统称为本发明的制剂。此外，术语“提取物”可以用来统指破碎的黑素瘤细胞，分离的黑素瘤细胞膜和黑素瘤细胞肽。
本发明的分离的黑素瘤细胞，膜或肽从哺乳动物优选人的黑素瘤细胞制备。黑素瘤细胞的来源可以是肺、淋巴结或皮下肿瘤块，包括转移块。在本发明的一个实施方案中，这些材料从猫、犬、马或牛科动物的黑素瘤分离。本发明的T细胞从肿瘤块例如转移的肺和淋巴结块分离，并且可以体外扩增。
对于本发明目的，黑素瘤细胞意指包括全黑素瘤细胞和破坏的黑素瘤细胞两者。在本发明疫苗组合物中使用的黑素瘤细胞以及从中分离膜和肽的那些黑素瘤细胞可以是活细胞、减毒细胞或死细胞。施与患者后不生长和分裂的黑素瘤细胞(即它所基本上处于不生长状态)可以在本发明中使用。如果对患者施用，则这样的细胞是优选的。如这里所使用的，术语“不生长状态的细胞”指活细胞、减毒细胞或死细胞，GO期细胞，全细胞或破碎细胞(或者全细胞和破碎细胞两者)，即在体内不分裂的细胞。悬浮不生长状态细胞的常规方法是技术人员公知的并且可以在本发明中使用。例如，可以在使用前照射细胞使其不生长和分裂。可以以例如2500R照射黑素瘤细胞。可以从非生长状态的黑素瘤细胞或者能体内生长和分裂的黑素瘤细胞分离黑素瘤细胞膜和肽。优选地，在后一种情况下，黑素瘤细胞膜或肽制剂没有污染能体内分裂的黑素瘤细胞。
从可以是淋巴结、肺和皮下来源的黑素瘤细胞分离黑素瘤细胞、膜和肽。优选地，黑素瘤细胞源自要治疗的同一患者。黑素瘤细胞优选是同源的(例如自体性的)。定义为“同源性的”黑素瘤细胞不需要与受治疗患者的肿瘤细胞或非肿瘤，体细胞遗传上完全相同(即100％)。肿瘤细胞和患者之间MHC分子的遗传上的同一性一般就足够了。另外，黑素瘤细胞上的特定抗原和患者肿瘤细胞上存在的抗原之间可能存在遗传同一性。可以根据本领域公知的方法测定遗传同一性。对于本发明的目的，经遗传工程改变(例如使用重组DNA技术)而变得与例如患者的特殊的MHC分子和/或患者癌细胞上特定抗原遗传相同的黑素瘤细胞也包含在术语“同源性”黑素瘤细胞的含义内。而且，这样的细胞也可以称之为“MHC-相同”或“MHC-相容”。来自遗传不同的相同物种的哺乳动物的黑素瘤细胞，例如同种异体细胞也可以用于本发明黑素瘤细胞膜和肽的制备。黑素瘤细胞可以是，但不局限于自活组织检查样品或者组织培养解离的细胞。从同种异体细胞和干细胞分离的细胞膜也在本发明范围内。
黑素瘤细胞膜可以包括所有细胞膜，例如外膜、核膜、线粒体膜、液泡膜、内质网膜、高尔基复合体膜和溶酶体膜。在本发明的一个实施方案中，大于大约50％的膜是黑素瘤细胞质膜。优选地，大于大约60％的膜由黑素瘤细胞质膜组成，大于大约70％是更优选的，80％是更优选的，90％是更加优选的，95％是更加优选的，99％是最优选的。
优选地，分离后的膜基本上没有核和细胞。例如，如果在大约2×108细胞当量(c.e.)的膜材料中含有少于大约100个细胞和/或细胞核，则认为膜制剂基本上不含有细胞核或细胞。细胞当量是从指定数目的细胞分离的膜的量。分离的基本上没有细胞和/或细胞核的黑素瘤细胞膜可以含有淋巴细胞和/或淋巴细胞膜。
优选地，分离的黑素瘤细胞膜是外细胞膜，即黑素瘤细胞质膜。本发明的膜制剂可以含有全部的外膜或者其部分。含有一部分外膜的本发明分离的膜含有外膜的至少一种MHC分子部分和/或热激蛋白部分。膜片段的大小并不是关键的。
可以例如用半抗原修饰分离的黑素瘤细胞以及黑素瘤细胞膜。这样修饰的黑素瘤细胞和膜具有至少一种下列性质(ⅰ)引发浸润受治疗哺乳动物的肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发抗哺乳动物肿瘤的炎症免疫应答，和(ⅲ)引发对哺乳动物肿瘤的迟发型超敏反应应答。经修饰的肿瘤细胞膜和细胞也具有体外刺激T细胞的性质。
