新的聚集蛋白的制作方法

专利名称：新的聚集蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的聚集蛋白，可用于研究生物防御系统的机制，而且，可用作药物的原料，因为它具有抗病毒等生物学活性。
目前已鉴定的聚集蛋白包括甘露聚糖结合蛋白(MBP)，表面活性蛋白A(SP-A)，表面活性蛋白D(SP-D)，共凝集素等。已知，这些聚集蛋白是由包含以下独特区域的基本结构(

图1)构成的(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)，和(2)胶原样区域(Malhortra等，欧洲免疫学杂志，第22卷，1437-1445,1992)，三个基本结构在胶原样区形成一种三螺旋体，形成一亚基，而且，这样的亚基可形成寡聚体，例如三聚体、四聚体和六聚体。
由细胞免疫和特异性抗体免疫组成的机制被认为是脊椎动物抵抗病原菌、病毒等侵袭的主要宿主-防御系统。最近有人提出，共凝集素等凝集素与非特异性免疫有关，例如，据报道，在母体抗体不足，特异性防御系统尚未发育的婴儿中，凝集素在中和并清除各种微生物方面具有重要作用(Super等，柳叶刀，Vol.2,1236-1239,1989)。
而且，有关凝集素在生物宿主防御系统中的作用，据报道，宿主会因为MBP基因突变造成MBP血液浓度下降而变得易受感染(Sumiya等，柳叶刀，Vol.337,1569-1570,1991)。
本发明的发明人已发现，共凝集素和甘露聚糖结合蛋白能抑制H1和H3型流感A病毒的感染及凝血活性(Wakamiya等，复合糖物，Vol.8,235,1991；Wakamiya等，生物化学生物物理学研究通讯，Vol.187,1270-1278,1992)。
然后，本发明的发明人分离出了编码共凝集素的cDNA克隆，并发现，共凝集素基因与多种表面活性蛋白D基因之间可能存在密切关联(Suzuki等，生物化学生物物理学研究通讯，Vol.191,335-342,1993)。
因此，预计聚集蛋白可用于研究生物的防御机制，并用作生理学活性药物的原料。所以，发现属于该家族的新分子将是对包括传染病治疗在内众多医药领域以及生物学领域的重大贡献。
本发明的内容本发明是基于本领域以上现状而完成的，本发明目的之一是提供一种新的聚集蛋白，它可望在人体内表现出诸如抗菌、抗病毒等生物学活性。
所以，本发明提供了一种不同于先前报道的新聚集蛋白基因和具有聚集蛋白特征性结构的蛋白质[1]一种聚核苷酸，其核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2,206-547的蛋白质；[2]一种聚核苷酸，其核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2,229-547的蛋白质；[3]一种聚核苷酸，具有核苷酸序列SEQ ID NO:1,670-1695；[4]一种聚核苷酸，具有核苷酸序列SEQ ID NO:1,739-1695；[5]编码聚集蛋白的聚核苷酸，它能在严谨条件下与一种PCR扩增所得的探针杂交，所述PCR所用引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；[6]一种聚核苷酸，它能在严谨条件下与任一[1]-[5]所述的聚核苷酸杂交，由该聚核苷酸编码的蛋白质是人聚集蛋白，具有(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)和(2)胶原样区域；[7]新的聚集蛋白，由[3]-[6]中的聚核苷酸编码；[8]新的聚集蛋白，具有氨基酸序列SEQ ID NO:2,206-547；[9]新的聚集蛋白，具有氨基酸序列SEQ ID NO:2,229-547；[10]新的聚集蛋白，比照[7]-[9]所述，其氨基酸序列具有一处或多处氨基酸缺失、取代和/或增加，而且，其氨基酸序列具有对应的(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)和(2)胶原样区域的序列。
以上[2]中的聚核苷酸所含核苷酸序列编码的蛋白至少具有氨基酸序列SEQID NO:2,229-547，但在第一个甲硫氨酸残基的上游还可以有其他核苷酸序列，例如编码具有以下氨基酸序列的蛋白质的那些SEQ ID NO:2中的226-228或211-228，或SEQ ID NO:2中的102-228,91-228,9-228,1-228。
而且，以上[4]中的聚核苷酸还可以在其5′上游包含以下核苷酸序列SEQ IDNO:1中的730-738或685-738，或358-738,325-738,79-738,55-783或1-738。
此外，以上[3]或[4]中的聚核苷酸还可以在其3′下游包含核苷酸序列SEQ IDNO:1,1696-204。
而且，若考虑用作生理学活性药物原料，以上本发明蛋白质[7]-[10]最好来自人源，因为这样可能在人体内表现出抗菌、抗病毒等活性。所以，本发明包括一种来自人的新聚集蛋白，而且在检查了各种人组织后提出了表达新聚集蛋白的建议，相信这些具有使用意义。
而且，以上新聚集蛋白[9]宜至少包含氨基酸序列SEQ ID NO:2中的229-547，而且，在第一个甲硫氨酸的上游还可以包含一段如下氨基酸序列，例如SEQID NO:2中的226-228或211-228，或SEQ ID NO:2中的102-228,91-228,9-228,1-228等。
以上[5]和[6]中的严谨性杂交条件可包括(例如)以下一系列杂交步骤在含5×SSC(20×SSC(3M NaCl,0.3M柠檬酸钠)稀释而得)，1％封闭试剂(BoehringerMannheim),0.1％N-十二酰肌氨酸和0.02％SDS的溶液中68℃预杂交1小时；在含5×SSC,1％封闭试剂，0.1％N-十二酰肌氨酸和0.02％SDS，以及cDNA探针(10ng/ml)的溶液中55℃杂交16小时；在2×SSC/0.1％SDS溶液中洗涤5分钟，共2次；然后在0.5×SSC/0.1％SDS溶液中55℃洗涤5分钟，共2次。然而，根据本领域已知技术，可以对溶液浓度、培养温度和时间等条件进行不同的修改。
此外，以上[10]中的氨基酸缺失、取代和/或增加可以是不对新聚集蛋白氨基酸残基的亲水/疏水性或酸/碱性造成重大变化，因此对(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)和(2)胶原样区特性改变不大的那些。根据报道中聚集蛋白家族蛋白质的氨基酸序列和结构，可允许的是，例如，(1)Ca2+依赖性糖识别区内1-10个氨基酸残基，以及(2)胶原样区内1-100，较好的是1-15个氨基酸残基的缺失、取代和/或增加。
本发明还提供一种载体，它以一种允许该新聚集蛋白表达的方式包含上述聚核苷酸。
所述插有聚核苷酸的载体可称之为复制子，例如内含上述新聚集蛋白聚核苷酸使得该新聚集蛋白可被复制和表达的质粒、λ噬菌体和粘粒等。例如，能比粘粒克隆更长DNA片段的载体包括P1噬菌体，F因子和人造酵母染色体YAC等。而且，λ噬菌体包括取代载体和插入载体，这可以根据引入基因的长度来选择。此外，能够在动物细胞内表达的已知载体包括SV40载体，牛乳头瘤病毒载体、疱疹病毒载体，腺病毒载体，痘病毒载体，逆病毒载体等。市售的载体包括pUC19,pTV118N(Takara Shuzo Co.,Ltd.),pUEX2(Amersham),pGEX-4T,pKK233-2(Pharmacia),pMAM-neo(Clontech),pGL2(Promega),pDNA3.1+(Invitrogen)等。可任意选用常规方法，用限制性酶、连接酶等构建此类载体，对此无特殊限制。
用细菌，特别是大肠杆菌作为用以上载体转化或转染的宿主细胞时，载体一般至少含启动区(包括启动子、操纵子和SD序列)，起始密码子，编码新聚集蛋白的核苷酸序列，终止密码子，终止区等。在用酵母或动物细胞作为宿主时，载体宜至少含启动子、起始密码子，编码信号肽和新聚集蛋白的核苷酸序列，以及终止密码子。此外，还可在载体内插入增强子序列，新聚集蛋白5′和3′的非翻译区，拼接接头，聚腺苷酸化位点和可选标记。
作为本发明载体内的启动子，不论其是强是弱，一般可使用熟知的SV40(猿病毒40)、SRa、巨细胞病毒(CMV)启动子，肌动蛋白启动子，病毒LTR(长末端重复序列)，例如，HTLV-1 LTR,HIV-LTR,Rous肉瘤病毒LTR，单纯性疱疹病毒酪氨酸激酶启动子等。
如果希望在从成纤维细胞、神经细胞、血细胞、实质细胞等正常细胞到癌细胞的多种类型真核细胞内进行表达，常用启动子可以包括巨细胞病毒、胸腺嘧啶激酶(TK)，β肌动蛋白和SV40早期基因启动子等。因为增强子通常与启动子序列相结合，所以可以就这样使用。
此外，如果基因进入并表达的细胞和组织已经确定，则可选用该细胞的特异性启动子。而且，通过这些启动子的同源或异源组合可预期高表达，并可能稳定获得的新聚集蛋白。
另一方面，也可以包括用于原核细胞的启动子，例如PBAD,PL,trc,T7,SP6,T3,lac等。
原则上，能够在原核细胞内高表达新聚集蛋白的启动子都可选来用作本发明的启动子，只要该启动子与宿主相容。此外，如果基因进入并表达的细胞和组织已经确定，则可选用该细胞的特异性启动子。而且，通过这些启动子的同源或异源组合可预期高表达，并可能稳定获得的新聚集蛋白。
另一方面，用于酵母的启动子包括GLA1,AOX1,CUP1,PGK等。
上述载体内用来只回收所需载体的可测标记包括二氢叶酸还原酶(缩写为DHFR)基因，甲氨蝶呤抗性基因，neo基因(G418抗性基因)等，而且，如果用DHFR作为可选标记并选用DHFR基因缺失的CHO细胞，也可以用无胸腺嘧啶培养基进行选择。此外，在含高浓度甲氨蝶呤的培养基中的细胞内表达基因并选择抗性细胞，还可以获得高表达的细胞株。
本发明还包括用以上构建的载体转化或转染以表达本发明新聚集蛋白的宿主细胞，例如动物细胞、昆虫细胞和微生物细胞(大肠杆菌，枯草杆菌，酵母等)。
用作本发明宿主细胞的动物细胞包括人的细胞，但不限于此。例如，CHO细胞，COS细胞，BHK细胞，Vero细胞，骨髓瘤细胞，HEK293细胞，HeLa细胞，Jurkat细胞，小鼠L细胞，小鼠C127细胞，小鼠FM3A细胞，小鼠成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞等。此外，大肠杆菌、枯草杆菌等细菌，酿酒酵母、啤酒酵母等酵母也可作为微生物细胞。
此外，本发明还提供了一种用于筛选具有以上聚核苷酸或其片段的新聚集蛋白相关分子的探针。新聚集蛋白相关分子是指不包括图10中已知聚集蛋白，具有图1特征性结构的新聚集蛋白分子。通过检测探针与各种生物组织细胞等的基因之间的杂交能力，通过搜寻能在严谨性条件下与探针杂交的分子来筛选编码新聚集蛋白相关分子的基因，可以用本发明探针获得所需的新聚集蛋白相关分子。在上述多肽片段中，含SEQ ID NO:1中含糖识别位点结构域的1291-1698中10个以上碱基或(更好的是)20个以上碱基核苷酸序列的那些，或含SEQ ID NO:1中含胶原样区域的796-1236中10个以上碱基或(更好的是)20个以上碱基核苷酸序列的那些，可以用作构建特异性探针的聚核苷酸。
本发明还提供了一种识别本发明新聚集蛋白相关分子和/或其衍生分子的抗体。本发明的“衍生分子”可包括与新聚集蛋白具有类似特征的片段(例如含糖识别位区和/或胶原样区的片段)，新聚集蛋白的前体，和含有能在严谨条件下与编码所述片段、前体的核苷酸序列和/或其互补序列杂交的核酸所编码的氨基酸序列的多肽。
新聚集蛋白和/或其衍生分子的抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体和肽抗体)或抗血清可以用本发明的新聚集蛋白和/或其衍生分子，或含有它们的融合蛋白等作为抗原通过产生抗体或抗血清的已知方法来制备。即，可将本发明的新聚集蛋白和/或其衍生分子或含有它们的融合蛋白作为抗原，单独或与稀释剂或载体一起给予温血动物允许抗体产生的部位。在给予时，可用Freund完全或不完全佐剂来加强抗体的产生。所述给予一般为每1-6周1次，共2-10次。所用的温血动物可包括，例如，猴子、家兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡等，其中优选小鼠和大鼠。大鼠中，尤以Wistar和SD大鼠为宜，小鼠中，以BALB/c、C57BL/6和ICR小鼠为宜。
