专利名称：肝实质细胞增殖因子药用制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病的药用制剂，其有效成分为肝实质细胞增殖因子(HGF)。具体地说，涉及一种肌肉内用药制剂，其中该制剂用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病、在患部及其周围肌肉局部给药。
背景技术：
肝实质细胞增殖因子(HGF)作为对于成熟肝细胞的强力增殖促进因子被发现，是一种基因克隆蛋白质(Biochem Biophys ResCommun,122,1450(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6489,(1986)、FEBS Letter,22,231(1987)、Nature,342,440(1989)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,3200,(1991))。通过其后的研究证实，在in vivo,HGF不仅作为肝再生因子在肝脏修复再生中起作用，它还具有血管新生作用，在缺血性疾病和动脉疾病的治疗或预防中，起着重要的作用(Symp.Soc.Exp.Biol.,47cell behavior,227-234(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.90,1937-1941(1993),Circulation,97,381-390(1998))。据报道，兔下肢缺血模型给药时，发现HGF有显著的血管新生作用，具有血流量改善、抑制血压降低、缺血症状改善的效果。根据这些报道，认为HGF作为血管新生因子之一被发现、并发挥作用。
据此，HGF具有以血管新生因子的功能为主的各种功能，为使之作为医药品发挥作用，人们进行了各种尝试。可是，在此成为问题的是HGF在血中的半衰期。HGF的半衰期短、约10分钟，很难维持血药浓度，另外，有效量HGF向患部的转运也成为问题。
一般来说，蛋白性制剂多采用静脉内给药，例如，对于上述缺血性疾病模型，HGF也有在静脉和动脉内给药的例子(Circulation,97,381-390(1998))。这种动物模型，通过静脉或动脉内给药，对于缺血性疾病或动脉疾病HGF的有效性尽管已被证明，但是具体有效的给药方法及给药量尚无定论。特别是HGF，既存在上述半衰期的问题、在患部的转运问题，并且关于HGF的有效给药方法或给药量等，还没有结论。
本发明的目的在于提供用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病的药用制剂，其中该制剂含有有效成分HGF。具体地说，涉及一种肌肉内用药制剂，其中该制剂用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病，在患部及其周围肌肉局部给药。本发明的肌肉内用药制剂，例如直接给药到受损部位的心脏、四肢缺血部位的肌肉内，给药后的HGF的利用效率非常大、与静脉内给药相比，能够减少用药量。进而，由于从给药部位的肌肉向除去血液、给药部位的肌肉组织及其周围组织外的全身的转运、分布、作用少，所以能够减轻对其他部位的作用，具有选择性更高的效果。
针对将HGF适用于缺血性疾病或动脉疾病过程中，本发明者对于给药量、给药方法进行了锐意研究。对于上述疾病的HGF给药方法，设定为静脉内团块给药、静脉内连续给药、皮下给药、腹腔内给药、肌肉内给药等，对此进行了研究。
如前所记，通常蛋白性制剂多为静脉内给药，加之缺血性疾病及动脉疾病是血管损伤，所以从血管内侧使药剂发挥作用有效。因此，对于缺血性疾病模型和动脉疾病模型，几乎所有的HGF用药例都是从静脉或动脉内给药，关于HGF的肌肉内给药，包括文献在内无任何资料，而且未发现有关HGF药代动力学的报道。这样，对于缺血性疾病模型和动脉疾病模型，没有进行肌肉内用药的报道，因此HGF的肌肉内用药是否有效，迄今完全未知。
本发明者使用大鼠，比较研究了在下肢缺血部位进行肌肉内用药的药动学和其他用药途径(静脉内给药)的药动学。结果表明与静脉内给药相比，在肌肉内给药时，所投与的HGF在给药部位维持很高的浓度、在血清及肝、肾的转运低。另外，HGF在皮下给药时，与肌肉内给药一样，也能在给药部位维持高HGF浓度、从给药部位向循环血中的转移率低。
一方面，在静脉内给予HGF的情况下，与血中维持高HGF浓度相反，在肌肉内的HGF浓度却很低。由此，初次阐明如果想要HGF在缺血患部及其周围肌肉或存在于这些地方的血管发挥作用的话，静脉内给药的效果很差、而直接给药到患部或其周围肌肉有效。
另外，在比较HGF的肌肉内给药与静脉内团块给药时发现肌肉内给药时，血液、肝脏及肾赃的最大药物浓度是静脉内团块给药的1/100以下，更确切地说是1/1000以下。进一步发现，在肌肉内给药时，给药部位的肌肉组织内浓度是静脉内团块给药的50倍以上，更确切地说是200倍以上。
进而，在肌肉内给药和静脉内团块给药两种情况下，比较其血液、肝脏及肾赃中的AUC时发现在肌肉内给药时，血液、肝脏及肾赃中的AUC是静脉内团块给药时的1/5以下，更确切地说是1/10以下。