本发明的肽可以从半抗原修饰的黑素瘤细胞或膜中分离。本发明的肽可以是半抗原修饰的。对于本发明的目的，肽是两个或多个氨基酸的化合物。肽优选具有低分子量，大约1000kD至大约10000kD，更优选大约1000至大约5000。肽优选可以是大约8至大约20个氨基酸，另外肽可以被半抗原化。可以从细胞表面、细胞内部或者这两处的任何组合分离到肽。提取物对于癌细胞类型可能是特定的(对于正常细胞来说)。本发明的肽包括但不限于结合主要组织相容性复合体或者细胞表面相关蛋白(例如热激蛋白)的肽。这种肽可以是癌基因或突变的抗癌基因编码的蛋白质。各种肽或者含有小肽的黑素瘤细胞或膜的级分也在本发明的范围内。含有小肽的级分是具有刺激T细胞的能力并且含有在特定的纯化步骤中一起分离的肽的黑素瘤肽的级分。例如，从HPLC柱洗脱出的样品集合体可以代表这样一种含有小肽的级分。
本发明所使用的肽具有刺激T淋巴细胞的性质。可以通过使用标准测定来鉴定肽刺激T细胞的能力，例如通过测定T细胞摄入的标记的核苷酸或者通过测定细胞因子的产生，所述细胞因子例如但不限于γ-干扰素，肿瘤坏死因子(TNF)和IL-2。
从同种异体黑素瘤细胞分离的同种异体黑素瘤细胞膜和肽也可以在使用同源(例如自体性的)抗原呈递细胞的本发明的方法中使用。该方法允许用来自不是患者本身黑素瘤来源的黑素瘤细胞膜或肽免疫患者。同源性抗原呈递细胞处理同种异体膜或肽，使得患者的细胞介导的免疫系统可以对它们产生应答。
本说明书中提到的黑素瘤细胞、膜或肽(修饰的或未修饰的)包括可以贮存或给药的该制剂的任何形式，例如悬浮于稀释剂、作为片剂、冷冻或者冻干。
能介导肿瘤消退或者另外的抗肿瘤的特异性免疫应答(根据所证实的，例如通过T细胞体外扩增，或者T细胞细胞毒性)的哺乳动物T细胞也在本发明的范围内。T细胞可以通过用含有相同肿瘤类型的半抗原化细胞的组合物对患者免疫而体内引发或者可以通过体外克隆从这样的T细胞产生。在一个实施方案中，分离的人T细胞表达Vβ受体，其可以是Vβ1,Vβ5,Vβ13或Vβ14。本发明方法中使用的T细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，或者更通常地，是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，即与细胞介导的抗肿瘤的免疫性相关的效应淋巴细胞的一种类型。从患者分离到的T细胞可以是CD8+T细胞和Ⅰ类MHC特异性的。
本发明的细胞、膜、肽和T细胞可以单独地或者与其它化合物结合在本发明的方法中使用，包括但不限于本发明的其它组合物。因此，细胞、膜、肽或T细胞可以单独使用或者共同施用。对于本发明的目的，共同施用包括一起施用或依次施用。另外，本发明的制剂可以与其它化合物一起施用，所述其它化合物包括但不限于细胞因子，例如白细胞介素-2，白细胞介素-4,γ-干扰素(IPN-γ)，白细胞介素-12，白细胞介素-15和GM-CSF。也可以和其它癌症治疗相结合使用，包括但不限于化疗，放疗，抗体，和反义寡核苷酸。然而，本发明的优点是其可以单独用作癌治疗，使得不需要其它的治疗。
本发明的组合物可以含有本发明的分离的黑素瘤细胞、膜、肽、T细胞(修饰的或未修饰的)或者它们的组合和药学可接受载体或稀释剂，例如但不限于Hanks溶液，盐水，磷酸盐缓冲盐水，蔗糖溶液和水。一般情况下，根据想要的给药途径和标准的药学实践来选择药学可接受载体。活性成分与载体的比例自然取决于组合物的化学性质、溶解性和稳定性，以及所采用的剂量，并且可以使用本领域的一般知识来优选。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物是含有有效量的分离的半抗原修饰的黑素瘤细胞、膜、肽、T细胞或它们的组合的疫苗组合物。对于本发明的目的，“有效量”是实现期望的结果所需要的量。例如，在诱导抗肿瘤应答的方法中，“有效量”指具有引起至少一种下面现象的性质的黑素瘤细胞、膜、肽或T细胞的量肿瘤坏死、肿瘤消退、肿瘤炎症，通过激活的T淋巴细胞的肿瘤浸润和患者生存期的延长。类似地，在体外刺激T细胞的方法中，“有效量”指产生T细胞刺激的细胞、膜或肽的量。
