专利名称：抗肥胖和降低内脏脂肪蓄积的物质及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及在以脂肪酸和丙酮酸为基质的能量代谢(呼吸)细胞中小器官的线粒体(以下记作MC)功能中，能使脱共轭蛋白(UCP)产生的脱共轭呼吸乃至MC内膜的质子泄漏(Proton leak，以下统称为质子泄漏)出现特异亢进作用的新物质；更详细地讲，本发明涉及含有共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质，具有使包括人在内哺乳动物等的MC的质子泄漏产生特异亢进作用的新物质，以及涉及作为有效成份含有该物质的抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积，以下简称为内脏脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)(以下简称为内脏)脂肪蓄积用降脂肪剂，作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪蓄积)和减少脂肪蓄积功能的食品，作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪蓄积)和减少脂肪蓄积功能的饲料等用途。
生物体的能量代谢调节系统，由摄食调节系统和能量消耗系统组成。本发明目的在于通过控制能量调节系统，抑制视为生活习惯病等发病多重危险因子的内脏脂肪的蓄积并使其减少。
能量消耗调节系统，可以分为维持生命中基础代谢所需能量消耗及其外的能量消耗。属于后者范畴的主要有非寒栗热产生(nonshivering thermogenesis，以下间记作nST)，关于该功能的作用可以举出出生、暴露在寒冷中、冬眠醒来时等等以维持体温，以及防止因消耗摄取的过量能量而导致肥胖和糖脂代谢障碍等。在nST产生的作用中，主要是线粒体(MC)的共轭呼吸乃至MC内膜中的质子泄漏，即与细胞的呼吸链和ATP的合成有关，其详细情况如下。ATP是维持细胞功能所必须的，细胞向细胞内的MC输送脂肪酸和细胞质分解糖系统中生成的丙酮酸，在其中氧化产生酰基辅酶A。这种酰基辅酶A在柠檬酸回路中被氧化，该氧化过程中生成二氧化碳和NADH，再由NADH产生高能电子。高能电子在MC内膜的呼吸链(电子传递系统)中与分子氧结合放出能量。该能量使质子通过MC内膜并由基质吸到膜间部分。
结果内膜两侧形成质子电化学梯度。膜间部分的质子遵循该梯度返回基质时，使与膜结合的ATP合成酶起作用，由ATP+Pi生成ADP。
生物体为使ATP与ADP之比保持一定，将配合生物体状态调节呼吸链电子传递系统的速度。ATP消耗一旦增加，就会使电子传递速度加快，因而必须供给质子。激烈运动时，脂肪和糖以休息时5～10倍的速度氧化。
脂溶性弱酸2,4-二硝基酚(2,4-DNP)以质子离子载体形式起作用，MC内膜中除ATP合成酶之外，由于形成一种能质子通过内膜流过的路径，所以使内膜呼吸链中产生的质子电化学梯度消失，不能合成ATP。也就是说，2,4-DNP使呼吸链的电子传递系统与ATP的合成脱共轭，因而有脱共轭剂作用。因不能合成ATP，所以呼吸链中电子传递速度处于允许基质供给的最大速度下(参见细田等，Mebio,14(11),30-31(1997))。
褐色脂肪组织(BAT)中存在由大约300个氨基酸组成的、分子量32kD的蛋白质，这种蛋白质是能使该褐色脂肪细胞(BA)的MC内的呼吸链电子传递体系与ATP合成脱共轭的特异蛋白质，即脱共轭蛋白质-1(UCP-1)。UCP-1是由大约100个氨基酸形成的区域重复三次而成，而且每个区域上各有两处，共有六处膜贯通部位。
这些膜贯通部位形成通道。UCP-1是输送质子的载体，质子沿着该质子通道，按照电化学梯度自由透过，据发现有放出热量的功能。这形成nST。ATP的合成因脱共轭作用而减少，MC内的呼吸为维持ATP与ADP之比一定而变得活泼，结果大量脂肪和糖被氧化而发热。
UCP-1功能的调节，由其出现的数量和活性两方面进行。也就是说，由交感神经末端分泌出来的去甲肾上腺素，通过细胞膜上的β肾上腺素受体(β-AR)使腺苷酸环化酶活化，导致细胞内cAMP浓度上升。
cAMP经蛋白激酶A(PKA)活化、激素敏感脂肪酶(HSL)活化而分解中性脂肪，生成脂肪酸(FFA)。这种FFA与UCP-1结合使关闭的质子通道打开，同时起生热基质的作用。另一方面，UCP-1的出现量主要由核内基因的复制水平调节，UCP-1基因的出现随cAMP浓度上升而增加(斋藤等人，最新医学52,1095-1096(1997))。
UCP-1的生理意义，主要是出生或暴露在寒冷环境中时保持体温，此外用试验鼠(trans genic mouse)研究说明，与防止肥胖也有关系。UCP-1与肥胖的产生、发展和维持之间的关系表明，各种肥胖模型中均出现UCP-1的降低。此外还证明，BAT减少导致试验鼠无过食性肥胖发生(Lowell BB等人，Nature366,740-742(1993))。另一方面，大量发现UCP-1时体脂肪减少的现象，利用使UCP-1强制出现的这种试验鼠证明，UCP基因被结合到脂肪细胞的特异基因aP2的启动子之中(Kopecky J.等人，J.Clin.Invest.96,2914-2923(1995))。
然而也有人认为，成年人中存在的BAT量极少，因而难于考虑BAT特异UCP-1的生理意义。