在制备单克隆抗体生产细胞时，选出具有抗体效价的温血动物(例如小鼠)，然后在最后一次接种后的2-5天回收其脾脏或淋巴结，然后将其中抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合，于是得到生产单克隆抗体的杂交瘤。抗血清中抗体效价的测定可如下进行，例如，将抗血清与后文所述标记过的新聚集蛋白或新聚集蛋白反应，然后测定与抗体偶联的标记的活性。可根据已知方法进行融合操作，例如Kohler和Milstein的方法(自然，256:495,1975)和该方法的改进(免疫学方法杂志，39:285,1980；欧洲生物学杂志，118:437,1981；自然，185:446-1980)。可使用聚乙二醇(PEG),Sendai病毒等作为融合促进剂，优选PEG。为了进一步提高融合效率，可根据需要加入外源凝集素、聚-L-赖氨酸或DMSO。
杂交瘤细胞可包括，例如，X-63Ag8,NS-1,P3U1,SP2/0,AP-1细胞等，然而，优选的是SP2/0细胞。适宜的抗体生产细胞(脾细胞)与骨髓瘤细胞之比为1∶20-20∶1，加入约10-80％PEG(以PEG1000-6000为宜)，在20-40℃，更好的是30-37℃培养1-10分钟，可有效地实现融合。虽然有许多方法可用来筛选生产新聚集蛋白和/或其衍生分子的抗体的杂交瘤，但可采用如下方法，例如将杂交瘤培养上清液加到新聚集蛋白抗原直接吸附或通过载体吸附所在的固相(例如微滴板)上，接着，加入以放射性物质、酶等标记的抗免疫球蛋白抗体或蛋白A，检测与固相偶联的抗新聚集蛋白抗原；或者，将杂交瘤培养上清液加到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相上，然后加入用放射性物质、酶等标记的新聚集蛋白，检测与固相偶联的抗新聚集蛋白单克隆抗体；等。
可用本领域的已知方法来选择和克隆新聚集蛋白和/或其衍生分子的单克隆抗体。通常，这可以在加有HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的动物细胞选择培养基中进行。凡杂交瘤能在其中生长的各种培养基都可用作选择、克隆和生长的培养基。例如，可使用含1-20％，较好的是10-20％胎牛血清的RPMI培养基，含1-10％胎牛血清的GIT培养基，用于杂交瘤培养的无血清培养基。培养温度以37℃为宜。培养时间一般为5天至3周，以1-2周为宜。培养一般在含5％二氧化碳的空气中进行。测定杂交瘤培养上清液抗体效价的方法与前述测定抗血清中新聚集蛋白抗体效价的方法类似。具体地说，可采用以下方法作为测定方法，放射性免疫试验(RIA)法，酶联免疫吸附试验(ELISA)法，荧光免疫试验(FIA)法，空斑试验法，凝集反应法等，但优选的是以下所述的ELISA法。
用制备免疫抗原的类似方法制备蛋白质，将其固定在ELISA板上各孔的表面上。接着，为了避免非特异性吸附，固定牛血清白蛋白(BSA)，小鼠血清白蛋白(MSA)，卵白蛋白(OVA)，明胶，脱脂奶等。在各孔内加入杂交瘤培养上清液，静置足够的时间以进行免疫反应。用磷酸盐缓冲液(PBS)之类洗涤液洗涤各孔，洗涤液中宜加有表面活性剂。加入酶联第二抗体，静置一段时间。可用β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶等作为标记酶。在用相同洗涤液洗涤各孔后，加入所用标记酶的底物溶液，进行酶反应。如果所加杂交瘤培养上清液中含有所需的抗体，就会发生酶反应，从而改变底物溶液的颜色。
一般可用本领域已知的半固体琼脂法，有限稀释培养法等已知方法进行克隆，简而言之，在测得有抗体产生的孔后，可进行克隆来获得单克隆。可用有限稀释培养法作为克隆方法，其中，稀释杂交瘤细胞并培养，在培养板上的每孔形成一个集落。可用饲养细胞进行有限稀释培养法，或者，可加入白介素6等细胞生长因子来增强集落形成能力。或者，可用FACS(荧光活化细胞分选仪)和单细胞操作方法来进行克隆。最好将克隆杂交瘤培养在无血清培养基中，在上清液中加入最适量的抗体。可用烧瓶或细胞培养设备进行如此所得单个杂交瘤的大规模培养，或者，在动物体内进行腹膜内培养(免疫学方法杂志，53:313,1982)，以便获得单克隆抗体。可用含0-20％胎牛血清(FCS)的细胞培养基(IMDM,DMEM,RPMI1640,MEM等)进行细胞的瓶内培养。在进行动物腹膜内培养时，最好使用与细胞融合所用骨髓瘤细胞的来源动物同种同品系的动物，优选无胸腺裸小鼠等，在给予降植烷等矿物油后进行杂交瘤移植。1-2周后，腹膜内长出杂交瘤细胞，此时可回收含单克隆抗体的腹水。
选择识别新聚集蛋白和/或其衍生分子特异性表位的单克隆抗体，可获得与其他蛋白质无交叉反应性的单克隆抗体。通常，蛋白质氨基酸序列中的至少3个以上连续氨基酸残基所代表的表位，最好是一段7-20氨基酸的氨基酸序列是该蛋白质内的一个固有表位。因此，识别新聚集蛋白和/或其衍生分子的氨基酸序列代表的肽所构成，且具有至少3个连续氨基酸残基构成的氨基酸序列的表位的抗体，可称之为本发明新聚集蛋白和/或其衍生分子的特异性单克隆抗体。如果选出新聚集蛋白和/或其衍生分子之间的保守氨基酸序列，就能够选出新聚集蛋白家族的共同表位。或者，如果选出了含某序列的特异性氨基酸序列的区域，就可以选出能够区分对应蛋白的单克隆抗体。
可按照免疫球蛋白的分离和纯化方法分离和纯化新聚集蛋白和/或其衍生分子的单克隆抗体，这与普通多克隆抗体相似。可用如下已知纯化方法来获得抗体，例如盐析法，醇沉淀法，等电点沉淀法，电泳法，硫酸铵沉淀法，用离子交换树脂(例如DEAE(二乙基氨基乙基)琼脂糖等)进行的吸附与解吸，超离心法，凝胶过滤法，特异性纯化法(用诸如抗原结合性固相、蛋白A、蛋白G等活性吸附剂只收集一种抗体，然后解离这种结合)。为了避免在纯化过程中凝聚体形成和抗体效价下降，可加入浓度为0.05-2％的人血清白蛋白。此外，还可以加入甘氨酸、α-丙氨酸等氨基酸，特别是赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸，葡萄糖、甘露醇等糖，或氯化钠等盐。已知IgM抗体特别容易凝聚，为此，可用β-丙酰基内酯和乙酸酐进行处理。
可按照本已知法来制备本发明的多克隆抗体。例如，可用抗原(蛋白质抗原)本身或它与载体蛋白质制得的复合物，以前文产生单克隆抗体时类似的方法免疫温血动物，于是从被免疫动物中收集含有抗本发明蛋白质或其片段的抗体的物质，通过分离和纯化就可以得到单克隆抗体。有关用来免疫温血动物的免疫抗原与载体蛋白质的复合物，就载体蛋白的种类和载体与半抗原之比而言，可使用任意混合比例，只要能够有效产生与载体交联和共免疫的半抗原的抗体。然而，可使用如下方法牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、血青蛋白等以约0.1-20∶1，较好的是约1-5∶1的重量比，与半抗原偶联。而且，可用多种缩合剂将半抗原与载体偶联，然而，可采用戊二醛或碳二亚胺，马来酰亚胺活泼酯，含巯基或二硫吡啶基的活泼酯试剂等。缩合产物可单独或与载体或稀释剂一起给予温血动物。在给予时，可给予Freund完全或不完全佐剂来增强抗体生产能力。给予可每2-6周进行一次，总共约3-10次。可从用以上方法免疫的温血动物的血液、腹水等中回收多克隆抗体，较好的是从血液中回收。测定抗血清中多克隆抗体的效价可采用与测定前述抗血清内抗体效价类似的方法。可按照免疫球蛋白的分离和纯化方法，类似于前述单克隆抗体分离和纯化方法，进行多克隆抗体的分离和纯化。
此外，可以用含聚集蛋白和/或其衍生分子和另一种蛋白质或多肽片段的融合蛋白作为免疫原来产生抗体。作为构成融合蛋白的另一种蛋白质或多肽，尤其适合的是GST(谷胱甘肽-S-转移酶)，除此之外还可使用聚组氨酸(以6个组氨酸残基为佳)，钙调蛋白结合肽(CBP)，蛋白A等。
使用聚组氨酸时，可利用与镍螯合树脂的吸附来分离和纯化基因重组过程中所表达的融合蛋白，并通过加入EDTA或咪唑底物和改变pH来从树脂上解离蛋白质。使用CBP时，可用钙调蛋白亲合性树脂对所表达的融合蛋白进行亲合性层析，然后加入EGTA从树脂上解离融合蛋白。此外，使用蛋白A时，可用IgG琼脂糖(例如，IgG琼脂糖6FF)对所表达的融合蛋白进行亲合性层析，然后通过改变pH从树脂上解离。
此外，融合蛋白中所用另一种蛋白质或多肽片段的候选者包括，例如Xpress，硫氧还蛋白，c-myc,V5,HAc/c-myc等，当与新聚集蛋白所成的融合蛋白表达后，可用能识别所述另一种蛋白质作为表位的抗体通过抗原-抗体亲合性柱来分离和纯化融合蛋白。
如果以所述融合蛋白作为免疫原获得单克隆抗体，可用新聚集蛋白来筛选抗体，然而，就选择性而言，更好的是用融合蛋白作为免疫原进行筛选。
上述优选免疫原，即含有GST和新聚集蛋白和/或其衍生分子的融合蛋白适合以如下方法生产培养被含GST基因编码区和新聚集蛋白和/或其衍生分子编码区的表达载体所转化或转染的大肠杆菌或动物细胞；然后从培养液和/或细胞中分离融合蛋白。较好的是，利用对谷胱甘肽的支持相，例如谷胱甘肽琼脂糖珠的亲合性，进一步纯化所得的融合蛋白，并用已知方法从谷胱甘肽琼脂糖珠上洗脱该融合蛋白。于是，获得可作为所需免疫原的纯化融合蛋白。
用融合蛋白作为免疫原制备单克隆抗体的方法中，可用新聚集蛋白和/或其衍生分子来筛选抗体，然而，就特异性而言，更好的是用融合蛋白作为免疫原进行筛选。
新聚集蛋白和/或其衍生分子的单克隆抗体可用来诊断和治疗与新聚集蛋白相关的疾病。必须指出的是，如果要将抗体给予人，最好使用对人没有免疫原性，或其免疫原性尽可能低的人源化抗体或嵌合抗体。在将小鼠单克隆抗体给予人体时，很可能会出现多种副作用，因为它对人来说是一种异源蛋白质。因此，较好的是人单克隆抗体，然而，融合效率低，而且难以获得稳定生产抗体的杂交瘤。然而，相关技术目前已有所发展，因此，生产人单克隆抗体或嵌合抗体已经成为可能。
“嵌合抗体”指小鼠抗体和人抗体的嵌合分子。在伦理上，不能通过用给定抗原免疫人来获取抗体。所以，用抗原免疫小鼠，然后从小鼠单克隆抗体的基因中切出可与抗原结合的抗体可变区(V区)，将其与由入骨髓瘤细胞获得的抗体基因的恒定区(C区)偶联，于是制得嵌合基因。当该嵌合基因在宿主细胞内表达时，就可产生人/小鼠单克隆抗体。因为嵌合抗体对人的抗原性低，它可以用作单克隆抗体给予人体进行治疗和诊断造影等。有关已知的嵌合抗体相关技术，可参见日本未审定的已公开专利申请No.H05-304989(1993)，日本未审定的已公开专利申请No.H04-330295(1988),WO9106649和日本未审定的已
公开日本专利申请No.S63-036786(1988)，和已
公开日本专利申请No.H06-98021(1994)等。
据报道，目前已开发出了比嵌合抗体更有用的人源化抗体。“人源化抗体”只将抗体分子抗原结合位点(CDR互补性决定区)的基因序列移植给人抗体基因(CDR移植)，因此，整个分子是人源化的，除了该抗体分子的CDR。因为该抗体中小鼠抗体的比例比人/小鼠嵌合抗体少，所以它被认为抗原性更低，更安全。在我国，曾进行过成人T细胞白血病的人源化抗体的临床试验。有关制造人源化抗体的方法和相关技术，参见以下专利申请，例如Genentech(USA)(WWO9222653,WO9845332,WO9404679,WO9837200和WO9404679)和Celltech(UK)(WO9429451,WO9429351,WO9413805,WO9306231,WO9201059,WO9116927,WO9116928,WO9109967,WO8901974和WO8901783)等。
产生人抗体的方法包括用Epstein-Barr病毒(EBV)进行转化，然后将转化细胞与亲代细胞融合；用基因工程方法制备嵌合抗体或人源化抗体；等等；并结合细胞融合方法。嵌合抗体指异源动物的免疫球蛋白基因片段连接而成的抗体，人源化抗体指修饰对人来说是异源的抗体(例如小鼠等的抗体)，结果以人抗体的相应一级结构取代除H链和L连互补性决定区(CDR)之外的异源抗体的一级结构。作为制备人单克隆抗体所用的亲代细胞，适合用SHM-D33品系(ATCC CRL1668)或RF-S1品系，人/鼠异源骨髓瘤，以获得比小鼠亲代细胞更高的融合率。用这些亲代细胞获得的杂交瘤可以不用饲养细胞进行克隆，并可以稳定地大量产生IgG类抗体。可用加有15％FCS的ERDF培养基培养亲代细胞，其他过程的进行与对小鼠类似。此外，为了产生人单克隆IgG类抗体，较好的是，从外周血中收集用抗原充分致敏的人淋巴细胞，以供使用。