疫苗组合物每剂量可以含有例如至少104个黑素瘤细胞，优选至少105个细胞，最优选至少106个细胞。一剂量是单次施用给药的疫苗组合物的量。关于黑素瘤膜，疫苗组合物每剂量可以含有例如至少104c.e.分离的膜，优选至少105c.e.，最优选至少106c.e.。在一个实施方案中，疫苗组合物每剂量含有大约105至大约2.5×107个细胞，c.e.膜，或者它们的组合，更优选大约5×106个细胞/c.e.。在另一个实施方案中，疫苗组合物每剂量含有从大约105至大约2.5×107个细胞，c.e.膜，或者它们的组合分离的黑素瘤细胞肽，更优选地从大约5×106个细胞/c.e.分离。要使用的本发明的肿瘤细胞、膜或肽的量一般取取于象化合物对于癌细胞的亲合性，存在的癌细胞的量和组合物的溶解度这样的因素。可以根据患者的体重和临床状况决定剂量。
本发明的疫苗组合物可以以适合真皮内、静脉内、腹膜内、肌内和皮下给药的剂量形式包装。或者所述剂量形式可以含有在给药时用例如合适的稀释剂重新配制的本发明的分离的制剂。半抗原本发明的黑素瘤细胞、黑素瘤细胞膜和黑素瘤肽可以作为修饰的、未修饰的或者修饰的和未修饰的组合来使用。对于本发明的目的，修饰的包括但不限于用半抗原修饰。不单独诱导免疫应答(但是增强抗另一种它所缀合或以其它方式连接的分子的免疫应答)的任何小分子可以作为半抗原。一般情况下，使用的分子应该小于大约1000mw。
本领域公知多种半抗原，例如TNP(Kempkes等，J.Immunol.1991,147:2467)；磷酸胆碱(Jang等，Eur.J.Immunol.1991,21:1303)；镍(Pistoor等，J.Invest、Dermatol.1995 105:92)；砷酸盐(Nalefski和Rao,J.Immunol.1993,150:3086)。
一般情况下，适合在本发明中使用的半抗原具有结合亲水性氨基酸(例如赖氨酸)的性质。半抗原可以通过赖氨酸的ε-氨基或-COOH基团与细胞缀合。另外，也可以使用可以通过重氮偶联结合疏水性氨基酸例如酪氨酸和组氨酸的半抗原。适合在本发明中使用的半抗原的例子是二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-磺酰基(sulfonic)-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，异硫氰酸荧光素，砷酸苯异硫氰酸酯(arsenic acid benzene isothiocyanate)，三硝基苯磺酸，磷酸胆碱，对氨基苯磺酸，对氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥(mustard)(Nahas和Leskowitz,Cellular Immunol.1980 54:241)和它们的组合。根据本发明所公开的，技术人员能选择用于本发明的半抗原。例如，通常可以使用迟发型超敏反应(DTH)试验测定半抗原。佐剂在一个实施方案中，黑素瘤细胞、黑素瘤细胞膜、肽或T细胞和免疫佐剂一起施用。所述佐剂具有增强对本发明制剂的免疫应答的性质。佐剂的代表性例子是BCG，或合成的佐剂，含有从皂树(Quillajasaponaria)的树皮纯化的均匀的皂甙的QS-21(Mccune等，Cancer1979 43:1619)，小棒杆菌，Corynebacterium parvum，普遍意义的皂甙，去毒的内毒素和细胞因子，例如白细胞介-2，白细胞介素-4，γ-干扰素(IFN-γ)，白细胞介素-12，白细胞介素-15，GM-CSF和它们的组合。
应该明白可以优化佐剂。换句话说，技术人员可以使用常规实验确定要使用的最佳佐剂。本发明制剂的制备方法可以如下制备在本发明中使用的黑素瘤细胞。根据如下文献所述处理肿瘤Berd等(1986)，上文，Sato等(1997),美国专利号No.5290551和美国申请系列号No.08/203004,08/479016,08/899905,08/942794，或者相应的PCT申请PCT/US96/09511，其各自在这里全文引作参考。简要地说，通过解离抽提细胞，例如通过用胶原酶和DNA酶酶解，通过在混料器中机械解离，通过用镊子挑开，使用研钵和研杵，使用解剖刀片切成小碎片。