另外，还有人(河田照雄、私信)支持此论点，他们认为这种BAT的生理意义不仅对实验动物，即使对人也适用，其论点有(1)可以测定UCP量，自新生儿(一日)到老人(86岁)体内的BAT测定后发现，其肾脏周围和腋下均存在该物质。(2)15岁以下小孩体内存在量多，成人体内约存在50克，其活性降低可以使体重在一年中增加25公斤。(3)成年犬体内的BAT，与成年人一样因被白细胞化而不能检出，但是一旦投药β-3肾上腺素受体作用药，未成熟或脱分化的褐色脂肪细胞就会活化，以分化的BA形式出现UCP及其基因mRNA。据说细胞内能量消耗大约有20～40％发生在MC内膜的质子泄漏上。而且，在只有少量BAT的成人及其他动物中，大部分nST是由骨骼肌和白色脂肪组织(WAT)产生的。由以上得出，UCP存在于BAT以外的组织中。1997年两个小组依次报导了UCP-2的cDNA克隆(Fleury C.等人，NatureGenet.15,269-272(1997)；Gimeno R.等人，Diabetes 46,900-906(1997))。人体的UCP-2与人体的UCP-1表现有59％的同源性，与UCP-1同样在其中有六处膜贯通部位，而且具有嘌呤核苷结合部位。UCP-2与UCP-1不同，能在全身组织中发现，肺脏、胰脏中浓度特别高，此外在心脏、肝脏、脑、肾脏、精巢、WAT、BAT中都能检出。而且高脂肪进食的试验鼠体内的副睾周围脂肪组织中也发现了UCP-2基因。
尽管骨骼肌是nST的主要组织，但是在骨骼肌中发现的UCP-2基因浓度却比WAT中的高，因而可以推定UCP-2以外的UCP在骨骼肌中存在的浓度较低。骨骼肌中的这种新的UCP，首先是从大白鼠体内分离出来的，鉴定证明由308个氨基酸组成，大白鼠体内UCP-1和UCP-2的同源性，分别为57％和72％。而且在大白鼠组织中检出的基因量，骨骼肌中浓度特别高，BAT中等，WAT和心脏浓度较低(Matsuda J.等人提供)。
据另外两个小组报告，在人骨骼肌中发现了高浓度UCP-3的cDNA克隆(Boss O.等人，FEBS Lett.408,39-42(1997)；Vidal-Puig A等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.235,79-82(1997))。上述大白鼠体内的新颖UCP显示出87％的同源性(细田等，Mebio,14(11),30-34(1997))。
鉴于在作为nST主要组织形式的骨骼肌中发现了新的、与已有不同的UCP基因，因而促进了各种脱共轭蛋白的分离和鉴定及其功能评价，同时也促进了对发现其亢进方法的检索，可以预期这将能够在人类抗肥胖方面创造出划时代的重要技术成就。
生物体内多余的能量，首先以内脏脂肪(特别是肠道粘膜脂肪)形式优先蓄积，这种内脏脂肪与其他部位的脂肪(特别是皮下脂肪)相比，容易受到脂肪动员而被迅速分解消耗。这种内脏脂肪(肥胖)被视为生活习惯病(成人病)发病的多重危险因子，其理由是由WAT的白色脂肪细胞(WA)分泌出的脂肪酸，经由门脉直接流入肝脏，使胰岛素抗性和脂肪合成亢进，结果导致耐糖性能异常，招致身患高血压症和高血脂症，这些症状最终合并成动脉硬化症。
综上所述，人们正期待着开发出抑制和降低内脏脂肪蓄积，预防成人身患生活习惯病并在其治疗上具有重大贡献的物质。
本发明提供一种具有抗肥胖和降低内脏脂肪蓄积作用的物质及其用途。
本发明涉及含有共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质，其中含有能使包括人在内哺乳动物及鸟类的产生非寒栗热(nonshivering thermogenesis)的主要组织的骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)产生特异亢进作用的共轭异构化高度不饱和脂肪酸及其衍生物的物质，作为有效成份含有上述物质的抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪的蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积的降脂肪剂，作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪的蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的食品，以及作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪的蓄积)和降低内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的饲料。
本发明得到的上述物质，对于包括人在内的哺乳动物及鸟类生物组织中的细胞内、作为nST主要组织的骨骼肌、WAT及BAT等，例如含有BA、线粒体的细胞及WA等的MC的脱共轭呼吸乃至MC内膜的质子泄漏具有特异亢进作用。
为了使引起成人生活习惯病(成人病)患病的多重危险因子，即内脏脂肪(特别是肠道粘膜脂肪)蓄积得到抑制和减少，基本上依赖于促进生物体中能量消耗调节系统内的nST(非寒栗热产生)。本发明中，除了以前作为nST组织在相对较小的BAT内MC的质子泄漏亢进之外，最近刚刚在基因水平确认在视为主要nST组织的骨骼肌和WAT中发现了高浓度UCP小类，即UCP-3和UCP-2，并创造了使其功能亢进的手段，因此可以预期能使其效率飞速提高。
本发明的主要课题是，着眼于在BAT中找到全部UCP小类mRNA，并用共轭异构鱼油使BAT内UCP出现亢进，重新导入UCP小类中的各mRNA分析样品，取出用共轭异构鱼油饲养的大白鼠的BAT，检索整个小类的mRNA。