如果难以获得以抗原致敏的淋巴细胞，可以体外进行抗原致敏。可用上述方法将本发明抗体人源化，从而得到非常适合给予人体的抗体。
本发明还提供获得新聚集蛋白相关分子、新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用上述抗体筛选蛋白质来获得新聚集蛋白相关分子、新聚集蛋白和/或其衍生分子的步骤。在该方法中，为了获得可能存在于多种生物体液、组织细胞等的新聚集蛋白相关分子、新聚集蛋白和/或其衍生分子，用上述抗体筛选具有免疫反应性的蛋白质。在筛选步骤中，最好采用对cDNA文库的表达筛选。
本发明还提供定量测定新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用上述抗体，根据免疫学结合特性来测定试验样品中的新聚集蛋白和/或其衍生分子含量。
在该方法中，为了测定新聚集蛋白和/或其衍生分子含量，可用上述抗体进行免疫印迹、免疫沉淀、ELISA等，特别优选简便的ELISA法。此外，测定新聚集蛋白和/或其衍生分子含量可采用夹心法，包括检测新聚集蛋白和/或其衍生分子与偶联于(例如)不溶性支持相上的抗体和标记抗体反应而成的夹心复合物；或者使用竞争法，包括标记的新聚集蛋白和/或其衍生分子与样品中的新聚集蛋白和/或其衍生分子在样品中竞争与抗体反应，然后根据与抗体反应的抗原量来测定样品中新聚集蛋白和/或其衍生分子的量。
在用夹心法测定新聚集蛋白和/或其衍生分子含量时，可采用两步法首先进行固定化抗体与新聚集蛋白和/或其衍生分子的免疫反应，然后在洗去所有未反应的物质后加入标记过的抗体；或可采用一步法固定化的抗体、标记过的抗体与新聚集蛋白和/或其衍生分子同时混合。
用于上述测定的不溶性支持相包括合成树脂，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龙、聚醛、含氟树脂等；多糖，例如纤维素、琼脂糖等；玻璃；和金属等。不溶性支持相可以是各种形式的，例如碟形、球形、纤维状、圆柱形、盘状、槽样、网格状、管状等。吸附了抗体的支持相可保存在低温处，有叠氮钠之类防腐剂的存在下。
至于抗体的固定化，可采用化学结合法或物理吸附法。化学结合法包括，例如，戊二醛法，使用N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸、N-琥珀酰亚氨基-2马来酰亚胺乙酸酯等的马来酰胺法，使用盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)盐酸碳二亚胺的碳二亚胺法。此外，还可以采用马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯法，N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶硫基)丙酸法，叠氮化二氨基联苯法，二棕榈赖氨酸法。或者，可预先由被测物与抗体形成复合物，该抗体具有另一种不同的表位，然后根据上述方法用对该抗体的固定化第三抗体来捕捉该复合物。
用来标记抗体的物质可以是酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、金属螯合剂等。酶包括过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酶、δ-5-甾体异构酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、天冬氨酸酶、葡萄糖氧化酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶等；荧光物质包括，例如荧光黄异硫氰酸酯、藻胆色素蛋白、罗丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝蛋白、正邻苯二甲醛等；发光物质包括异鲁米那，光泽精，鲁米那，芳香吖啶酯，咪唑，吖啶盐及其修饰酯，荧光素，荧光素酶，水母发光蛋白等；放射性物质包括125I,127I,131I,14C,3H,32p,35S等，但还包括可用于免疫学测定方法的其他物质。此外，可将小分子半抗原，例如生物素、二硝基苯基、吡哆醛或胺荧等与抗体偶联。较好的是用辣根过氧化物酶作为标记酶。该酶可与多种底物反应，而且可方便地用高碘酸法与抗体偶联。
在用酶作为标记物质时，需用可测定其活性的底物和生色剂。在用过氧化物酶作为酶时，可用H2O2作为底物溶液，2,2′-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯]铵(ABTS)、5-氨基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基氨替比林、3,3′,5,5′-四甲基二氨基联苯等作为生色剂；用碱性磷酸酯酶时，底物可以是邻苯基磷酸酯，对硝基苯磷酸酯等；或者，用β-D-半乳糖苷酶时，底物可以是荧光黄-二-(β-D-半乳糖吡喃糖苷)、4-甲基-伞形酮基(umbelliferyl)-D-半乳糖吡喃糖苷等。
作为交联剂，可使用N,N′-邻苯二马来酰亚胺，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己酰基N-琥珀酰亚胺酯，6-马来酰亚胺己酰基N-琥珀酰亚胺酯，4,4′二硫吡啶等已知交联剂。可根据所用交联剂的性质，按已知方法进行这些交联剂与酶和抗体的反应。
此外，根据情况，可使用抗体的片段，例如Fab′,Fab,F(ab′)2作为抗体。而且，可类似于多克隆抗体和单克隆抗体，用酶标记这些抗体。用前述交联剂获得酶标记抗体，并用已知方法纯化后，就可得到灵敏度更高的免疫学检测系统。可将如此纯化后的酶标记抗体与硫柳汞、甘油等稳定剂混合，或将其冷冻干燥，然后保存在低温避光处。
凡含新聚集蛋白和/或其衍生分子或其前体的样品都可进行前述定量测定，它们可以是体液，例如血浆、血清、血液、尿、组织液、脑脊髓液等。
此外，本发明还提供一种定量测定新聚集蛋白和/或其衍生分子的试剂盒，其中包括上述抗体，其中，用该抗体通过ELISA法来测定被测样品中新聚集蛋白和/或其衍生分子的量。该试剂盒除所述抗体之外，还包括进行上述定量测定所必需的其他试剂。
本发明还提供一种生产新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用前述抗体分离新聚集蛋白和/或其衍生分子的步骤。为了在所述方法中分离新聚集蛋白和/或其衍生分子，可采用柱形式、批处理法等方式的亲和性层析和/或免疫沉淀，其步骤包括使样品与偶联了前述抗体的支持相接触，以发生抗原抗体间的特异性反应；洗涤支持相；洗脱偶联的所需蛋白。
该方法中的样品可以是由人的胎盘、脾脏等制备的，或通过编码本发明新聚集蛋白的聚核苷酸表达来制备的，然而，优选使用表达产物，因为它可以作为稳定的样品来源，所以，本发明还涉及包括这一表达步骤的方法。
此外，本发明内容还包括检测组织内是否有新聚集蛋白和/或其衍生分子存在的方法，其中，用上述抗体进行免疫组织学检测。所述免疫组织学检测可以是例如用经标记抗体进行的原位免疫组织学染色等可检测新聚集蛋白和/或其衍生分子的技术。
此外，本发明还提供一种转基因非人动物，它具有稳定导入其染色体的含上述本发明聚核苷酸的重组基因，并能够表达新聚集蛋白。本发明还提供一种如下转基因非人动物，该动物具有本发明新聚集蛋白的同源体，基因的转入是为了改变该同源体的表达(例如，只在预定的限制性条件下抑制、促进或实现表达)。在该非人动物中，可以在基因表达的几个重要调控位点(增强子、启动子、内含子等)内制造缺失、取代、增加和/或插入等突变，从而人为改变有关基因的表达，使之高于或低于原来的基因表达。突变的引入可用已知方法进行。(例如，Lesley,S.A.等，Promega Notes Magazine,46,6-10,1994；Kunkel,TA.等，酶学方法154:367-382,1987；Sayers,J.R.等，生物技术13:592-596,1992；Ito W.等，Gene,102,67-70,1991；Cormack,B.，当代分子生物学方法8.5.1-8.5.9,1987)。在该方法中，所述基因包括cDNA，基因组DNA或合成DNA。此外，基因的表达包括转录和翻译两步。
本发明所述的转基因非人动物可用于开发疾病动物模型，继而用于研究新聚集蛋白和/或其衍生分子的功能或表达调节，阐明新聚集蛋白和/或其衍生分子可能参与的疾病的机制，还可用于药物的筛选和安全性试验。
“转基因动物”，可狭义地解释为通过基因融合在其生殖细胞内人工引入了外源基因的动物，可广义地解释为在个体发育早期在染色体内稳定引入了外源基因的动物，因此，可以作为遗传特征传递给后代，该名词包括特定基因的功能被反义RNA抑制的动物，某特定基因被胚胎干细胞(ES细胞)失效的动物，和引入了点突变DNA的动物。
本发明中，可构建较广泛意义上的“转基因”动物，包括除人以外的所有脊椎动物。本发明的转基因动物可用于开发疾病动物模型，继而用于研究新聚集蛋白和/或其衍生分子的功能或表达调节，阐明人体内与这些分子表达相关细胞疾病所涉及的机制，还可用于药物的筛选和安全性试验。
产生转基因动物的方法包括在相差显微镜下，用微量移液管将某基因直接引入卵细胞前核期的细胞核中(显微注射法，参见美国专利4,873,191)的方法；使用胚胎干细胞的方法等。此外，已经有了如下方法将基因插入逆病毒或腺病毒载体，然后转染到卵细胞内；精子载体法，即通过精子细胞将基因引入卵细胞；等等。
精子载体法是这样一种基因重组法，将外源基因附着于精子细胞上，或用电穿孔等方法将其引入精子细胞，然后通过受精将外源基因引入卵细胞(M.Lavitranoet等，细胞57,717,1989)。或者，可采用噬菌体P1的cre/lox P重组酶系统、酿酒酵母的FLP重组酶系统进行体内定点基因重组。此外，已有将目标蛋白质的转基因引入非人动物的报道。
可以如下所述用显微注射法产生转基因动物。
首先，制备涉及表达调节的启动子、编码新聚集蛋白的核苷酸序列和聚A信号构成的转基因。特定分子的表达方式和表达量受启动子活性的影响，而且，所得转基因动物在引入转基因的拷贝数和引入部位上存在品系间差异，因此，必需分别确定各品系的表达方式和表达量。已知表达量会因非翻译区和拼接而不同，所以还可以引入一段先于聚A信号切除的内含子序列。重要的是，用来引入受精卵的基因必须尽可能得纯。所用的动物包括用来采集受精卵的小鼠(5-6周龄)，用于授精的雄性小鼠，假孕雌性小鼠，接受过输精管结扎的雄性小鼠等。
为了能得到受精卵，可用促性腺激素等诱导排卵。回收受精卵，然后用显微注射法将置于注射移液管内的基因注入该卵细胞的雄性前核。制备用于将注入的卵子带回子宫的动物(如假孕雌性小鼠)，给每个动物移植10-15个卵子。然后，从尾端提取基因组DNA，然后检测转基因以确定它是否引入了出生的小鼠，该检测可采用Southern印迹法或PCR法，或插入只在发生同源重组时才活化的标记基因的阳性克隆法。此外，为了确定转基因的表达，用Northern印迹或RT-PCR法检测转基因的转录产物。或者，可用蛋白质或其片段的特异性抗体进行Wetern印迹。
此外，本发明还提供一种非人(基因)敲除(knock-out)动物，这是通过以抑制同源体表达的方式改变一含有本发明新聚集蛋白同源体的非人动物内该同源体编码基因的表达而得到的。
可对本发明的敲除动物进行处理以破坏新聚集蛋白和/或其衍生分子基因的功能。“敲除小鼠”指某特定基因被同源重组技术破坏而功能弱化的转基因小鼠。可用ES细胞进行同源重组，并选择等位基因之一被改变或破坏的胚胎干细胞来产生敲除小鼠。可以通过将具有待操作基因的胚胎干细胞注射到胚泡或桑葚胚期的受精卵中，得到具有胚胎干细胞与胚胎衍生细胞形成的混合细胞的嵌合小鼠。在该嵌合(嵌合指基于两个以上受精卵用体细胞形成的单个小鼠)小鼠与普通小鼠杂交受精时，就可以产生等位基因之一被完全改变/破坏的杂合子小鼠。此外，还可以通过杂合子小鼠彼此之间的杂交受精来产生纯合子小鼠。