通过使用例如低渗休克，机械解离和酶解破碎细胞，并且通过离心分离不同的细胞成分，从黑素瘤细胞制备黑素瘤细胞膜。简要地说，可以使用下面的步骤裂解肿瘤细胞，从裂解的肿瘤细胞去除细胞核以获得没有细胞核的肿瘤细胞，接着获得没有细胞和细胞核的基本上纯的膜，并且使肿瘤细胞膜接触半抗原以获得半抗原修饰的肿瘤细胞膜。可以根据Heike等的方法进行膜分离。
在本发明的一个实施方案中，可以通过连续离心去除完整的细胞和细胞核，直到根据显微镜观察膜基本上不含细胞核和细胞。例如，可以以低速度，例如大约500-2000克将裂解的细胞离心大约5分钟。分离程序使得大约2×108细胞当量(c.e.)的膜材料中留有少于大约100个细胞和/或细胞核。例如以大约100000克超离心例如大约90分钟可以沉淀含有膜的核后的上清液。沉淀含有全部的膜。膜可以再悬浮于例如大约8％蔗糖，5mM Tris,pH7.6并在大约-80℃下冷冻备用。可以使用任何稀释液，优选是作为稳定剂的。为了测定膜制剂的质量(大约6×107c.e.膜)，可以在标准的细胞培养条件下培养。细胞菌落应该不生长，光学显微镜检测不到细胞或细胞核。
可以通过已知方法用DNP或者其它半抗原对制备的细胞或膜进行修饰，例如通过Miller和Claman的方法，J.Immunol.,1976,117,1519，其全文在此引作参考，该方法包括在无菌条件下将肿瘤细胞或膜与半抗原一起培育30分钟，接着用无水盐水洗涤。通过使用单克隆抗半抗原抗体的流式细胞仪证实半抗原的修饰作用。
解离的细胞或分离的膜可以新鲜使用或者例如在控速冷冻机中或者在液氮中冷冻保存备用。细胞和膜以备解冻使用。优选地，在给予患者之前不久解冻细胞或膜。例如，在对患者进行皮试或治疗的那一天，可以解冻细胞或细胞膜。任选地，可以冲洗细胞或细胞膜，和任选地在2500R下照射。可以再次冲洗，然后悬浮于没有酚红的Hanks平衡盐溶液。
可以如上制备同种异体黑素瘤细胞膜。但是在给予受者之前，它们要与同源(例如自身性)抗原呈递细胞共培养。同源的抗原呈递细胞处理同种异体的膜，使得患者的细胞介导的免疫系统可以对它们产生应答。该方法允许用源自患者自身肿瘤之外的来源的黑素瘤细胞膜免疫患者。同种异体黑素瘤细胞膜与抗原呈递细胞培养一定时间，培养时间自大约几小时至大约几天不等。然后冲洗膜脉冲的抗原呈递细胞并对患者注射。
可以用多种方法制备抗原呈递细胞，包括例如Grabbe等，1995和Siena等，1995的方法。简要地说，例如通过静脉穿刺或者通过白细胞除去法从要免疫的患者获得血液。或者可以获得骨髓。通过梯度离心从这些来源的任一来源分离单核白细胞。可以通过用针对抗原的单克隆抗体CD34阳性选择来进一步纯化白细胞。可以在组织培养基(例如补充有例如胎牛血清，集合的人血清或自身血清这样的血清的RPMI-1640)中培养和扩增纯化的白细胞。或者，可以使用没有血清的培养基。为了刺激抗原呈递细胞的生长，可以向培养基中加入细胞因子。细胞因子包括但不局限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素-4(IL-4)，TNF(肿瘤坏死因子)，白细胞介素-3(IL-3)，FLT3配体和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培养基中分离和扩增的抗原呈递细胞可以是例如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和朗氏细胞。