也就是说，本发明课题在于提供一种含有属于能够使包括人在内的哺乳动物生物体内能量消耗调节系统主要系统的作为nST主要组织的骨骼肌及WAT、组织量虽小但单位功能极大的BAT、各MC的质子泄漏产生特应性亢进，具有促进nST功能的共轭异构化高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质，作为有效成份含有该物质的抗肥胖(抑制内脏脂肪蓄积)和内脏脂肪蓄积降低剂，以及包含作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖和减少内脏脂肪蓄积功能的特定保健食品(功能食品)的一般加工食品，和赋予该抗肥胖和减少内脏脂肪蓄积功能的饲料。
本发明人等以解决上述课题为目的进行了深入研究，结果发现利用以下事项能够解决上述课题，因而完成了本发明。
也就是说，本发明以以下事项作为其基本构成。(1)一种含有共轭异构化高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质，其中含有能使包括人在内的哺乳动物及鸟类的非寒栗热产生(nonshivering thermogenesis；nST)主要组织、骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)产生特异亢进作用的共轭异构化高度不饱和脂肪酸及其衍生物的物质。(2)具有上述作用的成份是共轭异构化高度不饱和脂肪酸(HUFA)类的上述(1)记载的物质。(3)具有上述作用的成份是HUFA衍生物的氧化产物的呋喃HUFA衍生物的上述(1)记载的物质。(4)能使作为主要nST组织的骨骼肌、白色脂肪组织、褐色脂肪组织等的含线粒体的细胞有特异作用，使该细胞中脱共轭蛋白同族体(UCPhomologue)的出现量产生显著增大作用的上述(1)、(2)或(3)中记载的物质。(5)作为有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)记载的作为nST的主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)具有特异亢进作用的物质的抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积的降脂肪剂。(6)作为有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)记载的作为nST主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)具有特异亢进作用的物质的赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的食品。(7)作为有效成份，含有上述(1)、(2)或(3)记载的作为nST主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)具有特异亢进作用的物质的赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的饲料。
以下对本发明作更详细的说明。
本发明的使NST组织的MC的质子泄漏产生特异性亢进作用的物质，是含有共轭异构化的高度不饱和脂肪酸和/或其衍生物的物质。
本发明中所说的物质，并不限于含有这些物质的适当的配合物、组合物、混合物等，也可以是这些成份本身。
本发明的上述物质，只要是具有与共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类同样功能的，并不限于合成品，也可以是由自然界提取出来的共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类的浓缩物、提取物、精制品、分离产物和加工品等。
具体讲，例如可以举出来源于自然界的三价以上的高度不饱和脂肪酸(HUFA)及衍生物、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸、花生油烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等高度不饱和脂肪酸及混合物，至少有一个酰基作为HUFA及其混合物残基的三酰基甘油、二酰基甘油及一酰基甘油及其混合物，至少有一个酰基作为HUFA及其混合物残基的甘油类脂化合物，例如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺类、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇类、磷脂酰甘油类、心磷脂、磷脂酸、双磷脂酸、焦磷脂酸、乙醇胺缩醛磷脂等类脂化合物型磷类脂化合物，溶血卵磷脂、溶血酰乙醇胺等溶血型磷类脂化合物，以及髓磷脂、神经酰胺磷酸乙醇胺等神经类脂化合物等及其混合物，钠、钾、钙等安全的HUFA及其混合物的酯类和葡萄糖等单糖类、蔗糖等双糖类及木糖醇等低聚糖等安全的HUFA及其混合物的酯类等，经过适当手段将其共轭异构化的物质和预期具有相同效果的物质。
本发明中所说的共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类，具体是指例如共轭化HUFA和/或其混合脂肪酸，HUFA及其混合物结合型共轭化三酰基甘油，例如共轭化鱼油、共轭化亚麻子油，1-和/或3-共轭化HUFA及其混合物结合型二酰基甘油，1-和/或2-共轭化HUFA及其混合物结合型二酰基甘油，1-和/或2-共轭化HUFA及其混合物结合型一酰基甘油，1-和/或2-共轭化HUFA及其混合物结合型甘油磷脂，例如、1-和/或2-共轭化HUFA及其混合物结合型卵磷脂等、共轭化HUFA及其混合物置换型溶血卵磷脂等、共轭化HUFA及其混合物的钠盐等、共轭化HUFA及其混合物的乙基酯类等以及共轭化HUFA及其混合物的蔗糖酯类等。