“同源重组”指核苷酸序列相同或非常相似的两基因之间通过基因重组机制发生的重组。可用PCR法挑选发生了同源重组的细胞。可用插入基因的一部分和插入区域的一部分作为引物进行聚合酶链反应，于是，如果有扩增产物生成则可鉴定到细胞内发生的同源重组。此外，在胚胎干细胞内表达的基因内进行同源重组时，先将新霉素抗性基因与引入基因连接，将该基因引入后，就可方便地进行选择，例如使细胞表现出新霉素抗性，或用其他已知方法或其改进版(参见，Capecchi，科学Vol.244,pp.1288-1299(1989)，等)。
以下非限定性的说明性实施例将更详细地描述本发明。本发明希望能函盖本领域技术人员根据本文得出的所有修改，特别是对权利要求及其条件做最广义解释所函盖的那些。
以下实施例是EST库的检索(实施例1)；筛选探针的制备(实施例2)；人胎盘cDNA文库的筛选(实施例3)；测定新聚集蛋白的核苷酸序列(实施例4)；对新聚集蛋白的基因组Southern分析(实施例5)；以各种人组织进行的新聚集蛋白Northern分析(实施例6)；用各种动物的组织进行的新聚集蛋白Southern分析(实施例7)；和对新聚集蛋白的遗传研究(实施例8)；新聚集蛋白特异性单克隆抗体的产生(实施例9)；用抗小鼠抗人新聚集蛋白抗体进行的ELISA法(实施例10)；对人低免疫原性抗体的产生(实施例11)；新聚集蛋白表达载体pNOW1-hCL-P1的构建(实施例12)；新聚集蛋白表达克隆的选择(实施例13)；转基因小鼠的产生(实施例14)；和敲除小鼠的产生(实施例15)。
实施例1EST库的检索通过比较氨基酸序列，检索已知聚集蛋白分子(即人MBP，人SP-A和人SP-D)之间的高度保守区(见图2和3，其中框内的是以上蛋白间彼此相同的氨基酸残基)。结果，由27个氨基酸构成的区域，即人MBP序列中的氨基酸220-246(图3中以空心字体显示)高度同源。因此，制备了一些对应于该区的共同序列，并用这些序列对EST(表达序列标签)库进行检索。本研究使用的是1996年10月11日公开的EST库，其中有676750段序列。
于是获得含有与上述27氨基酸序列高度同源的氨基酸序列信息。进一步用这些氨基酸信息检索GenBank/EST库，推断它们是来自已知基因还是来自未知基因。由此证实，当用以下氨基酸序列作为共同序列时，得到的信息中包括两段高度同源的未知核苷酸序列(定名为W72977和R74387)，所用氨基酸序列为Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe(SEQ ID NO:3)。它们分别来自胎盘和胎心，以及展现新聚集蛋白部分核苷酸序列的克隆。
然后，向ATCC(美国典型培养物保藏中心)购买由胎心制备的克隆(I.M.A.G.E.联合克隆ID34472)，用作筛选新聚集蛋白的筛选探针。
实施例2筛选探针的制备用引物(Pharmacia,M13通用引物(SEQ ID NO:7,5’-荧光素-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3′)和M13反向引物(SEQ ID NO:8,5′-荧光素-caggaaacagctatgac-3′))测定上述克隆插入DNA的核苷酸序列。
通过与聚集蛋白氨基酸序列的配对比较，在所得核苷酸序列中选择一个开放读码框，并挑出对应于可由该开放读码框读出的氨基酸序列的核苷酸序列。然后，用DNA/RNA合成仪(Applied Biosystem,392A)制备对应于部分该核苷酸序列的地高辛(DIG)标记的cDNA探针的引物(反向引物caatctgatgagaaggtgatg(SEQ IDNO:4)和正向引物acgaggggctggatgggacat(SEQ ID NO:5))。DIG标记用PCR DIG探针合成试剂盒(Boehringer Mannheim)进行。反应混合物含质粒DNA(克隆W72977,50ng/μl),2μl(100ng)；10×缓冲液5μl；25mM MgCl2,5μl；dNTP(PCR标记混合物)，5μl；20μM反向引物，2.5μl；20μM正向引物，5μl；H2O,28μl；Taq聚合酶，0.5μl。用Zymoreactor(ATTO Corp.)进行35轮PCR反应92℃1分钟，55℃(21分钟，和72℃2分钟。
实施例3人胎盘cDNA库的筛选首先，如下对人胎盘噬菌体cDNA文库进行滴定。0.2ml在mLB培养基(LB培养基(1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物和0.5g NaCl，总体积100ml)含10mM MgSO4和0.2％麦芽糖)中37℃培养了16小时的大肠杆菌Y1090r-和0.1ml以SM缓冲液(5.8g NaCl,2g MgSO4·7H2O,2M Tris-HCl(pH7.5)25ml,2％明胶5ml，总体积lL)连续稀释cDNA库37℃培养15分钟，然后将该混合物加入2.5ml LB-TOP琼脂糖(0.75％琼脂糖/LB培养基)制成均匀溶液，接种在90mm直径LB培养板(IwakiGlass)(1.5琼脂糖/LB培养基)上。所加溶液室温硬化15分钟，然后42℃培养5小时。计数每块平板上的空斑数，计算噬菌体效价。算得的效价为2.1×1010pfu/ml。如下用实施例2制备的探针进行筛选。
已在mLB培养基中37℃培养了16小时的大肠杆菌Y1090r-和以SM缓冲液稀释至1×105pfu的cDNA库0.6mol在37℃培养15分钟，然后将该混合物加入7.5ml LB-TOP琼脂糖(0.75％琼脂糖/LB培养基)制成均匀溶液。将该溶液接种在140cm2的LB培养板(Nissui Seiyaku)上，室温硬化15分钟，然后42℃培养5小时。确认各板上空斑形成后，转移到尼龙膜上。转移用Nytran 13N(Schleicher andSchuell Co.)进行。滤纸(12.5cm×9.0cm)在蒸馏水中浸10分钟润湿，在Whatmann3MM纸上吸干多余的水，将滤纸放在有空斑形成的培养板上。2分钟后，回收滤纸，空气干燥10分钟。滤纸上噬菌体DNA用0.2M NaOH/1.5M NaCl变性2分钟，然后用0.4M Tris-HCl(pH7.6)/2×SSC中和2分钟，再用2×SSC洗涤2分钟。然后，用GS GENE LINKER(BioRad)通过UV照射将噬菌体DNA固定在膜上。
如下进行杂交和信号检测。将滤纸浸在2×SSC中，用Whatmann 3MM纸吸干多余的水。然后，将滤纸放在杂交袋中，在杂交液(5×SSC，1％封闭试剂，0.1％N-月桂酰肌氨酸和0.02％SDS)中68℃预杂交1小时。接着，倒去袋中的杂交液，加入含10ng/ml DIG标记的cDNA探针的杂交液，55℃先杂交16小时。杂交完成后，滤纸在2×SSC/0.1％SDS溶液中洗涤2次，每次5分钟；再在0.5×SSC/0.1％SDS溶液中洗涤2次，每次15分钟。然后，用DIG缓冲液Ⅰ(100mMTris-HCl,150mM NaCl(pH7.5))去除SDS，进行1分钟，用DIG缓冲液Ⅱ(1％封闭试剂的DIG缓冲液Ⅰ溶液)封闭滤纸30分钟。用DIG缓冲液Ⅰ洗涤滤纸1分钟后，加入以DIG缓冲液Ⅱ稀释5000倍的碱性磷酸酯酶标记的抗DIG抗体(BoehringerMannheim)溶液，抗原与抗体室温反应30分钟。然后在室温下用DIG缓冲液Ⅰ洗涤滤纸2次，每次15分钟。然后用DIG缓冲液Ⅲ(100mM Tris-HCl,100mM NaCl(pH9.5),50mM MgCl2)处理滤纸3分钟，提高Mg2+浓度。加入NBT/BCIP(WAKO Chem.,Co.)以DIG缓冲液Ⅲ配制的溶液进行显色，由此检测到10个阳性克隆。
从培养板上切取对应于这些克隆的空斑，放入含1ml SM缓冲液的试管。搅拌10分钟后，用SM缓冲液连续稀释各份缓冲液溶液，取0.1ml稀释液与0.2ml已在mLB培养基中37℃培养了16小时的大肠杆菌Y1090r-培养物混合。该混合物37℃培养15分钟，然后将其加入2.5 ml LB-TOP琼脂糖制成均匀溶液。将该溶液接种在直径90mm的LB培养板上，室温硬化15分钟，然后42℃培养5小时。得到数个空斑，基本按照与第一次的筛选方法进行第二次筛选。
实施例4新聚集蛋白核苷酸序列的测序从培养板上切取阳性克隆该有的空斑，放入含200μl蒸馏水的试管内，室温搅拌30分钟，然后以15,000rpm离心5分钟，收获上清液。
以所得上清液为模板，用TaKaRa LA PCR试剂盒第2版(TAKARA Syuzo,Co.)通过PCR扩增插入DNA。PCR反应含上清液，27μl；10×LA PCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+),5μl；25mM MgCl2,5μl；dNTP混合物，8μl；20μMλgt11反向引物(SEQ IDNO:9:5′-ttgacaccagaccaactggtaatg-3′),2.5μl；20μMλgt11正向引物(SEQ ID NO:10:5′-ggtggcgacgactcctggagcccg-3′),1μl；LA Taq聚合酶0.5μl；用H2O将体积补足至50μl。用Applied Biosystem Gene Amp PCR9600系统进行30轮PCR:98℃2分钟，68℃5分钟。用1％琼脂糖凝胶上的电泳来验证PCR产物，通过从凝胶中切取进行纯化。该纯化步骤用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia)进行。
将切出的DNA片段插入pCR2.1载体(Invitrogen,TA克隆试剂盒)。将该重组载体转化到Invitrogen,TA克隆试剂盒的TOP10F′细胞内。在LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养转化子，用碱性SDS法抽提3种质粒。
用足量限制性酶剪切所得的DNA，将各DNA片段插入pUC18载体，然后转化XLl-Blue细胞。在LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养转化子，用碱性SDS法抽提质粒。所得CL-P1-2-1质粒含EcoRⅠ-HindⅢ片段和HindⅢ-EcoRⅠ片段；所得CL-P1-3-4质粒含EcoRⅠ-BamHⅠ片段，BamHⅠ-SmaⅠ片段，SmaⅠ-HindⅢ片段，KpnⅠ-Sau3AⅠ片段，Sau3AⅠ-EcoRⅠ片段，EcoRⅠ-KpnⅠ片段和EcoRⅠ-SmaⅠ片段；所得CL-P1-3-7质粒含EcoRⅠ-BamHⅠ片段，BamHⅠ-SmaⅠ片段，SmaⅠ-HindⅢ片段，KpnⅠ-Sau3AⅠ片段，Sau3AⅠ-EcoRⅠ片段，EcoRⅠ-KpnⅠ片段和KpnⅠ-EcoRⅠ片段。制备的引物是Autoread测序试剂盒中的M13通用引物(SEQ ID NO:5)；M13反向引物(SEQ ID NO:6)；以下FITC(Pharmacia，荧光引物)标记的引物，它们用DNA/RNA合成仪合成，然后用Autoread测序试剂盒(Pharmacia)和A.L.F.自动测序仪测定全区域的核苷酸序列。HPP 1:5′-荧光素-cgtgaaaatgaatggaagtgg-3′(SEQ ID NO:11)，HPP 2:5′-荧光素-ttttatccattgctgttcctc-3′(SEQ ID NO:12)，HPP 3:5′-荧光素-ctggcagtccccgaggtccag-3′(SEQ ID NO:13)，HPP 5:5′-荧光素-gctggtccccccggagagcgt-3′(SEQ ID NO:14)图4大致显示了以上核苷酸测序的策略。图4(a)显示所得聚集蛋白的ORF，其中的G-X-Y代表胶原样区。此外，图4(b)中，各引物的名称和核苷酸序列的位置是由测序仪读取的(尽可能显示)，并指明了M13通用引物(U)和M13反向引物(R)。
此外，用Cap位点cDNA确定了5′端附近含转录起始位点的一段核苷酸序列。