进一步发现给药部位肌肉组织内的AUC，在肌肉内给药时，是静脉内团块给药时的50倍以上，更确切地说是200倍以上。
由上可知，通过肌内给药，能维持HGF在给药患部的高浓度，其次，就肌肉组织内的HGF向患部组织和血管的转运、是否能真正发挥HGF的作用进行了研究。即，以是否能发现c-Met的磷酸化作为指标，确认了HGF的功能。其中，c-Met为HGF的受体。结果表明，在大鼠肌内给予30-3000μg/kgHGF时，在肌肉组织，c-Met的Tyr残基受到磷酸化、被激活，但是在肝脏和肾脏组织，与未处理动物相比，其c-Met完全没有被激活。该结果意味着HGF在给药的肌肉组织发挥了作用、在肝脏和肾脏未显示作用。
如上所述，由于HGF的作用得到确认后，本发明人为探讨HGF肌肉内给药的有效性，使用闭塞性动脉硬化症(ASO)的动物模型，进行了研究。即，用大鼠下肢缺血模型，探讨了在进行上述肌肉内给药后，下肢缺血障碍得到多大程度的改善。作为研究方法用自动测温仪测定下肢皮肤温度，以抑制皮肤表面温度的降低为指标，确认肌内给药的效果。结果发现通过肌肉内给药，缺血下肢的皮肤表面温度的降低受到抑制。该结果显示，由于HGF所具有的血管新生作用，缺血下肢的血行状况得到改善、温度的降低受到抑制。
根据以上试验，对于ASO模型，HGF在肌内给药时的有效性初次得到证实。
进而，本发明人用大鼠下肢缺血ASO模型及兔下肢缺血ASO模型，在进行上述肌内给药后，测定了I/N比值(％)(缺血肢体血压/正常肢体血压×100)。结果证明，在低给药量、低给药次数情况下，I/N比值的改善有显著性差异。该结果显示，由于HGF具有的血管新生作用，缺血肢体的血行动态得到改善。进而，在兔模型还进行了血管造影，在给予HGF的动物群，血管造影斑点的增加率升高，具有显著性差异。该结果显示由于HGF的作用，促进了侧副血行通路的发达。另外，对缺血肢关节的硬化度、缺血肢肢端的坏死。脱落及缺血肢下腿部溃疡的有无进行研究时证实，通过HGF的肌内给药，以上各项有改善趋势。
通过以上研究证实，对于缺血性疾病，HGF的肌内给药非常有效。
在上述实验结果中，用自动测温仪，有效性能得到确认，意味着对临床上ASO患者、特别是从轻症阶段，有缺血下肢冷感这种自觉症状的患者，HGF的肌内给药有效，加上I/N比值和血管造影的恢复促进作用、又进一步确认了缺血肢体症状的减轻等改善效果，这显示从初期ASO患者到严重ASO患者，通过HGF的肌内给药的治疗是有效的。在发展到因缺血必须截去下肢的严重ASO之前，使ASO能够在轻症阶段得到治疗成为可能，因此，对于众多的尚无有效治疗方法的轻度ASO患者来说，本发明的肌内用药制剂能够提供划时代的治疗方法，其中该治疗方法能抑制、改善和恢复症状的发展。而且，能够提供一种医药品，其中该药品在低给药量有效，而且与静脉给药时相比，在患部以外的部位作用少。
另外还证明，为了更大地发挥上述HGF的效果，理想的制剂为不含硫酸软骨素等构成细胞外基质的蛋白聚糖以及含这些成分的蛋白载体。即，以胶原为基质制成小丸，在探讨硫酸软骨素的配伍对于从小丸中释放HGF的影响时，得到如下结论，与不配伍硫酸软骨素而配伍了丙氨酸的含HGF小丸相比较，在配伍了硫酸软骨素的含HGF小丸中，HGF释放的快。这表明，不配伍硫酸软骨素等构成细胞外基质的蛋白聚糖的HGF制剂，HGF的释放慢。该现这意味着如上述那样，不合硫酸软骨素等构成细胞外基质的蛋白聚糖的HGF制剂，在给药局部组织中易于保持，能够抑制其经血液向全身其他脏器的转运、分布。
发明公开本发明是基于上述发现完成的。即、本发明涉及(1)一种制剂，该制剂的有效成分为HGF、使有效量的该因子向给药部位的组织及其周围组织转运、分布、发挥作用，并且能够减少在给药部位以外的血液及全身组织的转运、分布、作用。
(2)上述(1)记载的制剂，该制剂用于治疗或预防缺血疾病或动脉疾病。
(3)上述(1)或(2)记载的肌肉内给药制剂，其中给药部位为肌肉。
(4)上述(1)或(2)记载的肌肉内给药制剂、外用制剂或湿布剂，其给药部位为皮下或表皮。
(5)上述(3)记载的肌肉内给药制剂，其给药部位为骨骼肌或心肌。
(6)上述(1)、(2)、(3)或(5)记载的制剂、其特征在于在给药部位的肌肉组织的转运、分布、作用要远远超过在血液、肝脏及肾脏的转运、分布、作用。
(7)上述(1)、(2)、(3)、(5)或(6)记载的肌肉内给药制剂、其特征在于与静脉内团块给予同等剂量的、含有有效成分HGF的制剂时相比，在血液、肝脏及肾脏的最大浓度为1/100以下，给药部位的肌肉组织内浓度为50倍以上。
(8)上述(1)、(2)、(3)、(5)或(6)记载的肌肉内给药制剂、其特征在于与静脉内团块给予同等剂量的、含有有效成分HGF的制剂时相比，在血液、肝脏及肾脏的AUC为1/5以下，在给药部位的肌肉组织内AUC为50倍以上。
(9)上述(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(7)或(8)记载的肌肉内给药制剂、该制剂用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病。