作为本发明上述物质的原料，虽然可以举出天然油脂，尤其是自然界存在的高度不饱和油脂，例如鱼油等水产油脂，以及亚麻子油、紫苏子油等天然植物油脂，大麻子油、亚麻子油、白苏子油、菜籽油、奥提西卡油、核桃油、芥子油、石榴籽油、豆油、日本泡桐油、月见草籽油、橡胶核油、酸橙籽油、油菜籽油、亚麻子油、妥尔油、ほぅせんか油、沙丁鱼油、鳗鱼油、鲣鱼油、大马哈鱼油、鲭鱼油、秋刀鱼油、青鱼油、鲺鱼油、竹荚鱼油、金枪鱼油、大马哈鱼油、大马哈鱼子油、鲱鱼油、ジヤツクマツカレル油、鲨鱼肝油、墨鱼肝油、沙丁鱼肝油、箭鱼肝油、鲣鱼肝油、明太鱼肝油、鳕鱼肝油、鲺鱼肝油、金枪鱼肝油、海豹油、海驴油、各种鲸鱼油等，但是并不特别限于这些，只要是与这些同等或类似的，不限种类都可以适用。
使上述原料共轭异构化的方法，可以举出例如化学处理法、腔肠细菌发酵法、动物肠内细菌发酵法、脱氢酶处理法和金属触媒法，例如在苛性钠或苛性钾存在下加热法可以得到共轭化的HUFA及其钾盐，叔丁醇钠或钾盐存在下加热法可以得到该HUFA甘油酯类的共轭异构体，利用反刍动物的腔肠细菌，例如Butyrivibrio fibrisolvens和其他动物无害肠道细菌使HUFA及其衍生物的共轭异构化法，利用酶反应、生物体反应、细胞功能、基因功能等生物化学反应的共轭异构化法，以容易形成氢化物的钯、钛、锆、镁及其合金、Mg2Ni、LaNi5、TIFe等作为触媒的热处理法等，但是并不限于这些，只要是能有效实现共轭异构化的方法，不论其种类如何都可以利用。
此外，本发明中有关共轭异构体的定量测定，由于在该HUFA衍生物的共轭异构体中，存在双键位置异构体及其各种立体异构体(顺式和反式异构体)，确定其特定结构及其生成量及其困难，所以决定定量测定其全部共轭双键。
本发明中所说的共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类的衍生物，只要具有与上述高度不饱和脂肪酸类同样功能的衍生物，不论是合成品还是天然品都可以使用。具体讲，例如多元不饱和脂肪酸、共轭亚油酸及其混合物(以下简记作CLA)、钠盐等盐类、乙基酯等酯类、至少一个酰基是CLA残基的三酰基甘油类、同样的二酰基甘油类、同样的一酰基甘油类及其混合物、至少一个酰基是CLA残基的甘油磷脂及其混合物、以及上述共轭异构化的HUFA及其混合物的衍生物，例如游离酸、盐类、酯类、酰基甘油类及其混合物、甘油磷脂及其混合物等生物体内及外因性氧化生成物的呋喃衍生物。例如，北海道产秋季大马哈鱼新鲜精巢中的内因性呋喃衍生物，如表6中所示是六种异构体的混合物，而且结构最简单的共轭脂肪酸的CLA被自氧化而成的外因性呋喃酸，也是包含与表6类似的数种异构体(M.P.Yurawecz等人，Lipid,30,(7),595-598(1995))的物质。
对共轭化的HUFA而言，已知有抗氧化功能，容易被氧化成呋喃衍生物，呋喃脂肪酸在包括人类在内的哺乳动物和鱼类、植物体内广泛分布(M.P.Yurawecz等人，Lipids,30,(7),595-598(1995))。经确认，特别在鱼类体内存在的呋喃脂肪酸随季节变化，而且在其肝脏和精巢类脂化合物中含量极高，约占全部脂类化合物的一半以上。此外，给大白鼠投药后，呋喃脂肪酸经确认被小肠吸收进入血液之中(D.M.Sand等人，Biochim.Biophys.Acta751,455-461(1983))。鱼类精巢中的呋喃脂肪酸，在雌性产卵期前其含量达到最大，以后迅速消失(D.M.Sand等人，Biochim.Biophys.Acta793,429-434(1984))。关于该呋喃脂肪酸的生理作用，有人报告说，过氧化物能防止细胞损伤(M.P.Yurawecz等人，INFORM,7(2),156(1996))。
细菌的尿素酶(Urease)对呋喃脂肪酸的自氧化产物有阻碍作用(G.Rosenblat等人，J.Am.Oil.Chem.Soc.70,501-505(1993))，而且对脂氧合酶-1(Lipoxygenase-1)的氧化产物显示生理作用(R.F.Boyer.等人，Chem.Phys.Lipids,25,237-246(1979))。
本发明的上述物质由于可以作为例如医药品、食品、饲料等的有效成份使用，所以可以根据其用途精制到适当水平。特别是对于特定保健食品(功能食品)等加工品而言，可以适用比较精制的原料，而对于用作饲料的场合下，原材料天然油脂，例如由沙丁鱼油、亚麻子油、白菜籽油、菜籽油、鲱鱼油、墨鱼肝油、鲣鱼肝油等，可以在粗制品水平下使用。
本发明的上述物质，是含有上述共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类的物质，例如可以是共轭化鲣鱼油、共轭化金枪鱼油、共轭化大马哈鱼卵油、共轭化亚麻子油、共轭化日本泡桐油、共轭化豆油、共轭化白菜籽油等，但是对于本身不是食用油脂的，以及与食用油脂有别的，例如棕榈油、椰子油、猪油、牛油等一般食用油脂的作用，尚未被承认。
本发明中为了阐明上述有效成份的有用性，如下文记载的实施例具体所示，病态试验鼠体内给药的共轭异构化鱼油，是共轭异构化DHA结合型鱼油，所以对各试验动物给予作为典型ω-3HUFA的DHA共轭异构体的典型氧化产物的呋喃酸结合型特殊鱼油，然后测定了内脏脂肪量和UCP以及UCPmRNA。
其结果，在对照猪油区(必须进行脂肪酸强化)中，在显著性水准下，BAT的UCP的表达量多而且内脏(特别是肠道粘膜)脂肪量少，是糠基化油脂(含有呋喃脂肪酸)和共轭异构型DHA结合中性油脂。