本发明的肽可以根据Rotzschke等确立的技术从细胞分离，Nature,1990,348,252，其公开内容在这里全文引作参考。用弱酸，例如但不限于三氟乙酸，处理细胞。然后将细胞离心并取上清液。通过凝胶过滤(G25 Sepharose,Pharmacia)从上清液去除分子量大于5000的化合物。上清液的剩余部分在反相HPLC柱(Superpac Pep S,Pharmacia LKB)上分离，使用0.1％三氟乙酸(TFA)中增加乙腈浓度的梯度洗脱，洗脱速率为1毫升/分钟，级分规格/毫升。根据Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉巷实验室出版社，冷泉巷、纽约(1989)的方法，通过HPLC监测获得含小肽链的级分，浓缩并冷冻。通过使它们与自身B类淋巴母细胞结合，然后测定它们刺激黑素瘤特异性T淋巴细胞的能力来对级分筛选免疫活性。
通过公知技术从活组织中分离T细胞，例如制备单细胞悬浮液，过滤，排除单核细胞和通过使亚群在TCR-亚型特异性抗体存在下和/或在IL-2存在下和/或在超抗原存在下扩增来分离表达特殊TCR型的亚群。可以使用本领域公知技术体外扩增感兴趣的T细胞。
具体地说，可以如下从肿瘤制备T淋巴细胞。通过用0.14％胶原酶、0.03％DNA酶和任选地2.5U/ml透明质酸酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的混合物在室温下消化3小时从肿瘤制备单细胞悬浮液。细胞通过一层尼龙no.100网层过滤、洗涤，并再悬浮于例如Hanks缓冲盐水中。通过在补充有10％合并的人血清的终体积为2ml的RPMI-1640中在塑料皿中淘选混合物排除细胞混合物中的单核细胞并培养一星期。根据例如PCT/US93/05213中所公开的，通过将T细胞暴露给抗体和/或免疫刺激细胞因子(例如IL-2)和/或超抗原而扩增细胞。体外刺激4至5星期后可以测定T细胞的活性。也可以使用包被有各种抗体(例如抗-BV14或抗-CD8+)的Dynabeads(DYNAL,LakeSuccess，纽约)纯化T细胞，以加快T细胞扩增前后纯化T细胞的纯度和速度。T细胞体外扩增的可替换的方法包括使用肿瘤浸润细胞表达的T细胞受体的超抗原或单克隆抗体或者使用免疫刺激细胞因子，例如TNF,γ-干扰素和白细胞介素(IL-1,IL-2,IL-12等)。诱导抗肿瘤应答的方法本发明涉及通过给予有效量的含有至少一种下述物质的组合物诱导抗黑素瘤抗肿瘤应答的方法(ⅰ)基本上处于非生长期的半抗原修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞，(ⅱ)半抗原修饰的黑素瘤细胞膜，(ⅲ)从所述半抗原修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(ⅳ)能介导抗肿瘤应答例如消退黑素瘤的T细胞。根据本发明治疗的黑素瘤包括转移性黑素瘤，其可以是肺、淋巴结或皮下转移，并且优选是肺转移。根据本发明治疗的肺转移优选是小的肺转移。在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物的黑素瘤转移限于所述哺乳动物的肺转移。也可以根据本发明治疗原发性癌。也可以根据本发明治疗Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌症，优选Ⅲ期和Ⅳ期。在本发明的一个实施方案中，可以治疗家畜。
在一个优选的实施方案中，对单一肺转移和多发肺转移的哺乳动物(优选人)进行了治疗。小的转移特别适于根据本发明治疗。这样的转移病灶的大小可以是直径大约2cm，优选小于大约1.5cm，最优选小于大约1cm。这样的治疗产生的抗肿瘤应答可以部分或完全消退转移肿瘤或可以是稳定性疾病。“完全”消退指大约100％消退至少一个月，更优选至少三个月。“部分”消退指消退大约50％以上至少一个月，更优选至少三个月。“稳定性”疾病指疫苗治疗后没有明显肿瘤生长的状况。本发明治疗后观察到的另一种抗肿瘤应答是生存期的延长。
给予本发明疫苗组合物之前，通过对皮肤施用可以对受者免疫用来修饰肿瘤细胞和膜的半抗原。例如可以使用二硝基氟苯(DNFB)使患者产生抗DNP的免疫性。接着(例如大约二星期后)，可以对患者注射本发明的制剂。在本发明的一个实施方案中，在给予疫苗之前没有免疫患者。