(10)上述(9)记载的肌肉内给药制剂、用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病、给药部位是患部及其周围肌肉局部。
(11)上述(1)、(2)、(3)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)或(10)记载的肌肉内给药制剂、其特征在于一次给药量为0.01～500μg/kg。
(12)上述(11)记载的肌肉内给药制剂、其特征在于一次给药量为0.1～10μg/kg。
(13)上述(1)～(12)中任意一项记载的制剂，其中动脉疾病为闭塞性动脉硬化症。
(14)上述(1)～(12)中任意一项记载的制剂，其中缺血性疾病为缺血性心脏疾病。
(15)上述(1)～(14)中任意一项记载的制剂，其特征在于含有有效成分HGF，并且不含有结合、吸附HGF的物质。
附图简述
图1显示的是在大鼠大腿后部肌肉内给予HGF后、肌肉中的浓度变化。
图2显示的是在大鼠大腿部肌肉内给予HGF后，血清中的浓度变化。
图3显示的是在大鼠大腿部肌肉内给予HGF后，肝脏中的浓度变化。
图4显示的是在大鼠大腿部肌肉内给予HGF后，肾脏中的浓度变化。
图5显示的是HGF对大鼠下肢缺血模型皮肤表面温度的改善效果。
图6显示的是HGF从含HGF胶原(collagen millipellet)小丸中的释放。
图7显示的是在大鼠大腿部肌肉内给予HGF后，肌肉、肝脏、肾脏内c-Met的磷酸化。
图8显示的是在兔下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF后，I/N比值(％)(缺血肢体血压/正常肢体血压×100)的测定结果。
图9显示的是在兔下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF后，下肢血压I/N比值(％)变化的测定结果。
图10显示的是在兔下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF后，下肢血压I/N比值(％)变化的测定结果。
图11显示的是在兔下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF后，血管造影斑点增加率的测定结果。
图12显示的是在大鼠下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF(1μg/kg×2次给药)后、I/N比值的测定结果。
图13显示的是在大鼠下肢缺血ASO模型的肌肉内给予HGF(3μg/kg×单次给药)、I/N比值的测定结果。
实施发明的最佳形态在本发明中使用的HGF是众所周知的物质，只要能精制成作为医药品能使用的程度，能够使用用各种方法制成的该物质，另外，也可以使用市售的产品(例如，东洋纺株式会社，Code No.HGF-101等)。作为HGF的制备方法，例如培养能产生HGF的第一代培养细胞和株化细胞、从培养上清液等进行分离纯化，能够得到该HGF。或者利用遗传工程的方法，将编码HGF的基因组入合适的媒体，将此插入适当的宿主内进行转化，从该转化体的培养上清液能够得到目的物重组HGF。(如参照Nature,342,400(1989)、日本特开平5-111383号公报、Biochem.Biophys.Res.Commun.163,967(1989)等)。对上述宿主细胞不加特殊限定，以前在生物工程方法中被使用的各种宿主细胞，例如大肠菌，酵母或动物细胞等都能够使用。由此得到的HGF与天然型HGF有基本相同的作用，即便其氨基酸序列中的1个或数个氨基酸被置换、缺失及/或添加也可以，同样糖甙被置换、缺失及/或添加也可以。
本发明的含HGF的制剂的特征在于使有效量的该因子转运、分布、作用于给药部位局部的组织及其周围组织，并且能够减少在给药部位以外的血液及全身组织中的转运、分布、作用。
作为具体的适应疾病，例如可举出称为缺血性疾病或动脉疾病、目前为止HGF的药效得到确认的所有循环系统疾病。即，作为心脏疾病可举出缺血性心脏病，心肌梗塞，急性心肌梗塞，心肌症，心绞痛、不稳定心绞痛、冠状动脉硬化、心功能不全等。作为四肢缺血性疾病可举出闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎、血管损伤、动脉栓塞症，动脉血栓症，脏器动脉闭塞、动脉瘤等。
作为给药方法，只要能满足下述条件，任何给药方法都可以。即，如上所述，能使有效量的HGF转运、分布、作用于给药部位局部的组织及其周围组织，并且能够减少该成分在给药部位以外的血液及全身组织中的转运、分布、作用。具体可举出肌肉内给药(骨骼肌、心肌)、皮下或表皮给药。作为给药剂型，例如可举出注射用水制剂或油性制剂、软膏剂、霜剂、洗剂、气雾剂、湿布剂等。进一步制成缓释性小丸制剂，埋置于患部附近，或使用渗选泵等，在患部连续缓慢给药也是可能的。这些制剂可使用迄今周知的技术制剂，对于有性成分HGF，也可以根据需要添加pH调整试剂、缓冲试剂、稳定剂、防腐剂、或增溶剂等。