此外，对病态试验鼠投药共轭异构鱼油后，在其BAT中发现的UCP小类mRNA浓度(在对照猪油区)，UCP-2浓度高，但UCP-1和UCP-3的浓度低；若从主要nST组织中各mRNA一般的表达图案的骨骼肌(3型浓度高，2型浓度中等，1型未发现)、WAT(2型浓度较高，3型浓度较低，1型未发现)和BAT(1型浓度高，2型和3型浓度低)考虑，则投予本发明有效成份的试验鼠体内nST组织中发现UCP小类的mRNA浓度，可以推定在BAT中UCP-2浓度高，在WAT中UCP-2浓度高，而在骨骼肌中UCP-3浓度高。不用说给予共轭异构化DHA结合鱼油的试验鼠内脏(特别是肠道粘膜)脂肪，就连体重都有显著性降低。此结果强烈暗示着上述推定是正确的。
为了使nST组织内细胞的MC中的脂肪和糖燃烧，UCP族的表达是不可缺少的，本发明的有效成份，如上所述，由于具有能够使该组织细胞内的UCP族的量显著增大的作用，所以从分子水平的观点来看，可以证明能有效抑制内脏脂肪蓄积和减少内脏脂肪蓄积。
本发明的上述有效成份，对于包括人在内哺乳动物而言，能够使与其nST有关的骨骼肌等非寒栗热产生组织细胞中MC的内膜贯通型蛋白的UCP同族体表达量显著增大，具有使上述细胞中MC的质子泄漏产生特应性亢进的作用。本发明的上述物质，是由天然脂肪中得到的、作为HUFA共轭异构体及其氧化生成物的呋喃酸及其衍生物，如上所述，能使骨骼肌等nST组织细胞中UCP同族体表达量显著增大的高浓度UCP表达物质，可以以其表达活性为指标进行鉴定、分离和精制。
以本发明的上述成份作为有效成份，可以制备对于抗肥胖具有特别显著效果的内脏脂肪蓄积降低和内脏脂肪蓄积抑制剂。作为所说的降脂肪剂和抑制剂的载体，根据其使用方式的不同，可以使用适当的填充剂、粘合剂、增量剂、崩解剂、表面活性剂、防潮剂、赋形剂、稀释剂等。制剂形式可以根据其使用目的适当选择，没有特别限制，例如可以举出锭剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、胶囊剂等固体剂型，以及液剂、悬浮剂和乳剂等。
这样得到的内脏脂肪蓄积降脂肪剂和内脏脂肪蓄积抑制剂最好经口给予，其给予量可以根据服药者症状等适当选择。因此，关于给予量和给予次数没有特别限制。
此外，以本发明的上述物质为有效成份，可以制备通常食品和特定保健食品(功能食品)。而且，也可以将该物质作为各种食品的添加剂使用。上述食品的种类并不限于特定保健食品，也能用于通常健康食品，例如蛋糕、点心、巧克力、日式点心、肉制品、冰淇淋、鱼肉制品、调理食品等，以及原来视为增肥的食品等。
本发明上述物质在上述食品中的添加量和添加形态等，可以根据食品种类和制品概念以及制品形态等适当选择。作为实例，在食品中的配入量，通常为一次摄取量优选处于100～1000毫克左右。
此外，通过在饲料中配入本发明的上述物质，可以制备赋予家畜等内脏脂肪蓄积抑制功能乃至内脏脂肪蓄积降低功能的饲料。
可以配入本发明上述物质的饲料，可以举出牛、猪、鸡等家畜用饲料，特别是肉牛等家畜用饲料。本发明上述物质在饲料中的配入量和配入形态等，可以根据饲料种类、家畜的饲养状况等适当选择。例如，作为肉牛饲养饲料时，优选配入50～500毫克左右。
以下用实施例具体说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的任何限制。此外，就含有上述其他共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质也进行同样试验后，得到大体相同的结果。
以金枪鱼眼窝油为原料，精制、制备了DHA含量为45～50％的高DHA含量的甘油三酸酯(TG)(以下简记作金枪鱼精制TG)。向制备的120克金枪鱼精制TG中，加入二甲基甲酰胺制成200毫升。然后将其全量移入500毫升带盖锥形瓶中，向其中添加大约12克叔丁醇钾((CH3)3COK)，将烧瓶中的空气用氮气置换后，30℃下培养1小时。
培养后将溶液调成酸性，反应物用正己烷萃取。萃取物水洗后脱水，接着在减压下尽可能完全地除去溶剂。将得到的反应生成物供入硅酸色谱柱中，制备共轭异构TG。其中硅酸柱中的溶剂，使用正己烷、含有5％乙醚的正己烷和含有20％乙醚的正己烷，回收20％乙醚级分。用这种操作得到的共轭异构TG是原来样品油脂(金枪鱼精制TG)重量的大约40～50％。上述异构化和精制操作进行五次，得到了大约250克共轭异构TG。
(2)共轭异构TG的定量测定用标准方法(日本油化学会编《标准油脂分析试验法》2.4.15-71)，测定了上述操作得到的TG中共轭酸含量。在50毫升容量瓶中准确取10～20毫克油脂，用环己烷将其稀释到刻度后，在233、262、268、274、308、315和322nm下测定了其紫外吸收，按下式算出共轭酸含量。
kλ=Aλ/(b×c)(波长λ下的吸光度；b比色槽长度，厘米；c浓度，克/升)k2=k233-k0k3=2.8[k268-1/2(k262+k274)]k4=2.5[k315-1/2(k308+k322)]在酯的场合下，k0=0.07共轭二烯、共轭甲苯和共轭四烯的含量(％)可以由下式求出。
共轭二烯=0.91k2共轭甲苯=0.47k3共轭四烯=0.45k4
用上述公式分析了样品油(金枪鱼精制TG)和异构TG的共轭酸含量后发现，样品油中共轭二烯含量为3.3％，共轭三烯和共轭四烯含量均为0％。而且，异构TG中，共轭二烯含量为27.3％，共轭三烯含量为6.8％，共轭四烯含量为4.4％，共轭酸总量为38.3％。
其中，对上述共轭异构TG进行反相HPLC分析后查明，DHA的共轭异构体是共轭不饱和脂肪酸的主要脂肪酸。HPLC柱使用了ODS(野村科学，DevelosilODS-UG-5)，检出是用UV检出器测定235nm波长吸收的方法进行的。