用Cap位点cDNA Human Liver(Nippon Gene)，用附带的1RC2引物((5′-caaggtacgccacagcgtatg-3′(SEQ ID NO:15))和392A DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems)合成的TGPl引物(5′-tcttcagtttccctaatccc-3′(SEQ ID NO:16))进行第一次PCR。所用的反应混合物含LA PCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+),2.5 mM MgCl2，各200μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP(都为TAKARA Syuzo,Co.产品)，1μl Cap位点cDNA Human Liver；0.5μl 1RC2引物(都为NIPPON GENE的产品)，和0.5μMTGP1引物，总体积为50μl。如下进行35轮PCR:95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，反应开始前先95℃变性5分钟，最后72℃2延伸10分钟。完成第一次PCR后，进行嵌套PCR。反应以1μl第一次PCR的产物作为模板，使用附带的2RC2引物(5′-gtacgccacagcgtatgatgc-3′(SEQ ID NO:17))和象TGP1引物那样合成的TGP2引物(5′-cattcttgacaaacttcatag-3′(SEQ ID NO:18))，反应组分和程序与第一次PCR的相同(但为25轮)。PCR反应用TaKaRa PCR热循环仪480进行。在琼脂糖凝胶上电泳检验所得的PCR产物，然后切取电泳带，-80℃冷冻10分钟，15000rpm离心10分钟，然后通过乙醇沉淀纯化上清液。
将纯化的DNA片段插入pT7Blue载体(Novagen)，用该载体转化到XL1-Blue细胞。转化子培养在LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)上，用碱性SDS法抽提质粒，然后用自读测序试剂盒(Pharmacia)和A.L.F.DNA测序仪测定核苷酸序列。所用的引物是自读测序试剂盒附带的M13通用引物(SEQ ID NO:7)和M13反向引物(SEQ ID NO:8)。
结果确认，实施例3制得的新聚集蛋白的cDNA克隆含2024个碱基，其中包括1026个碱基的ORF(开放读码框)，该框编码SEQ ID NO:2的342个氨基酸。
接着，对GenBank库DNA和氨基酸序列的同源性检索发现，所得蛋白质的氨基酸序列与已知聚集蛋白的不相同，它来自一种新的蛋白质。
此外，将本发明新聚集蛋白的氨基酸序列与已知的3种聚集蛋白比较。排列对比情况如图5和6所示。与图2和3一样，加框的是同源氨基酸残基。以上排列对比提示，所得新蛋白质与已知聚集蛋白同源，属于聚集蛋白家族。
实施例5新聚集蛋白的基因组Southern分析进行基因组Southern分析是为了确定含实施例4所鉴定cDNA序列的新聚集蛋白是单拷贝基因还是多拷贝基因。
来自人血的4μg基因组DNA(Promega)用以下限制酶之一消化(1)EcoRⅠ,(2)XbaⅠ,(3)HindⅢ,(4)PstⅠ,(5)BgⅢ或(6)BamHⅠ，然后在0.8％琼脂糖凝胶上以100mA电泳3小时。然后，将DNA转移到尼龙膜上(Nytran 13N)，用来分析。
转移步骤为先将电泳凝胶在100ml 0.25N HCl中浸10分钟，用蒸馏水洗3次，在100ml变性溶液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)中浸2次，每次15分钟，接着在100ml中和溶液(0.5M Tris-HCl,3M NaCl(pH 6.8))中浸30分钟，由此完成脱嘌呤、变性和中和。然后，用真空印迹系统(Toyobo工程，VB-30)进行DNA转移。该步中，所用的膜是已经过在2×SSC中浸5分钟又在20×SSC中浸5分钟预处理的膜，垫块事先浸在20×SSC中。转移结束后，用UV照射固定DNA。
用于Southern分析的杂交探针是对应于实施例4所得新聚集蛋白cDNA序列ORF一部分的DNA探针gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagcaatggataaaa aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g(SEQ ID NO:21)，用前述PCR DIG探针合成试剂盒和引物5′-gaagacaagtcttcaactcttg-3′(SEQ IDNO:19)和5′-ctctgagtctgtgaggccgatc-3′(SEQ ID NO:20)标记该探针。杂交前，将探针煮沸10分钟，以干冰/乙醇急冻5分钟。首先，转移膜在2×SSC中浸5分钟，然后在10ml ExpressHyb杂交液(Clonetech)中，65℃预杂交30分钟。接着，用ExpressHyb杂交液稀释前述冷冻探针至10μg/ml，取2ml该溶液在65℃杂交1小时。
杂交后，如下洗膜在20ml 2×SSC溶液中室温下振荡2次，每次5分钟，然后在65℃在0.2×SSC,0.1％SDS溶液中2次，每次15分钟。接着，为了去除SDS，用50ml DIG缓冲液Ⅰ(100mM Tris-HCl,150mM NaCl(pH 7.5))室温下洗膜2次，每次1分钟，然后在50ml DIG缓冲液Ⅱ(封闭剂以DIG缓冲液Ⅰ配制的1.5％溶液)中室温下封闭1小时。然后，用碱性磷酸酯酶标记的抗DIG抗体10ml(已用含0.2％Tween20的DIG缓冲液Ⅰ稀释了5000倍)处理膜，30分钟，然后室温下在含0.2％Tween20的50ml DIG缓冲液Ⅰ中振荡洗涤2次，每次20分钟。室温下将该膜在10ml DIG缓冲液Ⅲ中浸洗2次，每次3分钟，然后将其放入杂交袋，向其中加入以DIG缓冲液Ⅲ稀释100倍的CSPD(注册名，Boehringer Mannheim化学发光底物)，使得该溶液能在整张膜上展开。然后，让膜曝光Instant胶片T612(Polaroid)。
结果，我们推测所得新聚集蛋白的基因是单拷贝基因，因为，如图7泳道所示，相应基因组DNA经各种限制酶消化后只能测得一两个信号。
实施例6新聚集蛋白人组织特异性表达分布的分析进行RT-PCR分析测定本发明新聚集蛋白mRNA在各种人组织内的表达。
PR-PCR用RNA LA PCR试剂盒(AMV)1.1版(Takara Syuzo,Co.)进行，以各种人组织[(1)脑，(2)心脏，(3)肾，(4)脾脏，(5)肝，(6)小肠，(7)肌肉，(8)睾丸，(9)胎盘或(10)结肠(OriGene Technologies,Inc.)]的RNA作为模板。首先，在以下反应混合物中进行逆转录。所述反应混合物含5mM MgCl2,1×RNA PCR缓冲液，lmM dNTP混合物，1U/μl RNA酶抑制剂，0.25U/μl逆转录酶，0.125μM寡聚dT-衔接子引物，RNA 1μg，用无RNA酶的蒸馏水将总体积调定为20μl。同时，准备不含逆转录酶的反应混合物作为阴性对照。将反应混合物装入0.2ml的试管，用TaKaRa PCR热循环仪PERSONAL(TaKaRa Syuzo,Co.)进行1轮PCR:42℃30分钟，99℃5分钟，5℃5分钟。用所得的PCR产物在以下溶液中进行LA PCR:2.5mM MgCl2,1×LA PCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+),2U TaKaRa LA Taq，加入0.2μM的两种引物(RT-PCR引物U:5′-gtgcccctggccctgcagaatg-3′(SEQ ID NO:22)和RT-PCR引物R:5′-gcatatcaccctggggaacattttag-3′(SEQ ID NO:23))，这两种引物能够扩增从新聚集蛋白颈部到糖识别区的cDNA，用无菌蒸馏水将总体积调定为80μl。反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，然后用溴乙锭溶液(0.1μg/ml)染色，用燃烛仪(transilluminator)检验电泳方式，鉴定表达的组织。
此外，为了比较各组织的表达量，RT-PCR扩增各组织β-肌动蛋白的一部分，校正RNA量。该RT-PCR的进行与前述逆转录反应和PCR反应相同，并如前所述在1％琼脂糖凝胶上电泳鉴定。逆转录反应混合物含5mM MgCl2,1×RNA PCR缓冲液，1mM dNTP混合物，1U/μl RNA酶抑制剂，0.25U/μl逆转录酶，2.5μM随机9聚物，RNA 10ng，用无RNA酶的蒸馏水将总体积调至60μl。进行1轮PCR:30℃10分钟，42℃15分钟，99℃5分钟，5℃5分钟。所得PCR产物用在以下反应混合物中进行PCR:1×LA PCR缓冲液Ⅱ(无Mg2+),2U TaKaRa LA Taq,0.25μM人β-肌动蛋白有义引物5′-caagagatggccacggctgct-3′(SEQ ID NO:24),0.25μM人β-肌动蛋白反义引物5′-tccttctgcatcctgtcggca-3’(SEQ ID NO:25)，用无菌蒸馏水将总体积调至40μl。进行30轮PCR:94℃15秒，68℃30秒。
结果见图8，提示本发明新聚集蛋白的mRNA在胎盘(泳道9)，脾脏(泳道4)和肾(泳道3)内表达。显然，胎盘内的表达尤其高。
实施例7各种动物的新聚集蛋白的基因组Southern分析为了确定本发明聚集蛋白基因在其他动物中的保守性，进行基因组Southern杂交分析。
分析所用的杂交探针是DIG标记的DNA探针，对应于上述新聚集蛋白ORF的cDNA序列，用上述PCR DIG探针合成试剂盒(Boehringer Mannheim)进行标记。制备分析用膜用限制酶EcoRⅠ处理以下生物的基因组DNA:(1)人(Promega)，(2)猴(Clonetech)，(3)大鼠(Promega)，(4)小鼠(Promega)，(5)狗(Clonetech)，(6)牛(Promega)，(7)家兔(Clonetech)和(8)鸡(Promega)，在琼脂糖凝胶上电泳，然后转移到Nytran 13N膜上，用UV照射固定。
按以下过程，用上述探针和膜进行杂交。首先，膜在2×SSC中浸5分钟，然后在10ml ExpressHyb杂交液中65℃预杂交30分钟。然后，将如前所述冷冻的探针以ExpressHyb杂交液稀释至10ng/ml，以2ml该稀释探针溶液在65℃杂交1小时。
杂交后，洗膜室温下在20ml 2×SSC,0.1％SDS中振荡2次，每次5分钟，然后68℃在20ml 0.2×SSC,0.1％SDS中振荡2次，每次15分钟。接着，室温下用DIG缓冲液Ⅰ洗膜2次，每次1分钟，洗去SDS，然后室温下在50ml DIG缓冲液Ⅱ中封闭1小时。然后，膜以10ml碱性磷酸酯酶标记的抗DIG抗体(以DIG缓冲液Ⅰ稀释5000倍，含0.2％Tween20)处理30分钟，室温下在50ml含0.2％Tween20的DIG缓冲液Ⅰ中振荡洗涤20分钟。室温下，膜在10ml DIG缓冲液Ⅲ中浸洗2次，每次3分钟，然后将其放入杂交袋，向其中加入以DIG缓冲液Ⅲ稀释100倍的CSPD，使溶液在整张膜上展开。然后，使膜曝光Instant胶片T612。
图9显示了分析结果，除泳道8之外的所有泳道都测得了DNA信号，泳道8中的是鸡DNA。由此说明，本发明的新聚集蛋白在哺乳动物间保守。
实施例8新聚集蛋白的遗传分析为了确定本发明聚集蛋白与已知聚集蛋白之间的遗传位置关系，根据所得新聚集蛋白的DNA序列进行分析，并制作了系统发生树。
分析所选的聚集蛋白是图10聚集蛋白家族内的几种蛋白质(图10中，CL-L1是本发明发明人分离自人肝脏的聚集蛋白(参见，日本专利申请Hei 10-11281))。由GenBank库检索得到各氨基酸序列，然后用已知含凝集素区的区域进行Clustalw法多重排列对比，从而可用Phylip3.75c版包装程序通过N-J(相邻连接)法得出系统发生树。
图10的结果显示，虽然SP-D、牛聚集蛋白43和牛共凝集素构成一簇，MBP和SP-A各成一簇，本发明的聚集蛋白基因和CL-L1相似，不属于以上任何一簇。而且，我们推测，本发明聚集蛋白可能构成独特的一簇，在遗传上与包括CL-L1在内的各种已知聚集蛋白都不同。