这种情况下，本发明的含HGF制剂，理想为不合在HGF上结合、吸附的物质。即、在本发明中，不配伍硫酸软骨素等细胞外基质构成成分的HGF制剂，与配伍了上述物质的制剂相比，具有HGF从给药部位释放慢的特点。因此，能够抑制HGF从给药局部向血液、其它脏器的大量转运。另外，与硫酸软骨素一样，由于配伍细胞外基质构成成分的肝素，血中的清除率受到抑制(Hepatology,20,417,(1994)),而本发明的制剂因不含细胞外基质构成成分、所以不会抑制HGF向血中转运的清除率。因此，认为能够进一步抑制向其它脏器的转运性及反应性，提高在给药部位肌肉的有效性。
在此，作为结合、吸附HGF的物质，例如可举出糖、糖蛋白、糖脂质、复合糖等细胞外基质(基质)构成成分。更具体地举出硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、肝素、肝素样物质等。含硫酸基的糖、糖蛋白、糖脂质、复合糖等，吸附、结合于HGF上的物质也同样是这类物质。另外，并不限于机体构成成分，由于含有上述糖、糖蛋白、糖脂质、复合糖的一部分，也同样是吸附、结合于HGF上的物质。作为吸附、结合于HGF上的物质，也包含在蛋白制剂中使用的蛋白质、糖蛋白质等蛋白载体或在这些载体中含有的吸附、结合于HGF上的物质。作为吸附·结合HGF的物质，在蛋白制造中使用的蛋白质、糖蛋白等的蛋白载体或含在这些物质中在HGF上吸附、结合的物质也包括在该范畴。作为本发明含HGF的制剂，理想为不含上述物质的制剂，其中这些物质能吸附、结合在HGF上。
另外，在蛋白制剂中，由于pH值和离子强度、离子浓度等条件的不同，或化学修饰等，蛋白质的重合比例等物性有所差异。认为这种蛋白质物性的差异也影响到本发明药用制剂在肌肉等的给药组织的保持、向血中的转运。
如下述实施例所示，本发明的药用制剂用药量少也是其特征之一。作为给药剂量，根据患者的症状、年龄、性别等有所差异，例如在成人患者的患部或其周围肌肉组织内给药时，可举出如下的给药量。
即、1〕在本实施例，给药量为1μg/kg时有效性得到确认2〕将在本实施例确认的大鼠有效给药量(单位体重)换算成单位体表面积的给药量，推定人的有效给药量，考虑为0.2μg/kg程度，及3)在反复考虑本领域技术人员的技术常识、等，作为本发明制剂的给药量，可举例为至少在500μg/kg/次以下，更具体为0.01-500μg/kg/次，理想为0.1～10μg/kg/次的程度。另外，作为给药期间·给药频率，可例举为给药期间最长为3个月以内、一周1～2次的给药频率，理想为1周以内的给药期间，每周7次以下的给药频率。最理想为1周以内的给药期间，1次或2次的给药频率。
在适用本发明药用制剂的患者，作为给药部位的确定及给药方法，可例举如下。例如，在闭塞性动脉硬化症的缺血肢的诊断时，安静时的疼痛、间歇性跛行、有无溃疡、用トレツドミ时可步行距离的测定，用多普勒血流计进行Ankle Pressure Index(上肢血压与腕血压之比)的测定，推断缺血肢、缺血区域。通过使用造影剂进行血管血管造影(Angiography)、Digital Subtraction Angiography,Magnetic Resonance Angiography等，详细确定血管狭窄、闭塞部位。关于肢体状态的判定，例如按照Society for VscularSurgery/North American and International Society forCardiovascular Surgery推荐的标准书进行。对于由血管造影确定的缺血部位的肌肉及其周围肌肉，按照其区域的大小分成1-20个地方、理想为3-6个地方，给予本发明的药用制剂。
进而，在上述治疗目的之外，本发明的肌肉内药用制剂也能够用于这些疾病的预防。
实施例以下，通过实施例具体说明本发明。但本发明丝毫不受这些实施例的限定。
实施例1根据给药途径比较HGF的药动学1．肌肉内给药时HGF药动学的探讨(1)方法用フィツシヤ-系大鼠，测定以0.3、1、3mg/kg肌肉内给予HGF时和以6、60、600μg/kg/hr,3小时静脉内连续给药时，血清、肝脏、肾脏、肌肉(给药部位及其对侧)中HGF的浓度。在乙醚麻醉下，在大鼠左大腿后部中央部分进行肌肉内给药。给药容量为1ml/kg，以含有0.3M NaCl,0.03％Tween80,5mg/ml L-丙氨酸的10mM枸橼酸缓冲液(pH5.5)作为溶剂。在给予HGF后，经过5分、30分、2小时、8小时、24小时，得到大鼠的血清、肝左侧叶、肾脏、肌肉(给药部位及其对侧)。从大鼠尾静脉进行静脉内连续给药，给药速度为0.07ml/hr。给药后开始后经过3小时以上，同样得到血清、肝左侧叶、肾脏、肌肉。血清及各脏器中人HGF浓度的测定，使用测定人HGF用ELISA试剂盒免疫化HGF EIA(特殊免疫研究所制)进行。脏器中的HGF用含有2M NaCl、1mM PMSF、1mM EDTA、0.1％Tween80的20mM Tris-HCl(pH7.5)作为提取液(肌肉12ml/g组织、肝脏，肾脏8ml/g组织)、用1分钟制匀浆后、在4℃、15,000rpm离心分离60分钟，用上述ELISA试剂盒测定提取液中的HGF量。测定时，所用的标准溶液采用未给予HGF的大鼠脏器，加入已知浓度的HGF，同样进行提取，该提取液用作标准溶液。另外，样品稀释液也使用同样配制的大鼠脏器提取液。其中所用脏器为未给予HGF的脏器。浓度变化的解析使用moment解析法。