在给予本发明组合物之前可以施用药学可接受量的低剂量环磷酰胺或者另一种低剂量化疗药。给予半抗原化疫苗组合物后可以任选地给予药学可接受量的没有半抗原化的组合物。也可以根据本发明的方法施用没有半抗原化的组合物。
可以施用(例如反复注射)组合物共至少三次，优选至少六次治疗。在一个实施方案中，给药的总次数可以是8次(包括起始给药)，在另一个实施方案中可以是10次。可以由医生设计适合特定患者状况的接种方案。注射疫苗可以例如每星期，每两星期或每四星期。可以给予加强疫苗。优选地，给予一次或两次加强疫苗。可以在例如初次给药之后大约六个月或大约一年后给予加强疫苗。
可以在癌症的常规治疗例如手术后使用本发明。切除的肿瘤或收集的肿瘤细胞可以用来根据上文所述制备肿瘤细胞和膜。
本发明的制剂可以通过任何合适途径给药，包括接种和注射，例如真皮内、静脉内、腹膜内、肌内或皮下。每次疫苗治疗可以在多个位点给药。例如每次给药，可以通过在至少两处，优选三处连续的位点真皮内注射给予疫苗组合物。在本发明的一个实施方案中，在上臂或腿部给予疫苗组合物。
可以通过给予各种生物反应调节物来提高疫苗的效力。这些药剂通过直接或间接刺激免疫应答而起作用。本发明的生物反应调节物包括但不限于白细胞介素-12，白细胞介素-15和γ-干扰素。在一个实施方案中，在每次疫苗注射之后给予IL-2。对有炎症反应的患者给予IL-2可以引起肿瘤块内的T淋巴细胞增生并且变得更具活性。增加的T细胞数目和提高的功能能力导致肿瘤的免疫破坏和消退。
修饰的肿瘤细胞、膜和肽各具有刺激T细胞的性质。“刺激”对于本发明目的来说指诱导T细胞增殖以及体外通过T细胞的细胞因子的产生。通过摄入修饰的核苷酸，例如但不限于3H胸苷，125IUDR(碘代脱氧尿苷)；和对活细胞染色的染料，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)可以检测和测定T细胞的增殖。另外，例如但不局于IFNγ，肿瘤坏死因子(TNF)和IL-2这样的细胞因子的产生在表现出T细胞增殖中可能是有用的。可以使用本领域公知的试验可以检测和测定细胞因子的产生。细胞因子的产生应该高于背景水平，其一般高于25皮克/毫升，优选高于100皮克/毫升。
下面非限制性实施例进一步详述本发明。
对3/16的患者观察到部分应答(PR)(计算机体层摄影术记录)。第4个患者表现出进行性的肿瘤消退，＜50％消退至今(稳定的疾病)。PR的详细情况如下患者1多个(＞50)小的(5-10mm直径)肺小结消退90％；患者2直径1cm的实体小结消退75％；患者31cm的小结完全消退，两个伴生小结部分消退。所有应答都出现在转移灶限于肺的患者身上。直到接种治疗开始后4-6个月，在反应者身上的肿瘤消退才是明显的。4名PR或稳定病情的患者的存活期分别是34.5个月，8.5+个月，9.2+个月和17+个月。因此，DNP-黑素瘤细胞疫苗可以诱导放射照相术记录的黑素瘤转移灶的消退。小的肺转移病灶特别敏感于免疫破坏。
可以如下治疗小而多肺转移黑素瘤患者和肺转移黑素瘤患者。疫苗组合物可以含有最少2.5×106c.e.排除锥虫蓝的黑素瘤细胞膜和最多7.5×106c.e.黑素瘤细胞膜，悬浮于0.2ml Hanks溶液中。每一次疫苗治疗可以由向邻近位点三次注射组成。
可以用1ml无菌水或磷酸盐缓冲盐水，pH7.2(PBS)重新配制冻干的材料。可以在无菌缓冲盐水中制备合适的稀释液。然后在注射之前可以取0.1ml与疫苗混合。第一和第二疫苗可以与0.1ml的1∶10稀释的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是从Organon Teknika公司(Durham,NC)获得的Tice株(Pasteur Institute株的亚株)。第三和第四疫苗可以与0.1ml的1∶100稀释液(“Tice-3”)混合)。第五和第六和加强疫苗可以与0.1ml的1∶1000稀释液(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反应是不大于小的(＜5mm)中心溃疡的炎性丘疹。