然后对样品油和共轭异构TG进行了气相色谱(GC)分析。GC柱使用了Omegawax320，在200℃柱温度下进行分析。其结果发现，样品油中DHA含量变成45％，高度不饱和脂肪酸几乎都是DHA。另外，在共轭异构TG中，仅检出大约2％DHA，可以认为样品中的DHA几乎均被异构化。此结果与用UV吸收法测得的共轭酸总量(大约40％)大体一致。
2、试验动物和试验饲料用基础饲料(F-2，船桥农场株式会社)对7周龄的Sprague-Daeley系雄性大鼠进行一周预备饲养后，划分成三个区，使每区内7只试验鼠的平均体重相等，作7周饲养。饲养环境调节到温度22～24℃，湿度50～60％，明暗周期(明期8:00～20:00；暗期20:00～8:00)各为12小时。饲料限制供给，每周测定体重。
试验用饲料的基本组成示于表1之中。使蛋白质和糖等成份同一，将各区的脂肪物质均调节到10％。也就是说，作为必须的脂肪酸用的饲料调制如下各试验区使用含1％亚麻酸乙酯的，对照猪油区使用含9％猪油的，金枪鱼精制TG区使用含2％金枪鱼精制TG(其余的7％是猪油)的，共轭酸区使用含2％金枪鱼精制TG(其余的7％是猪油)的共轭异构化物的。
表1
*1:Qriental酵母工业社制*2金枪鱼精制TG共轭异构化3、动物处理方法及分析方法经过7周饲养后，使之绝食20小时，在乙醚麻醉下切开腑部，从大静脉放血杀死。接着取出肠道粘膜脂肪、肾四周脂肪、精巢四周脂肪及肩甲骨之间的褐色脂肪称重。褐色脂肪供UCP量测定。用常法从血液中得到血浆，用和光纯药工业株式会社制的临床检查用试剂，测定血清中的甘油三酸酯、胆固醇和磷脂浓度。采用以下记载的方法进行UCP量测定。
UCP蛋白质的萃取操作用300mM蔗糖(含有10mM Tris-HCl,pH7.5，和2mM EDTA)将从试验鼠肩甲骨之间摘出的BAT均化，使用冷却台式离心机以3100转/分钟速度于4℃下离心5分钟后，再将其上清液以12000转/分钟速度于4℃下离心10分钟。以得到的沉淀(线粒体级份)作样品。
电泳和蛋白质印迹聚丙烯酰胺凝胶电泳，在11％分离凝胶上进行，将与各泳道相当的50微克样品蛋白质共分析用。电泳条件100V下电泳10中，然后在200V下电泳1小时。向膜(Hybond-C，アマ一シヤム公司制造)转移过程，以半干方式在135mA(2.5mA/厘米2)下进行30分钟。进而，使膜与兔对鼠UCP的抗体(一次抗体，稀释3000倍)反应后，洗涤干净，使之再与兔IgG-过氧化物酶标识(二次抗体)反应。洗净后，用化学发光法检出试剂(杜邦公司出品)和X-射线胶卷检出UCP区域。用扫描仪读取胶卷上区域的深浅，在计算机上将其数字化。
4、结果以仅对照UCP的猪油区为100，其他各试验区的测定值列于表2之中。尽管饲料摄取量在各试验区没有差别，但是就饲养后的体重而言，金枪鱼精制TG区和共轭酸(金枪鱼精制TG的共轭异构体)与猪油对照区相比，显著降低。饲养期间在各试验区也没能看到软便和下泻等症状，而且粪便数量也没有发现差别。
与猪油对照区相比，UCP量在金枪鱼精制TG区增加约1.5倍，在共轭酸区增加约2.0倍。而且与猪油对照区相比，肠道粘膜脂肪，以及肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪合剂形成的的腹腔内脂肪总量，在体重中所说的相当的比例，共轭酸区显著减少，而在金枪鱼精制TG区也能发现减少的趋势。此外，就甘油三酸酯等血浆脂肪浓度而言，与猪油对照区相比，在共轭酸区和金枪鱼精制TG区都有显著降低的趋势。
在DHA含量高的金枪鱼精制TG(共轭酸含量为3.3％)中，BAT中UCP表达增加，可以发现具有抑制内脏脂肪蓄积的作用，以此为原料制备的共轭异构化油，显著发现这种作用的事实是明确的。
表2
注数值表示平均值±标准偏差腹腔内脂肪合计指肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪的总量UCP以猪油对照区为100时的相对值共轭酸组金枪鱼精制TG的共轭异构体无共同符号的文字间有显著性差异(p＜0.05)*p＜0.01
为了查明，实施例1中阐明的事实，即含共轭异构化HUFA的鱼油引发的nST功能亢进，是否是由UCP小类中任何物质的发现亢进造成的，用河田等人的Northern印迹解析法，对容易引起饵料诱发性肥胖的C57BL系试验鼠投予与实施例1相同的共轭异构化鱼油后产生的UCP同族体各小类的基因浓度，进行了定量测定(Biochem.J.293,807-812(1993))。
试验鼠的饲养条件和饵料条件记载在表3之中。
饲养条件将8周龄的C57BL/6系试验鼠(雄性)分为三组，每组8只，经一周基础饲料预饲养后，进行5周试验饲养(pair-feedihg)至14周龄。
饵料条件以仅含油酸的饵料作为控制饵料(低脂肪饵料)，再添加猪油、共轭异构化鱼油制成猪油饵料和共轭异构化鱼油饵料(高脂肪饵料)。
表3饲料组成
体重和脂肪蓄积量等的测定结果总结在表4中。结果表明，肾周围、副睾和肠道粘膜脂肪组织的重量，与猪油饵料相比，喂食共轭异构化鱼油饵料后显著性降低。而且意味深长的是，这种共轭异构化鱼油的效果，与低脂肪食品(重量比2％)匹敌。此外，为了解吸这种共轭异构化鱼油效果的机理，比较研究了BAT内UCP族中各小类(UCP-1、-2、-3)mRNA表达量。其中使用GAPDH作为mRNA分析用内标基因。附
图1表明，共轭异构化鱼油中UCP-2基因的表达量显著增大。以前认为，UCP发现的增大由支配交感神经末梢分泌的去甲肾上腺素控制，这主要使UCP-1增加。如上所述，本试验中查明，共轭异构化鱼油使UCP-2基因产生特异性增强，因而可以推知共轭异构化鱼油使BAT功能产生的亢进作用，不是通过交感神经系统，而是共轭异构化鱼油成份对BAT直接作用的结果。