(2)结果在大腿部肌肉内给予HGF后，肌肉内的HGF浓度变化见图1。尾静脉连续给予HGF后的结果也表示于图1。以6、60μg/kg/hr,3小时连续从尾静脉给予HGF时，肌肉内的浓度在测定限(1.5ng/g组织)以下。以3mg/kg肌肉内给药时，肌肉中的药动学参数列于表1。在给药部位肌肉内，HGF的t1/2是10.6小时，在给药24小时后，浓度还维持在峰浓度的约18％。尾静脉团块给予HGF时，在肌肉内检出的HGF浓度也是10ng/g组织的程度。其中，HGF的给药量为3mg/kg。
表1
另外，表1中的对侧指的是对应于给药部位的反对侧。即，在本例中，因为是在左大腿后部肌肉给药，因此，是其反对侧的大腿后部肌肉。
如上述图1及表1所示，肌肉内给予HGF时，在给药肌肉内显示很高的浓度。认为该浓度大大超过了HGF药效显示的浓度。一方面，在对侧肌肉内，只停留于给药部位浓度的约1/1000。如图2所示，肌肉内给予HGF时，血清中HGF在较低浓度变化，从给药肌肉向循环血中的转移率低，仅为6.7％。另外如图3、4所示，肌肉内给予HGF时，肝脏、肾脏中的HGF浓度与静脉内给药时相比极低。静脉内连续给予HGF后，血清、肝脏、肾脏内HGF的浓度结果也表示于图2、3、4。
静脉内连续给予HGF时，相对于血清、肝脏、肾脏中维持高HGF浓度，肌肉内HGF的浓度极低。以最高给药量600μg/kg/hr组为例，相对于血清中536ng/ml的HGF浓度，肌肉中只有不足10ng/g组织。由此认为，以下列情况为给药目的时，静脉内给药的效率差，而在肌肉内直接给药的方法有效。即，使HGF选择性作用于缺血肌肉患部及其周围组织或分布于这些部位的血管。另外，认为通过肌肉内给予HGF，能够在其它部位不发挥作用，而选择性地作用于肌肉组织。
2据给药途径比较HGF血中浓度的变化(1)方法用フィツシヤ-系大鼠，测定以3mg/kg肌肉内给药和以0.3mg/kg静脉内团块给药及以3mg/kg皮下给药时，血清中HGF的浓度。在乙醚麻醉下，在大鼠左大腿后部中央部分进行肌肉内给药。给药容量为1ml/kg，用含有0.3M NaCl,0.03％Tween80,5mg/ml L-丙氨酸的10mM枸橼酸缓冲液(pH5.5)为载体。在肌肉内给药时，给药后经过5分、30分、2小时、8小时、24小时，采取大鼠血清。在大鼠尾静脉进行静脉内给药，给药后经过5分、15分、30分、1小时、2小时、3小时、12小时、24小时，采取大鼠血清。在皮下给药时，给药后经过5分、15分、30分、1小时、2小时、5小时、12小时、24小时，采取大鼠血清。大鼠血清中人HGF浓度的测定，使用测定人HGF用ELISA试剂盒-免疫化HGF EIA(特殊免疫研究所制)进行。浓度变化的解析使用moment解析法。
(2)结果解析测定结果得到的药动学参数见表1。不过，在静脉内团块给药时，假设对于给药量呈线性，计算出HGF给药量为3mg/kg时的参数。与静脉内团块给药时相比，在肌肉内给药、皮下给药时血清中药物的AUC低，分别为静脉内团块给药时AUC的6.7％、2.6％。另外，与静脉内团块给药时相比，在肌肉内给药、皮下给药时最高血药浓度(Cmax)也低，分别为静脉内团块给药时CO的0.012％、0.0087％。
表2
3 根据给药途径比较肌肉内HGF浓度的变化
(1)方法用SD系大鼠，测定以0.01mg/kg肌肉内给予HGF时及以30mg/kg静脉内团块给药时肌肉中HGF的浓度。在乙醚麻醉下，从大鼠左大腿后部中央部分进行肌肉内给药。给药容量为0.5ml/kg，用含有0.3MNaCl、0.03％Tween80、5mg/mlL-丙氨酸的10mM枸橼酸缓冲液(pH5.5)为载体。给予HGF后经过30分、6小时、24小时，得到大鼠的肌肉(给药部位)。静脉内团块给药从大鼠尾静脉进行，用药容量为1ml/kg，给药后经过5分、30分、1小时、24小时，同样采取肌肉。肌肉内人HGF浓度的测定使用测定人HGF用ELISA试剂盒免疫化HGF EIA(特殊免疫研究所制)进行。脏器内HGF的浓度，使用含有2M NaCl、1mM PMSF、1mM EDTA、0.1％Tween80的20mM Tris-HCl(pH7.5)作为提取液、脏器经1分钟制匀浆后、在4℃、15,000rpm离心分离60分钟，用上述ELISA试剂盒测定提取液中的HGF量。测定时，所用的标准溶液为在未给予HGF的大鼠肌肉加入已知浓度的HGF，使用同样提取溶液。另外，样品稀释液也使用同样配制的大鼠肌肉提取液。其中所用肌肉为未给予HGF的脏器。浓度变化的解析使用moment解析法。
(2)结果由肌肉内人HGF浓度的测定结果得到的药动学参数列于表3。其中，为了比较，关于静脉内团块给药，假定与给药量呈线性，计算出0.01mg/kg HGF给药时的参数。假定给予相同量的HGF时，在肌肉内给药(给药部位)时，其肌肉内AUC明显高于静脉内团块给药，约为静脉内团块给药时的650倍。而且，在肌肉内给药(给药部位)时，其最高肌肉内浓度(Cmax)明显高于静脉内团块给药，约为静脉内团块给药时的960倍。