可以通过在前臂上真皮内注射0.1ml试验材料进行皮试，通过测量硬结的平均直径评价48小时时的DTH。对下面的材料进行测试1)1×106没有用DNP修饰的和用DNP修饰的自身黑素瘤细胞膜；可以使用酶解的(TCE)和机械解离的(TCM)黑素瘤细胞；2)3×106没有用DNP修饰的和用DNP修饰的自身外周血淋巴细胞；3)Hanks溶液；和4)PPD-中间强度。也通过对上臂腹侧表面皮肤施用200μg DNFB并且在48小时时检查硬结圈的面积可以测试对DNFB的接触过敏性。可以在给予疫苗六星期期满后进行全套DTH试验。预处理DTH试验可以限于DNP-修饰的黑素瘤细胞膜，PPD和稀释液。设计该方案以避免1)患者对DNP-修饰的淋巴细胞敏化和2)通过注射未修饰的黑素瘤细胞使患者有耐受(tolerizing patients)。
可以对所有患者采集血液用于淋巴细胞和血清的分离和深低温保存，每一次都进行皮试。可以周期性地测定对自身癌细胞的反应，这一点通过增殖，细胞因子释放和细胞毒性来测定。
可以在疫苗治疗开始之前对患者评定转移病灶。疫苗治疗头六个星期之后，可以每三个月进行一次评定。可以在第二年中连续进行评定，在第三年中每四个月评定一次，之后每六个月评定一次。一年评定中反应的患者可以接受最后一次加强疫苗注射。然后在不再治疗的情况下跟踪他们的状况。
也可以进行功效研究来确定DNP疫苗是否延长了这些患者不复发的时间和/或总的存活时间。可以测定存活参数(Kaplan-Meier方法)。
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1．一种诱导哺乳动物抗黑素瘤转移的抗肿瘤应答的方法，包括对所述哺乳动物施用含有治疗有效量的至少一种下述物质的组合物(ⅰ)基本上处于非生长期的半抗原-修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞，(ⅱ)半抗原-修饰的黑素瘤细胞膜，(ⅲ)从所述半抗原-修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(ⅳ)能介导抗肿瘤应答的T细胞；其中所述转移位于所述哺乳动物的肺。
2．权利要求1的方法，其中所述抗肿瘤应答是至少一种下述情况肿瘤坏死，肿瘤消退，肿瘤炎症，通过激活的T淋巴细胞的肿瘤浸润，稳定的疾病和延长患者生存时间。
3．权利要求1的方法，其中所述抗肿瘤应答是转移的完全或部分消退。
4．权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
5．权利要求1的方法，其中所述细胞膜是同源黑素瘤细胞膜或同种异体的黑素瘤细胞膜。
6．权利要求5的方法，其中所述黑素瘤细胞膜是同种异体的并且所述组合物进一步包含一种抗原呈递细胞。
7．权利要求1的细胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，热激蛋白或者它们的组合的膜级分。
8．权利要求1的方法，其中所述半抗原选自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-磺酰基-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，异硫氰酸荧光素，砷酸苯异硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，对氨基苯磺酸，对氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它们的组合。
9．权利要求1的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
10．权利要求1的方法，其中所述组合物进一步包括一种佐剂。