实施例9新聚集蛋白单克隆抗体的产生将100μg新聚集蛋白溶于100μl PBS(-)(不含钙离子和镁离子的PBS)，将此溶液与100μl Freund完全佐剂混合，制备成乳液，用此乳液腹膜内注射2只BALB/c小鼠(雄性，8周)。3周后，进行类似的第二次免疫，但将Freund完全佐剂换成Freund不完全佐剂。又2周后，回收血清，测定抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠，1周后，进行与第二次免疫相似的最后一次免疫。最后免疫后5天，取出脾脏，制备细胞悬液。进行细胞融合将2×107NS-1骨髓瘤细胞与1×108所制脾细胞混合。混合物室温下1,600rpm离心6分钟后，除上清液，松动留下的细胞，用1分钟加入1ml聚乙二醇(PEG)，然后室温下搅拌1分钟。接着，用1分钟，边温和搅拌，边滴加1ml已在37℃(培养过的培养液(Iscove’s培养基，含15％FCS,2mM L-谷氨酰胺溶液，0.05mM 2-巯基乙醇溶液)。重复以上过程，再用3分钟，用8ml上述溶液重复该过程。松动沉淀，向其中加入100ml 5×106细胞/ml胸腺细胞悬液(作为饲养细胞提高杂交瘤形成速度，以含HAT的杂交瘤生长培养液悬浮)，制备成悬浮液。将该悬浮液加入96孔培养板，0.1ml/孔，在CO2培养箱内5％CO2中37℃培养。
如下挑选杂交瘤。培养开始后1天，加入150μl HAT培养液(含HAT的杂交瘤生长培养液)，然后培养2天。然后，用150μl HAT培养基替换150μl原培养基，在此后的3天和7天后同样地更换培养基。4天后，收集100μl培养上清液，通过测定新聚集蛋白抗体的效价来进行筛选。接着，用毛细管将抗体阳性克隆从96孔板转移到24孔板上。各孔中已预先加有0.5ml HT培养液(含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的杂交瘤生长培养液)。培养3天后，收集部分培养液，再次测定抗体效价，最后，克隆并冷冻保存测定为抗体阳性的细胞。为了进行克隆，阳性细胞在胸腺细胞悬液中有限稀释至1细胞/ml，各取0.2ml加入96孔板。培养10天后，测定形成单集落的孔的抗体效价，选择抗体效价较高的两个集落。对这两个克隆进行再克隆。这次的方法与第一次克隆相同。然后，扩展培养抗体阳性细胞。首先，将细胞转移到24孔板上培养3天，然后转移到25cm2烧瓶内培养3天，再转移到225cm2烧瓶内培养3天，收集上清液，制得单克隆抗体。
此外，为了由腹水制备单克隆抗体，将克隆的杂交瘤稀配成1×107细胞/ml，给每个小鼠腹膜内注射1ml。1周后，用乙醚麻醉腹部肿大的小鼠，收集腹水。将腹水转移到促进凝聚型离心管中，加入血清分离剂，室温下静置30分钟，3000rpm离心5分钟。回收上部腹水，用硫酸铵分离纯化获得抗体。
实施例10用抗小鼠抗人新聚集蛋白的抗体进行的ELISA抗小鼠抗人新聚集蛋白的抗体以包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)稀释至10μg/ml，将该抗体溶液分布到96孔ELISA板上，每孔100μl。4℃培养过夜。以300μl洗涤液(TBS/T液(25mM Tris-HCl,0.14M NaCl,5mM KCl,0.05％Tween 20,pH 7.4))洗孔3次。此后的洗涤都如此进行。在各孔中加入300μl5％脱脂奶/TBS/T液，多孔板37℃放置1小时。洗涤后，向其中加入100μl测试样品和新聚集蛋白标准品(1μg/ml，多孔板37℃放置1小时。其中，测试样品是适当稀释的，标准品经2倍连续稀释，最高浓度为0.02μg/ml。洗涤后，加入100μl生物素标记的抗兔抗人新聚集蛋白抗体，多孔板37℃放置30分钟。再次洗涤，然后加入100μl生物素链霉亲合素溶液，多孔板37℃放置30分钟。再次洗涤后，加入100μl 3,3′,5,5′-四甲基二氨基联苯溶液，多孔板室温下放置30分钟，然后加入1N磷酸100μl终止反应，测定450nm处的吸光度。
用以上方法得到标准品的标定曲线，从而完成了新聚集蛋白的定量测定。
实施例11对人免疫原性降低的抗体的产生首先，用实施例9方法制备的小鼠杂交瘤制备mRNA，用噬菌体载体制备cDNA文库，然后进行cDNA克隆。以恒定区的cDNA为探针克隆小鼠抗体cDNA，然后用限制酶分析插入的cDNA，然后测定该抗体cDNA的序列。
接着　表达嵌合抗体，根据抗体结合活性判断所克隆的抗体基因内是否发生突变，这也可以作为阳性对照用于研究所表达人源化抗体的结合活性。在表达嵌合抗体时，可以采用一种盒式表达载体，其中，人抗体H链和L链的恒定区被克隆在同一个载体内。测定嵌合抗体的结合活性，确定该基因的确是克隆的小鼠抗体基因，然后构件人源化抗体基因。在制备人源化抗体时，必须设计用来构件的基因，这与产生嵌合抗体的方法不同。根据测得的小鼠可变区基因的核苷酸序列，用数据库检索高度同源的人抗体可变区氨基酸序列。找到除CDR序列外同源性达70-80％的序列，去除所选人抗体可变区(框架区)内的CDR序列，在该区域移植以小鼠抗体CDR序列，于是，用蛋白质结构分析软件进行分子模拟造型。将人框架区序列内相应H链和L链的一些氨基酸还原成小鼠型的，这样，H链和L链上通过造型与抗原结合的总共6个CDR的构型，在三维结构上，与原来的小鼠单克隆抗体更相似。此时，还原成小鼠型的氨基酸越少越好，因为这样得到的抗体与人抗体更接近。根据这样的分子造型，设计并表达了10种不同的人源化抗体基因，必须比较它们的活性，因为来自一个模型的人源化抗体再现相当于小鼠单克隆抗体的100％活性的几率很低。
完成基因设计后，就开始实际构建基因。克隆一个含人源化抗体H、L链恒定区基因的盒式表达载体，然后用COS细胞等进行瞬时表达，用ELISA法测定培养上清液的抗体活性。挑选出活性较强的几种，用稳定表达载体和COS细胞等宿主细胞构建稳定表达细胞，从而由培养上清液制备纯化抗体。
实施例12新聚集蛋白表达载体pNOW1-hCL-P1的构建首先，用Zymoreactor(ATTO Corp.,)扩增新聚集蛋白从起始密码子到终止密码子的序列SEQ ID NO:1，所用引物的核苷酸序列为aaggaaaaaa gcggccgcatgcaacaagatttgatgagg(SEQ ID NO:26)和gctctagatt ataatgcagatgacagtac(SEQ ID NO:27)。
用限制酶NotⅠ和XbaⅠ消化所得的新聚集蛋白的cDNA，得到对应于新聚集蛋白cDNA 670-1698bp的部分cDNA，这可作为插入片段。
接着，用限制酶NotⅠ和XbaⅠ消化表达载体pNOW/CMV-A(参见已公开的待审日本专利申请No.H10-179169(1998))，用DNA连接试剂盒(Takara shuzo,Co.,Ltd.)，将以上插入片段插入巨细胞病毒启动子(pCMV)下游，即Pcmv(巨细胞病毒主抗原早期启动子)和BGP聚A(牛生长激素聚腺苷酸化信号)之间。由此获得的表达载体称为pNOW1-hCL-P1(hCL-P1编码新聚集蛋白的核苷酸序列)，图11显示了其结构。
实施例13新聚集蛋白表达克隆的选择(1)将表达载体pNOW1-hCL-P1引入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(dhfr-)制备加有10％胎牛血清(FCS,GIBCO)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶)，在其中掺入DHFR基因缺陷型DG44 CHO细胞(dhfr-)，制成1×105细胞/ml，将其接种到直径60mm的培养皿中，5％二氧化碳下37℃培养24小时。除去上清液，加入含100μl将5μg DNA(表达载体pNOW1-hCL-P1)与lipofectin溶液(DOTAP脂质转染试剂；Boeringer Mannheim)与10％FCS混合预先另外混合而成的溶液的IMDM至6ml，然后加入次黄嘌呤(终浓度为10nM)(GIBCO)和胸腺嘧啶(终浓度为100nM)(GIBCO)，然后培养16小时，在dhfr-CHO宿主细胞内导入表达载体pNOW1-hCL-P1。然后，去除培养上清液，加入6ml含10％FCS，次黄嘌呤和胸腺嘧啶的IMDM，然后培养24小时。
(2)获得新霉素(G418)抗性的CHO细胞含表达载体pNOW1-hCL-P1的细胞培养24小时，用胰蛋白酶消化，从培养皿上回收，清点细胞数，将细胞悬浮在含400μg/ml新霉素(G418)和10％FCS的IMDM中，将此混合物接种(分散)在10块96孔微滴板上，0.1ml/孔。板在5％二氧化碳下37℃培养2周，存活的即为G418抗性细胞(克隆)。
测定这些G418抗性细胞产生hCL-P1的能力。挑选出产生hCL-P1的那些克隆，分别接种到25cm2的培养瓶中。培养至铺满(约3×106细胞/25cm2培养瓶)。去除各培养瓶中的上清液，加入以上组成的含10％FCS的2ml IMDM，继续培养4天，回收培养上清液。测定所收集上清液中hCL-P1的产量(hCL-P1重组人新聚集蛋白)。需要指出的是，可以根据Suzuki等(Y.Suzuki等，“哺乳动物细胞内表达的重组牛共凝集素的鉴定”，生物化学生物物理学研究通讯238:856-863(1997))的方法定量测定hCL-P1的产量，其中使用抗本发明在大肠杆菌内表达的hCL-P1，聚集蛋白(以同样方法在大肠杆菌内表达)糖识别区(CRD)和颈区的抗兔多克隆抗体，以及作为对照的hCL-P1(定量参照)。
(3)获得甲氨蝶呤抗性的CHO细胞实施例13(2)所得的产hCL-P1克隆经传代和稳定化后，在培养基中加入低浓度的甲氨蝶呤(MTX)，进行基因扩增。
首先，将所选的各细胞克隆与经透析的含5nm MTX,400μg/mlG418和10％FCS的IMDM(JRH Bioscience)混合，然后接种(分散)到10块96孔微滴板上，0.1ml/孔。细胞在5％二氧化碳下37℃培养2周，存活的细胞就是5nm MTX抗性细胞(克隆)。
测定这些5nm MTX抗性克隆产生hCL-P1的能力。挑选出产生hCL-P1的那些克隆，分别接种到25cm2的培养瓶中，培养2周后达到铺满。去除各培养瓶中的上清液，加入以上组成的含10％FCS的2ml IMDM，继续培养4天，回收培养上清液。测定其中hCL-P1的产量。需要指出的是，可用实施例10所述的ELISA法测定hCL-P1的产量。
实施例14转基因小鼠的产生聚集蛋白被认为在基础免疫中起重要作用。此外，因为认为本发明的新聚集蛋白构成与常规聚集蛋白无遗传联系的新一簇，为了获得免疫方面的新认识以及为阐明新聚集蛋白作用机制提供重要工具，制造了非人的转基因动物。
构建能够在小鼠中表达本发明人源新聚集蛋白的质粒。首先，通过SalⅠ/PstⅠ消化，从含鸡β-肌动蛋白启动子和位于其上游的巨细胞病毒增强子的哺乳动物表达载体(Niwa等，基因108:193-200,1991)中切出一个2.3kb的片段，将其插入克隆载体pBluescript(Stratagene)的SalⅠ/PstⅠ位点，构建成pBsCAG-2载体。该2.3kb片段中含有上述增强子/启动子和兔β-珠蛋白基因的一部分(第二内含子，第三外显子和3′-非编码区)。将上述hCL-P1的cDNA(SEQ ID NO:1,670-1698)插入上述第三外显子的EcoRⅠ位点，构建成用于在转基因小鼠内表达的质粒pβA/hCL-P1。
接着，用碱性SDS法大量制备质粒pβA/hCL-P1，用CsCl平衡密度梯度超离心法纯化质粒。用SalⅠ/BamHⅠ消化pβA/hCL-P1来分离基因，切去载体部分。然后，通过琼脂糖凝胶电泳将基因与载体DNA片段分离，从凝胶上切取引入DNA，用GeneClean Ⅱ试剂盒纯化。乙醇沉淀后，将DNA片段溶于DNA注射液(10mM Tris-HCl(pH7.5),0.25mM EDTA)中，15000rpm离心5分钟，回收上清液。用分光光度计测定吸光度，计算DNA浓度，将浓度调至500DNA分子/pl，将溶液稀释至50ml,-20℃保存，直到将此DNA引入小鼠一期胚胎。
接着，制备用于DNA注射的小鼠受精卵。首先，为了在雌性小鼠内诱导超量排卵以便收集受精卵，每隔48小时腹膜内注射5IU/个的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛促性腺激素(hCG)，让雌性小鼠与雄性小鼠同笼。打开有阴道栓形成的雌鼠的腹腔，摘取子宫管，用BWW-Hepes培养基(含NaCl 102.2mM,KCl4.78mM,KH2PO41.19mM,CaCl21.17mM,MgSO41.19mM,NaHCO34.76mM,Hepes 15mM，乳酸钠25mM，丙酮酸钠0.25mM，葡萄糖5.56mM,BSA 4 mg/mL,EDTA 0.1mM和酚红0.00025％)洗涤，然后，放在含300mg/ml透明质酸酶的BWW-Hepes培养基中。在体视显微镜下用钟表镊切开子宫管壶腹，使受精卵排入培养基，用玻璃吸量管吸取，在BWW-Hepes培养基中洗涤5次。然后，将受精卵放在一滴BWW-Hepes培养基中，覆盖以矿物油，在培养箱中5％CO2下37℃培养。