表3
实施例2
对于大鼠下肢缺血ASO模型的肌肉内给药的药效探讨(1)方法使用SD系大鼠(9周龄、雄性)。腹腔内给予约50mg/kg的苯巴比妥(ダイナボツト社制造、ネンブタ-ル)，麻醉大鼠。结扎分支后，摘出左大腿动脉，制成大鼠下肢缺血模型。用乙醚麻醉大鼠，在左大腿内侧肌肉内给予HGF或溶媒。大腿动脉摘出后立即开始给药，给药量为1mg/kg/day、给药容量1ml/kg/day、1天1次，给药5天。溶媒使用0.3M NaCl,0.03％Tween80,5mg/ml丙氨酸，10mM枸橼酸钠缓冲液(pH5.5)。大腿动脉摘出14天后，大鼠经戊巴比妥麻醉，用脱毛软膏脱去下肢周围的毛后，用测温仪(日本アビオニクス社制)，同时测定两侧下肢6个部位的皮肤表明温度，这些部位是大腿下部内侧(图5的部位1)、下腿部内侧(部位2)、膝下腿外侧(部位3)、下腿前部外侧(部位4)、大腿下部外侧(部位5)、下腿部外侧(部位)。就各自的测定部位，由缺血肢温度减去正常肢温度，算出皮肤表面温度差。
(2)结果缺血肢温度与正常肢温度的皮肤表明温度差见图5。即，摘出大腿动脉，给予溶媒的动物组(图中、白色)，与正常肢相比，缺血肢的各部位温度低0.8-1.7℃。与此相反，在给予HGF的动物组(图中、黑色)，温度的降低被抑制到0.2-1.0℃。每个部位，分两组比较其温度的降低，发现在所有6个部位，给予HGF的组中，温度的降低有减小的趋势。并且，在下腿部内侧及大腿下部外侧两个部位，由于给予HGF，温度的降低受到抑制，具有显著性差异。
如上图5所示，在制成大鼠下肢缺血模型，缺血肢的大腿部肌肉内给予HGF时，缺血肢皮肤表面温度的降低受到抑制。认为这是由于HGF具有血管新生作用，从而使缺血肢的血行动态得到改善、温度的降低受到抑制。
实施例3在in vitro实验系，硫酸软骨素对于从含有HGF的小丸中释放HGF的影响(1)含10％丙氨酸的HGF小丸的制法
HGF的含量131.2μg/mg小丸将6.9ml含有65.3mg HGF的水溶液和4.4ml 1％丙氨酸水溶液和16ml蒸馏水以及16.7g 2％骨胶原糊(アテロコラ-ゲン)混合，冷冻干燥后，加少量蒸馏水使之润湿，黏合，成均一的混合液。将此物放入10ml的粉碎离心机内，在10,000g、60分钟离心脱气。将该物从器具中取出后，干燥，切断，得到每根含500μg HGF的棒状小丸(直径1.1mm，长4mm)。
(2)含10％硫酸软骨素的HGF小丸的制法HGF的含量132.8μg/mg小丸将6.9ml含有65.3mg HGF的水溶液和2.9ml 1.5％硫酸软骨素水溶液和17ml蒸馏水以及16.7g2％骨胶原糊混合，冷冻干燥后，加少量蒸馏水使之润湿，黏合，成均一的混合液。将此物放入10ml的粉碎离心机内，在10,000g、60分钟离心脱气。将该物从器具中取出后，干燥，切断，得到每根含500μg HGF的棒状小丸(直径0.9mm，长4mm)。
(2)in vitro释放实验使用含有0.3％Tween20的PBS(pH7.4)作为释放液。在37℃，将上述方法制成的小丸放入2ml释放液中，测定HGF的释放速度(n=2)。释放液中HGF的浓度用肝素亲和性层析法测定。
实验结果如图6所示。即、从含有硫酸软骨素的小丸中，1天后几乎100％的HGF释放出来，与此相反，在不合硫酸软骨素的含丙氨酸的小丸中，HGF缓慢释放。释放的HGF量，在释放开始第7天后也只停留于小丸中含量的30％。这表明，由于与HGF具有亲和性的硫酸软骨素等蛋白聚糖与HGF的共存，能促使HGF的释放。相反，不让HGF与硫酸软骨素等蛋白聚糖共存时，能够使其释放缓慢、使HGF在给药局部发挥作用。
实施例4大鼠肌肉内给予HGF后、各脏器c-Met的磷酸化(1)方法使用SD系大鼠(12周龄、雄性)，在肌肉内给药后，就肌肉、肝脏、肾脏c-Met的磷酸化进行了研究。在乙醚麻醉下，在大鼠左大腿后部肌肉内给予3、0.3、0.03mg/kg的HGF。给药5分、30分后，给大鼠脱血，摘出肌肉、肝脏、肾脏。在摘出的脏器内加入RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4),50mM NaCl,1％TritonX-100,5mMEDTA,10mM Na4P2O7,50mM NaF,1mM Na3VO4,0.4mM AEBSF,10μg/mlLeupeptin,10μg/ml Aprotinin,1μg/ml Pepstatin A)5(肌肉)或8(肝脏、肾脏)ml/g组织，用ポリトロン制成匀浆。然后，在4℃,16,000rpm，离心分离30分，除去沉淀。用RIPA缓冲液将含有10mg(肌肉)或5mg(肝脏、肾脏)蛋白稀释至1ml，加入50μl(约50％)蛋白G琼脂糖(Pharmacia社)，在4℃搅拌2小时。离心除去蛋白G琼脂糖，在上清液加1μg抗c-Met抗体(Senta Cruz社)，在4℃搅拌一晚上。再加入20μl蛋白G琼脂糖，在4℃搅拌2小时。离心除去上清液，用1mlRIPA缓冲液清洗蛋白G琼脂糖3次后，加2×上样浸冲液，100℃加热5分，用于7.5％SDS-PAGE。电泳后的蛋白通过电转录、使之结合于硝化纤维素滤膜上。滤膜在含有3％BSA的TBS-T(10mM Tris-HCl(7.6),150mM NaCl,0.05％Tween20)中，通过振荡，使之发生反应。用TBST轻轻洗净后，在含有1μg/ml的抗磷酸化酪氨酸抗体(Upstate Biotechnology社)的TBS-T中，室温下振荡1小时。进一步用TBS-T洗净后，在含有2000倍稀释的过氧化物酶标记抗小鼠Ig抗体(Amersham社)的TBS-T中，室温下振荡1小时。用TBS-T洗净后，用ECL Western blot(Amersham社)检出试剂，检出磷酸化c-Met。