UCP-2与UCP-1不同，不仅在BAT中，而且在WAT和骨骼肌等nST的主要组织中广泛分布，所以共轭异构HUFA衍生物(鱼油)对于人体抗肥胖来说是极为有效的物质。
表4油脂对试验鼠脂肪组织重量和体重的影响
注数值表示平均值±标准偏差(8只)同一行的数值中不同上标符号间显著性差异(p＜0.01)
培养后用2N盐酸将反应液调成酸性，正己烷萃取。萃取物水洗后脱水，接着在减压下尽可能完全地馏去溶剂。将得到的浓缩液(反应生成物)供入硅酸色谱柱中，制备共轭异构化DHA甘油三酸酯。
其中，硅酸柱中的溶剂使用正己烷、含有5％乙醚的正己烷和含有20％乙醚的正己烷，回收20％乙醚级分。用这种操作得到的共轭异构DHA乙酯的收率是49％。
(2)共轭异构DHA乙酯的定量测定采用与实施例1同样的标准方法，测定了上述操作得到的乙酯中共轭异构酸的含量。
查明了原料DHA乙酯及其异构乙酯、各种共轭异构酸的含量，在原料DHA乙酯中，共轭二烯、共轭三烯和共轭四烯含量均为0％，另一方面异构酯中，共轭二烯含量为83.0％，共轭三烯含量为9.7％，共轭四烯含量为7.0％，DHA总量(99％强)均被共轭异构化。
其中，对原料DHA乙酯及其共轭异构DHA乙酯进行反相HPLC(柱ODS(野村科学，DevelosilODS-UG-5))分析后查明，DHA乙酯的脂肪酸是DHA，乙酯异构体中仅仅检出了单峰，证明DHA乙酯中的DHA几乎完全被共轭异构化。此外，与UV吸收法测定共轭酸量的结果(大约100％)一致。
2、试验动物和试验饲料1)试验动物及其饲养方法与实施例1相同。
2)试验饲料除了在0.5％原料DHA乙酯中加入8.5％猪油作为对照区，以及在0.5％共轭DHA乙酯中加入8.5％猪油作为共轭DHA乙酯区之外，按照实施例1进行。
3、动物处理方法及分析方法经过7周饲养后，绝食20小时，在乙醚麻醉下切开腑部，从大静脉放血杀死。接着取出肠道粘膜脂肪、肾四周脂肪、精巢四周脂肪及肩甲骨之间的褐色脂肪称重。褐色脂肪供UCP量测定。
UCP量的测定与实施例1同样进行。
4、结果UCP以对照区为100，其他试验区的测定值列于表5。尽管饲料摄取量在各试验区间没有差别，但是就饲养后的体重而言，与对照区相比，共轭酸(DHA乙酯的共轭异构体)区显著降低。饲养期间各试验区也没看到软便和下泻等症状，粪便量也没发现不同。
与对照区相比，UCP量在共轭异构DHA乙酯区增加约1.8倍。而且与对照区相比，肠道粘膜脂肪，以及肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪总量的腹腔内脂肪总量在体重中相当的比例，共轭酸乙酯区显著减少，共轭异构DHA乙酯使UCP表达量增大，对腹腔内脂肪显示减肥功能，能够抑制肠道粘膜脂肪蓄积和减少肠道粘膜脂肪蓄积。
表5
注数值表示平均值±标准偏差腹腔内脂肪合计指肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪的总量UCP表示以对照区为100时的相对值无共同符号的文字间有显著性差异(p＜0.05)*p＜0.01
将北海道秋产大马哈鱼(Oncorhynchus keta)的新鲜白子(精巢)冷冻干燥，用混合机充分粉碎后，浸渍在乙醇中摇荡，滤出不溶物，得到乙醇萃取液。
用蒸发器从萃取液中蒸馏除去乙醇，得到油状脂肪级分(收率2.5％)。将此油状物倒入硅酸色谱柱中，与实施例1同样操作，分离出F酸甘油三酸酯级分。
按照常法用酸触媒将该级分乙酯化，使之通过上述色谱柱制成精制酯。将该酯溶解在乙腈中，按照太田等人的方法(Chromatography15,No.4,250-253(1994))供入反相HPLC(柱Zorbax ODS，野村科学出品)分离，得到F酸乙酯混合物。为了便于分析和其他目的，将F酸甘油三酸酯按照常法甲酯化，并且用太田等人的方法鉴定F酸。
结果查明，该乙酯的呋喃酸组成，按化学式1和表6中呋喃型脂肪酸结构，其中F6为59％,F4为20％,F5为13％,F2为6％,F8为2％。
化学式1
表6呋喃型脂肪酸的结构
(2)F酸自氧化产物的生成及其结构人们知道，F酸甲酯容易遭受自身氧化，经过dioxo-enoate，转变成不饱和F酸甲酯(G.Rosenblat等人，J.Am.Oil.Chem.Soc.70,501-505(1993))。
采用Rosenblat等人的方法对该F酸乙酯进行分析的结果说明，其中含有约8％的类似自氧化产物。
2、试验动物和试验饲料1)试验动物及其饲养方法与实施例1同样实施。
2)试验饲料除了在0.5％F酸乙酯中加入8.5％猪油作为F酸乙酯区之外，按照
3、动物处理方法及分析方法与实施例3同样进行。
4、结果UCP以对照区为100，其他试验区的测定值列于表7。尽管饲料摄取量在各试验区没有差别，但是就饲养后的体重而言，与对照区相比，F酸乙酯区显著降低。
饲养期间各试验区也没看到软便和下泻等症状，粪便量也没发现不同。
与对照区相比，UCP表达量在F酸乙酯区增加3倍弱。与对照区相比，肠道粘膜脂肪以及腹腔内脂肪(肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪总量)的在体重中所相当的比例，F酸乙酯区显著减少，这表明F酸乙酯通过使UCP表达量增大，使腹腔内脂肪降低功能，以及抑制肠道粘膜脂肪蓄积和减少肠道粘膜脂肪蓄积的功能亢进。
表7
注数值表示平均值±标准偏差腹腔内脂肪合计肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪的总量UCP表示以对照猪油区为100时的相对值无共同符号的文字间有显著性差异(p＜0.05)*p＜0.01
(2)二十碳五烯酸(EPA)乙酯共轭异构体的制备和分析按照实施例3的方法，由EPA乙酯(Sigma公司出品)制备了其共轭异构体。利用UV吸收法和HPLC分析法证明几乎完全被共轭异构化。