然后，将DNA注入受精卵的前核。在-60mm的培养皿中，形成一滴BWW-Hepes培养基和DNA溶液(500分子DNA/pl)，覆盖以矿物油。使用分别配有注射吸量管和固定吸量管的注射器，受精卵进入BWW-Hepes培养基上方的液滴内。将DNA吸入注射吸量管，将注射器调节为略带正压，这样，DNA可以连续地从嘴尖流出。用固定吸量管吸住受精卵，使雄性前核位于注射吸量管一侧，将目镜的放大倍数调为40倍，然后聚焦于前核，将注射吸量管的嘴尖位置调节至与前核同平面。
然后，将注射吸量管的尖嘴刺入前核，注入DNA溶液。证实核膨大后，快速抽出吸量管，将注射后的受精卵移动到下方液滴，注意避免与未处理的卵子混合。一次注射30个卵子，然后移动到BWW-Hepes培养基液滴内，在培养箱中5％CO2下37℃培养。
培养后，将受精卵移植到子宫内。用稀释剂将戊巴比妥注射液稀释10倍(终浓度为5mg/ml)，腹膜注射0.01ml/kg该溶液，用以麻醉假孕小鼠。用刚才吸住卵子的吸量管在每个打开的子宫内注入约30个卵子，附带的培养液越少越好(0.5-1.0ml)。将卵巢和子宫复位到体内，缝合切口。然后，继续饲养，越19天后产下小鼠。
通过如下斑点印迹杂交来筛选转基因小鼠。在出生后4周，给所得的小鼠断奶，在麻醉状态下在距尾端1cm处切开，将切片放在一支1.5ml的Eppendorf试管内。加入0.5ml含0.5mg/ml蛋白酶K的STE缓冲液(50mM Tris-HCl,100mMEDTA(pH7.5),0.5％(w/v)SDS)，在培养箱内55℃振荡过夜。将100μl尾部溶液转移到一支新的试管内，加入200μl TE饱和苯酚和110μl TE缓冲液，然后用涡流搅拌器混合5分钟，混合物在室温下以15,000rpm(20,000×g)离心5分钟。将200μl所得水层转移到一支新的试管内，加入200μl苯酚/氯仿，然后涡流搅拌5分钟，混合物在室温下以15,000rpm(20,000×g)离心5分钟。将上清液转移到一支新的试管内，加入20μl 3M乙酸钠溶液和500μl乙醇，然后充分振荡混合，直至可以看到DNA丝状沉淀，然后4℃,15,000rpm(20,000×g)离心5分钟。去除上清液，用70％乙醇洗涤，干燥5分钟，然后将DNA沉淀溶于100μl 2M NaCl,0.1M NaOH溶液中。沸水浴中加热5分钟，在冰水中快速降温DNA，使得DNA变性。组装96孔的多支管，将DNA点在尼龙膜上，然后空气干燥，80℃加热2小时。以常规方法进行杂交，用引入的DNA中不带小鼠序列的一部分作为探针。确认有信号的个体为转基因小鼠。
在如此将基因注入受精卵时，约90％的受精卵可存活。将所有存活的卵子植入受主，约每个动物25个卵子，使得受主怀孕，约19天后产下幼鼠。对幼鼠进行基因分析，确认存在引入的基因。此外，由这些转基因小鼠获得F1代小鼠，还检测了转基因的传递率。
实施例15敲除小鼠的制造首先，为了协助制导DNA的构建，在来自C57BJ/6J小鼠的ES细胞内，在目标基因一部分的一个外显子部分插入一个作为可选标记的新霉素抗性基因，目标基因编码本发明新聚集蛋白的小鼠同源物。接着，如下通过电穿孔将DNA引入ES细胞。用新鲜ES培养基(含20％FCS的80％DMEM培养基，1mM丙酮酸溶液，0.1mM非必需氨基酸溶液和1mM 2-巯基乙醇)更换对数生长期(90mm的培养皿)ES细胞的培养基，继续培养4小时，然后去除培养基，用PBS(-)洗涤，细胞用0.1％胰蛋白酶处理3分钟。将1ml培养基加入细胞，然后分散为单细胞，4℃600rpm离心5分钟，去除上清液，将细胞悬浮于5ml PBS(-)，计数细胞。细胞再次4℃600rpm离心5分钟，去除上清液，将细胞悬浮于5ml PBS(-)，成为1.1×107细胞/ml。从该1.1×107细胞/ml的悬浮液中，取0.9ml转移到比色杯中，加入1μg/μlDNA(用于制导)溶液25μl(25μg)，室温下静置5分钟。在500μF，230V条件下，用基因脉冲仪进行电穿孔，然后静置5分钟，将细胞悬浮在ES培养基(-G418)中，各1/4接种在有饲养细胞的4个培养皿(90mm)中。电穿孔完成后，继续培养24小时，将培养基换成含150μg/ml G418的ES培养基(活性型)，以后每天更换培养基。7天后，如下进行克隆。
从有菌落出现的90mm培养皿中取出培养基，加入10ml PBS(-)中。在体视显微镜下观察，用尖嘴刮取形状良好的菌落，将各菌落吸移到96孔板上，该板上已实现加有70μl 0.1％胰蛋白酶溶液。孔板37℃放置4-5分钟，然后进行胰蛋白酶消化，在用8道Pipetman充分抽动混合后，将细胞接种到-24孔板上的4孔内，其中已加有0.8ml含75μg/ml G418的ES培养基。培养24小时后，将培养基换成含75μg/ml G418的ES培养基。3天后，向对数生长期的克隆内加入100μl0.1％胰蛋白酶溶液，加入100μl ES培养基，抽动，然后将克隆转移到一圆底96孔板上。48个克隆都被处理过时，取20μl进行培养，其余180μl用于PCR。
96孔板内用于PCR的克隆4℃1200rpm离心5分钟后，去除培养基，细胞用PBS(-)洗涤3次。用8道Pipetman在克隆内加入100μl溶解液(100mM Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,0.2％(w/v)SDS,100mM NaCl,100μg/ml蛋白酶K)，55℃蛋白酶K处理1小时。用胶带将孔板密封，在95℃培养15分钟，以使蛋白酶K彻底失活。孔板在4℃冷却5分钟，收集2-3μl样品进行PCR，并用于第一次筛选(将剩余溶液保存于-20℃)。样品可以4个克隆组成一组，用有义引物(atgcaacaagatttgatgagg(SEQ ID NO:28)和反义引物(cctacccggtagaattgacc(SEQ IDNO:29))进行PCR，通过电泳检测目的基因来鉴定阳性组。其余样品-20℃保存。阳性组的克隆类似地作PCR鉴定。接着，筛选用于培养的克隆。将20μl用于培养的克隆接种到每行4孔的24孔板上(吸附有饲养细胞)，各孔都加满后，将孔板放在CO2培养箱中培养，最后，将一个克隆分入3孔，再接种到6孔板上(吸附有饲养细胞)。
用夹心法产生嵌合小鼠品系将引入了基因的ES细胞夹在两片2.5天的小鼠胚胎(8细胞期胚胎)之间，所述胚胎是如下制备的。
与2.5天的ES细胞进行贴附的6天前，给用来收集卵子的C57BL 6J雌鼠腹膜内注射5IU的PMSG(孕马血清促性腺激素)。4天前，腹膜内注射hCG(人绒毛促性腺激素)，与雄鼠交配。3天前，根据阴道栓的形成证实交配，让一只发情期的用于假孕的雌鼠与一只做过输精管结扎的雄鼠交配。根据阴道栓的形成证实交配，由此认定该雌鼠假孕。在贴附当天，通过颈椎脱臼来麻醉用来收集卵子的雌鼠，取出子宫管和子宫。用BWW-Hepes培养基灌注子宫管和子宫，收集2.5天的胚胎(8细胞期胚胎又称桑葚胚)，转移到一滴BWW培养基中，在CO2培养箱中培养(5％CO2,37℃)。收集卵子，将2.5天的胚胎转移到一滴酸性Tyrode′s溶液(200μl)中，放置1-2分钟，然后，当透明区溶解时，卵子立即用BWW-Hepes培养液洗涤6次，并与ES细胞贴附。
如下制备ES细胞。在贴附当天，培养在饲养细胞上的ES细胞用PBS(-)洗涤2次，以0.5％胰蛋白酶溶液消化2分钟，从培养皿上刮取，成为几十个细胞的细胞团。向细胞添加ES培养基(-G418)以灭活胰蛋白酶，离心后，将细胞悬浮在ES培养基中。将它们接种在覆盖有0.1％明胶的培养皿上，在CO2培养箱中放置15分钟。收集不与培养皿贴附的细胞，用这些细胞制备聚集的嵌合物。
如下进行2.5天的胚胎与ES细胞的贴附。首先，用针在培养皿底部造一个孔。在孔上覆盖以20μl BWW培养基，再覆盖以矿物油。然后，将培养皿放在CO2培养箱中，使培养基与周围条件达到平衡。在体视显微镜下，选出以10-20个形态良好的ES组成的细胞团。将这些ES细胞团逐一加入以上制备的孔中。每孔中加入2个透明区已消失的2.5天的胚胎，使之与ES细胞团贴附。培养皿在CO2培养箱中培养过夜，得到一个胚泡，其大小大致相当于2个细胞。
接着，将3.5天的胚胎植入子宫。腹膜内注射戊巴比妥注射液(50μg/g体重)麻醉假孕小鼠(交配后2.5天)。切开麻醉小鼠的背部，抓住脂肪块，从中取出子宫。用吸量管吸取10-15个通过培养过夜制备的胚泡或桑葚胚，附带有少量(0.5-1.0μl)培养液，用注射针头刺穿子宫靠近子宫管的部分，插入一根吸量管，然后通过此切口注射，将这些胚胎植入子宫。将子宫复位到体内，缝合切口，约18天后，产下幼鼠。
确认基因传递到该品系后，让彼此异源的小鼠杂交，从而同源化，由此得到不表达本发明新聚集蛋白类似物的目标敲除小鼠。如上所述，本发明提供了具有聚集蛋白特征性结构但与已知聚集蛋白不同的新聚集蛋白及编码该新聚集蛋白的基因，已经证明，它们表现出抗菌、抗病毒的活性。
本发明提供的序列信息可用于研究生物防御系统的机制，并可提供利用新聚集蛋白生物活性的医学实验工具。例如，可以提供能表达新聚集蛋白的载体，含此表达载体的宿主细胞，新聚集蛋白的抗体，以及筛选新聚集蛋白相关分子的探针。
此外，还提供了非人转基因动物和非人基因敲除动物，它们可作为疾病的动物模型用于研究新聚集蛋白和/或其衍生分子的功能或表达调节，用于阐明与人体内表达此类分子的细胞相关的疾病的机制，用于药物的筛选及其安全性试验。
序列表<110>扶桑药品工业株式会社<120>新的聚集蛋白<130>99P147WO<150>JP 10-237611<151>1998-08-24<160>29<210>1<211>2024<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(670)..(1695)<400>1gtcacgaatc tgcagcaaga taccagcgtg ctccagggca atctgcagaa ccaaatgtat60tctcataatg tggtcatcat gaacctcaac aacctgaacc tgacccaggt gcagcagagg 120aacctcatca cgaatctgca gcggtctgtg gatgacacaa gccaggctat ccagcgaatc 180aagaacgact ttcaaaatct gcagcaggtt tttcttcaag ccaagaagga cacggattgg 240ctgaaggaga aagtgcagag cttgcagacg ctggctgcca acaactctgc gttggccaaa 300gccaacaacg acaccctgga ggatatgaac agccagctca actcattcac aggtcagatg 360gagaacatca ccactatctc tcaagccaac gagcagaacc tgaaagacct gcaggactta 420cacaaagatg cagagaatag aacagccatc aagttcaacc aactggagga acgcttccag 480ctctttgaga cggatattgt gaacatcatt agcaatatca gttacacagc ccaccacctg 540cggacgctga ccagcaatct aaatgaagtc aggaccactt gcacagatac ccttaccaaa 600cacacagatg atctgacctc cttgaataat accctggcca acatccgttt ggattctgtt 660tctctcagg atg caa caa gat ttg atg agg tcg agg tta gac act gaa gta711Met Gln Gln Asp Leu Met Arg 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Leu