滤膜在65.2mM Tris-HCl(pH6.7),100mM 2-巯基乙醇，2％SDS溶液中，60℃振荡30分，除去探针，用TBS-T洗净，在含有3％BSA的TBS-T中振荡，使之反应。用TBS-T轻轻洗净后，在含有0.5μg/ml的抗c-Met抗体的TBS-T中，室温下振荡1小时。进一步用TBS-T洗净后，在含有2000稀释过的氧化物酶标记抗兔Ig抗体(Amersham社)的TBS-T中，室温下振荡1小时。用TBS-T洗净后，用ECLWestern blot检出试剂，检出c-Met。
(2)结果对于磷酸化c-Met的IP-Western结果表示于图7。在0.03-3mg/kg的各给药量，发现在肌肉组织，e-Met的磷酸化显著。一方面，在肌肉内给予HGF时，肝脏及肾脏中未发现c-Met的磷酸化。这一结果显示，通过肌肉内给予HGF，能够使HGF在肝脏、肾脏不发挥作用、而选择性作用于肌肉组织、肌肉组织中的血管。
实施例5对于大鼠下肢缺血ASO模型的肌肉内给药的药效探讨(1)(1)方法使用SD系大鼠(14周龄、雄性)。腹腔内给予约50mg/kg的戊巴比妥，麻醉大鼠。结扎分支后，摘出左大腿动脉，制成大鼠下肢缺血模型(参照Cardiovascular Research,35,547-552(1997))。然后立即在左大腿内侧肌肉给予HGF或溶媒。给药量为100μg/kg、给药容量1ml/kg。4天后，在乙醚麻醉下，同样进行给药。溶媒使用0.3MNaCl,0.03％Tween80,5mg/ml丙氨酸，10mM枸橼酸钠缓冲液(pH5.5)。大腿动脉摘出14天后，大鼠经戊巴比妥麻醉，用实验动物用非观血式血压计测定下肢血压。从正常肢、缺血肢各自的血压计算I/N比值(％)=缺血肢血压/正常肢血压×100，进行评价。
(2)结果结果见图8。与溶媒组相比，HGF给药组的I/N比值得到改善，具有显著性差异。认为这是由于HGF具有的血管新生作用。
实施例6对于兔下肢缺血ASO模型的肌肉内给药的药效探讨(1)方法使用NZW系兔(22周龄、雄性)。上腕部肌肉内给予5mg/kg的甲苯噻嗪(バイエル株式会社制造、セラクタ-ル)及50mg/kg的氯胺酮(三共株式会社制造、ネ>プタ-ル)，麻醉兔。切开左大腿部，摘出左大腿动脉，制成兔下肢缺血模型(参照J.Clin.Invest.,93,662-670(1994))。10天及15天后，同样进行麻醉，在左大腿部肌肉给予HGF或溶媒。给药量为100μg/kg/、给药容量1ml/kg/。作为溶媒，使用0.3M NaCl,0.03％Tween80,5mg/ml丙氨酸，10mM枸橼酸钠缓冲液(pH5.5)。大腿动脉摘出10天后(给药液前)，22天及42天后，按上述方法麻醉兔，用多普勒血流计(Triton公司制造)和水银血压计测定两下肢血压。分别由正常肢及缺血肢的血压计算出I/N比值(％)=缺血肢血压/正常肢血压×100，进行评价。也计算出10天后的I/N比值的增加率，进行评价。另外，在动脉摘出10天后及最终日(41或42天后)，用造影剂(山之内制药株式会社制造)进行左下肢的选择性血管造影。在所得到的血管造影照片上，重合排列着直径2.5mm圆的图片，计数和血管重合的圆的数目，计算出占全部圆(800个)的比例，作为血管造影的斑点。由各兔血管摘出后10天的血管造影斑点，计算最后一天血管造影的增加率(％)，作为血管造影斑点增加率进行评价。在最后一天，观察缺血肢关节的硬化度、缺血肢爪端的坏死、脱落、缺血肢下腿部的溃疡。
(2)结果下肢血管I/N比值的变化见图9。在HGF给药组，从动脉摘出22天后，显示高值趋势，42天后，给药组与溶媒组相比I/N比值的改善有显著性差异。认为这一结果是由于HGF具有的血管新生作用使缺血肢血行动态得到改善。另外，下肢血压的I/N比值的增加率见图10。从动脉摘出后10天至42天后期间内I/N比值的增加率，与溶媒组相比，在HGF给药组，该值的增高有显著性差异。血管造影得分的增加率见图11。与溶媒组相比，在HGF给药组，增加率的升高有显著性差异。认为是由于HGF的作用促进了侧副血行路的发达。在评价最终日的缺血肢的观察结果时，也发现与溶媒组相比，HGF给药组有症状轻的趋势(表4)，认为它反映了HGF给药对缺血肢血行动态的改善。
表4