2、试验动物和试验饲料1)试验动物及其饲养方法与实施例1同样实施。
2)试验饲料除了在1.0％α-亚麻酸乙酯中加入8％猪油作为ALA乙酯区，以及在1.0％共轭EPA乙酯中加入8％猪油作为共轭EPA乙酯区之外，其余按照实施例1进行。
3、动物处理方法及分析方法与实施例3同样进行。
4、结果UCP以猪油对照区为100，其他试验区的测定值列于表8。尽管饲料摄取量在各试验区没有差别，但是饲养后的体重，与对照区相比，共轭ALA乙酯区和共轭EPA乙酯区都显著减小。
饲养期间各试验区也没看到软便和下泻等症状，粪便量也没发现不同。
与对照区相比，UCP表达量在ALA乙酯区增加约1.7倍，在共轭EPA乙酯区增加约2.4倍。而且两个共轭酸区与猪油区相比，肠道粘膜脂肪，以及肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪合计组成的腹腔内脂肪在体重中相当的比例均显著减少。这表明α-亚麻酸乙酯和EPA乙酯各自的共轭异构体，均具有使包括肠道粘膜脂肪在内的腹腔内脂肪的蓄积得到抑制的功能。
表8
注数值表示平均值±标准偏差腹腔内脂肪合计肠道粘膜脂肪、精巢周围脂肪和肾周围脂肪的总量UCP表示以对照猪油区为100时的相对值无共同符号的文字间有显著性差异(p＜0.05)产业上利用的可能性本发明得到的上述物质，具有使包括人在内哺乳动物和鸟类生物体组织的细胞内，作为nST主要组织的骨骼肌、WAT和BAT等的，例如含有BA、线粒体的细胞及WA等MC的脱共轭呼吸乃至MC内膜的质子泄漏产生特异性亢进的作用。本发明可以提供作为有效成份含有该物质的、抗肥胖(抑制内脏脂肪(特别是肠道粘膜脂肪)蓄积)和抗内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积的降脂肪剂，作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪(特别是肠道粘膜脂肪)蓄积)和内脏(特别是肠道粘膜)蓄积脂肪减少功能的食品(功能食品)，以及作为有效成份含有该物质并赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪(特别是肠道粘膜脂肪)蓄积)和内脏(特别是肠道粘膜)蓄积脂肪减少功能的饲料。
权利要求
1.一种含有共轭异构化高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质，其中所说的物质能使包括人在内的哺乳动物及鸟类的非寒栗热产生(nonshivering thermogenesis；nST)主要组织、骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中的质子泄漏(Proton leak)产生特异性亢进作用。
2.按照权利要求1所述的物质，其中具有上述作用的成份是共轭异构化高度不饱和脂肪酸(HUFA)类。
3.按照权利要求1所述的物质，其中具有上述作用的成份是HUFA衍生物氧化生成物的呋喃HUFA衍生物。
4.按照权利要求1、2或3任一项所述的物质，其中所说的物质能使作为主要nST组织的骨骼肌、白色脂肪组织、褐色脂肪组织等含线粒体的细胞产生特异作用，具有使该细胞中脱共轭蛋白同族体(UCPhomologue)的表达量显著增大的作用。
5.一种抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积的降脂肪剂，作为有效成份其中含有权利要求1、2或3任一项所述的物质，所说的物质能使作为nST的主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏产生特异亢进作用。
6.一种赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的食品，作为有效成份其中含有权利要求1、2或3任一项中所述的物质，所说的物质能使作为nST主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Proton leak)产生特异亢进作用。
7.一种赋予抗肥胖(抑制内脏脂肪，特别是肠道粘膜脂肪蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积功能的饲料，作为有效成份其中含有权利要求1、2或3任一项中所述的物质，所说的物质能使作为nST主要组织的骨骼肌、WAT、BAT等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏产生特异亢进作用。
全文摘要
本发明涉及含有共轭异构化的高度不饱和脂肪酸类和/或其衍生物的物质,其中含有能使作为包括人在内哺乳动物及鸟类产生非寒栗热(nonshivering thermogenesis)的主要组织的骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)等细胞中线粒体(MC)的脱共轭呼吸乃至内膜中质子泄漏(Protonleak)产生特异亢进作用的共轭异构化高度不饱和脂肪酸及其衍生物的物质,作为有效成份含有上述物质的抗肥胖(抑制内脏脂肪,特别是肠道粘膜脂肪的蓄积)和减少内脏(特别是肠道粘膜)脂肪蓄积的降脂肪剂,食品,以及饲料。
文档编号A61K31/20GK1315859SQ99810428
公开日2001年10月3日 申请日期1999年9月1日 优先权日1998年9月1日
发明者名达义刚, 古贺宪治, 水野雅之 申请人:Jan食品和饲料技术公司