11．权利要求10的组合物，其中所述佐剂选自卡介菌，QS-21，去毒的内毒素和细胞因子。
12．权利要求1的方法，其中所述给药是以一定时间间隔重复至少六次。
13．权利要求12的方法，其中所述给药每星期重复一次。
14．权利要求1的方法，进一步包括在给予所述组合物之前给予治疗有效量的环磷酰胺。
15．权利要求14的方法，其中所述的治疗有效量的环磷酰胺包括在给予所述组合物之前给予大约300mg/M2剂量的环磷酰胺。
16．一种诱导患黑素瘤的哺乳动物抗转移的抗肿瘤应答的方法，包括对所述哺乳动物施用含有治疗有效量的至少一种下述物质的组合物(ⅰ)基本上处于非生长期的半抗原-修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞，(ⅱ)半抗原-修饰的黑素瘤细胞膜，(ⅲ)从所述半抗原-修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(ⅳ)能介导抗肿瘤应答的T细胞；其中所述转移是小的肺转移。
17．权利要求16的方法，其中所述抗肿瘤应答是至少一种下述情况肿瘤坏死，肿瘤消退，肿瘤炎症，通过激活的T淋巴细胞的肿瘤浸润，稳定的疾病和延长患者生存时间。
18．权利要求16的方法，其中所述抗肿瘤应答是肺转移的完全或部分消退。
19．权利要求16的方法，其中所述哺乳动物是人。
20．权利要求16的方法，其中所述的膜是同源黑素瘤细胞膜或同种异体黑素瘤细胞膜。
21．权利要求20的方法，其中所述黑素瘤细胞膜是同种异体的而且所述组合物进一步包含一种抗原呈递细胞。
22．权利要求16的细胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，热激蛋白或它们的组合的膜级分。
23．权利要求16的方法，其中所述半抗原选自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙酰基-N′-(5-碘酰基-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，异硫氰酸荧光素，砷酸苯异硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，对氨基苯磺酸，对氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它们的组合。
24．权利要求16的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
25．权利要求16的方法，其中所述组合物进一步包括一种佐剂。
26．权利要求25的组合物，其中所述佐剂选自卡介菌，QS-21，去毒的内毒素和细胞因子。
27．权利要求16的方法，其中所述给药是以一定时间间隔重复至少六次。
28．权利要求27的方法，其中所述给药每星期重复一次。
29．权利要求16的方法，进一步包括在给予所述组合物之前给予治疗有效量的环磷酰胺。
30．权利要求29的方法，其中所述的治疗有效量的环磷酰胺包括在给予所述组合物之前给予大约300mg/M2剂量的环磷酰胺。
全文摘要
本发明涉及通过施用有效量的含有至少一种下述物质的组合物诱导抗转移黑素瘤的抗肿瘤应答的方法:(i)基本上处于非生长期的半抗原－修饰的同源哺乳动物黑素瘤细胞,(ii)半抗原－修饰的黑素瘤细胞膜,(iii)从所述半抗原－修饰的黑素瘤细胞或膜分离的肽和(iv)能介导抗肿瘤应答例如消退黑素瘤的T细胞。根据本发明治疗的转移黑素瘤包括限于肺的转移黑素瘤,并且优选是小的肺转移。本发明进一步涉及黑素瘤细胞,分离的黑素瘤细胞膜,从这样的细胞或膜分离的肽和具有诱导抗肿瘤应答性质的T细胞,含有这样的细胞、膜、肽、T细胞或它们的组合的组合物,以及它们的分离和制备的方法。
文档编号A61K35/28GK1301174SQ99806236
公开日2001年6月27日 申请日期1999年4月9日 优先权日1998年4月9日
发明者D·伯德 申请人:托马斯杰斐逊大学