实施例7对于大鼠下肢缺血ASO模型的肌肉内给药的药效探讨(2)(1)方法使用SD系大鼠(14周龄、雄性)。腹腔内给予约50mg/kg的戊巴比妥(ダイナポツト社制造)，麻醉大鼠。结扎分支后，摘出左大腿动脉，制成大鼠下肢缺血模型(参照Cardiovascular Research,35,547-552(1997))。然后立即在左大腿部的肌肉给予HGF或溶媒。给药量为1μg/kg、给药容量在所有实验均为1ml/kg。4天后，在乙醚麻醉下，同样进行第2次给药。溶媒使用0.3M NaCl,0.03％Tween80,5mg/ml丙氨酸，10mM枸橼酸钠缓冲液(pH5.5)。大腿动脉摘出7天后，大鼠经戊巴比妥麻醉，使用实验动物用非观血式血压计测定下肢血压。由正常肢、缺血肢各自的血压计算I/N比值(％)=缺血肢血压/正常肢血压×100，进行评价。
另外，为研究单次给药时的效果，只在大腿动脉摘出当天给药，进行同样的实验。HGF的给药量为3μg/kg。
(2)结果2次给药的结果见图12。在大腿动脉摘出7天后，与溶媒组相比，HGF给药组的I/N比值得到改善，具有显著性差异。认为这是由于HGF具有的血管新生作用产生的效果。显示在1μg/kg×2次这样的低用量，HGF有效。
另外，单次给药的结果见图13。在大腿动脉摘出7天后，与溶媒组相比，HGF给药组的I/N比值得到改善，具有显著性差异。显示HGF在单次该给药时也有效。
制剂例1在100ml生理盐水中，含有1mg HGF,1g甘露醇及10mg吐温80的溶液，经无菌方法配制，每支1ml，分装于小瓶后，冷冻干燥，密封，得到冷冻干燥制剂。
制剂例2在100ml 0.02M磷酸缓冲溶液(含有0.15MNaCl及0.01％吐温80,pH7.4)中，经无菌方法配制含有1mg HGF及100mg人血清蛋白的水溶液，每支1ml，分装于小瓶后，冷冻干燥，密封，得到冷冻干燥制剂。
产业上利用的可能性根据本发明，能提供含有有效成分HGF的药用制剂。其中，该制剂用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病。本发明的肌肉内给药用制剂与静脉给药相比，半衰期长、在肌肉内易于维持药物浓度，因此，与以前的静脉注射相比，具有减少用药量、并且在患部以外的作用少的效果。
权利要求
1．以肝实质细胞增殖因子为有性成分的制剂，其中该制剂使有效量的上述因子转运、分布、作用于给药部位的局部组织及其附近组织，并且能够减少在给药部位以外的血液中及全身组织的转运、分布、作用。
2．权利要求1记载的制剂，其中该制剂用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病。
3．权利要求1或2记载的肌肉内用药制剂，其中该制剂的给药部位是肌肉。
4．权利要求1或2记载的皮下用药制剂、外用制剂或湿布剂，其中该制剂的给药部位是皮下或表皮。
5．权利要求3记载的肌肉内用药制剂，其中该制剂的给药部位是骨骼肌或心肌。
6．权利要求1、2、3或5记载的制剂，其特征在于向给药部位肌肉组织的转运、分布、作用远远大于向血液、肝脏及肾脏的转运、分布、作用。
7．权利要求1、2、3、5或6记载的肌肉内用药制剂，其特征在于与静脉内团块给予同等剂量药物时相比，在血液、肝脏及肾脏的最大浓度是1％以下，而给药部位的肌肉内组织浓度是50倍以上；其中，该制剂含有有效成分肝实质细胞增殖因子(HGF)。
8．权利要求1、2、3、5或6记载的肌肉内用药制剂，其特征在于与静脉内团块给予同等剂量药物时相比，在血液、肝脏及肾脏的AUC是1/5以下，而给药部位的肌肉内组织的AUC是50倍以上。其中，该制剂含有有效成分肝实质细胞增殖因子(HGF)。
9．权利要求1、2、3、5、6、7或8记载的肌肉内用药制剂，其中该制剂用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病。
10．权利要求9记载的肌肉内用药制剂，该制剂的给药部位是患部及其周围肌肉局部，其中该制剂用于治疗或预防心脏或四肢的缺血性疾病或动脉疾病。
11．权利要求1、2、3、5、6、7、8、9或10记载的肌肉内用药制剂，其特征在于一次的给药量是0.01～500μg/kg。
12．权利要求11记载的肌肉内用药制剂，其特征在于一次的给药量是0.1～10μg/kg。
13．权利要求1～12中任意一项记载的制剂，其中动脉疾病是闭塞性动脉硬化症。
14．权利要求1～12中任意一项记载的制剂，其中缺血性疾病是缺血性心脏疾病。
15．权利要求1～14中任意一项记载的制剂，其特征在于含有作为有性成分的肝实质细胞增殖因子(HGF)，并且不合结合、吸附HGF的物质。
全文摘要
用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病的药用制剂,该制剂的有效成分为肝实质细胞增殖因子(HGF)。与静脉内给药相比,这些制剂具有以下效果,即,能维持患部的HGF浓度、半衰期长、能减少给药量,并且在用药患部以外的作用少。
文档编号A61K38/18GK1315867SQ99810379
公开日2001年10月3日 申请日期1999年8月4日 优先权日1998年8月5日
发明者永野智一, 河村敬夫, 泰地睦夫, 宫东育枝, 野口浩, 谷俊辅, 前田弘雄 申请人:住友制药株式会社