Glu Glu Arg Phe Gln Leu Phe130 135 140Glu Thr Asp Ile Val Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His145 150 155 160His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Glu Val Arg Thr Thr Cys165 170 175Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp Asp Leu Thr Ser Leu Asn ASn180 185 190Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser Val Ser Leu Arg Met Gln Gln195 200 205Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Val Ala Asn Leu Ser Val210 215 220Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Val Asp Ser Lys His Gly Gln Leu Ile225 230 235 240Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg245 250 255Gly Asp Arg Gly Ser Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly260 265 270Gln Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu275 280 285Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Lys290 295 300Gly Ser Lys Gly Ser Gln Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly305 310 315 320Lys Pro Gly Pro Gln Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro325 330 335Pro Gly Lys Glu Gly Leu Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Phe Gln340 345 350Gly Leu Gln Gly Thr Val Gly Glu Pro Gly Val Pro Gly Pro Arg Gly355 360 365Leu Pro Gly Leu Pro Gly Val Pro Gly Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro370 375 380Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Val Val Pro Leu Ala Leu Gln385 390 395 400Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp Asn Gly Cys Pro Pro His Trp405 410 415Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Lys Glu Ile420 425 430Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Val435 440 445Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gln Gln Trp Ile Lys Lys Gln Met Val450 455 460Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn465 470 475 480Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys485 490 495Ala Gly Gln Pro Asp Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro Gly Glu Asp500 505 510Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe Gln Cys Glu515 520 525Asp Val Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr Val Leu Ser530 535 540Ser Ala Leu545<210>3<211>27<212>PRT<213>人造序列<220><223>能与新聚集蛋白杂交的聚集蛋白的修饰共同序列<400>3Glu Lys Cys Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Lys Trp Asn Asp Arg Asn1 5 10 15Cys Leu Gln Ser Arg Leu Ala Ile Cys Glu Phe20 25<210>4<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>用于筛选新聚集蛋白的反向引物的序列<400>4caatctgatg agaaggtgat g 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>用于筛选新聚集蛋白的正向引物的序列。<400>5acgaggggct ggatgggaca t 21<210>6<211>27<212>PRT<213>人造序列<220><223>现有报道中三种聚集蛋白的共同序列<400>6Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro1 5 10 15Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu Phe20 25<210>7<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>测序M13通用引物的序列<400>7cgacgttgta aaacgacggc cagt24<210>8<211>17<212>DNA<213>人造序列<220><223>测序M13反向引物的序列。<400>8caggaaaca gctatgac17<210>9<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>测序λgt11反向引物的序列<400>9ttgacaccag accaactggt aatg24<210>10<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>测序λgt11正向引物的序列<400>10ggtggcgacg actcctggag cccg24<210>11<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>11cgtgaaaatg aatggaagtg g 21<210>12<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>12ttttatccat tgctgttcct c 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>13ctggcagtcc ccgaggtcca g 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>14gctggtcccc ccggagagcg t 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>加帽位点测序用1RC2引物的序列<400>15caaggtacgc cacagcgtat g21<210>16<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>加帽位点测序用合成TGP1引物的序列<400>16tcttcagttt ccctaatccc 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>加帽位点测序用2RC2引物的序列<400>17gtacgccaca gcgtatgatg c21<210>18<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>加帽位点测序用合成TGP2引物的序列<400>18cattcttgac aaacttcata g21<210>19<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>19gaagacaagt cttcaactcttg22<210>20<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白的引物序列<400>20ctctgagtct gtgaggccga tc 22<210>21<211>111<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选新聚集蛋白用探针的序列<400>21gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa 60aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g 111<210>22<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种筛选新聚集蛋白的正向引物序列<400>22gtgcccctgg ccctgcagaa tg22<210>23<211>26<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种筛选新聚集蛋白的反向引物序列<400>23gcatatcacc ctggggaacattttag 26<210>24<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选β-肌动蛋白的有义引物序列<400>24caagagatgg ccacggctgc t 21<210>25<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>筛选β-肌动蛋白的反义引物序列。<400>25tccttctgca tcctgtcggc a 21<210>26<211>39<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种扩增新聚集蛋白的有义引物序列<400>26aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg39<210>27<211>29<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种扩增新聚集蛋白的反向引物序列<400>27gctctagatt ataatgcaga tgacagtac 29<210>28<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种扩增敲除基因的有义引物序列<400>28atgcaacaag atttgatgag g 21<210>29<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>一种扩增敲除基因的有义引物的序列<400>29cctacccggt agaattgacc 20
权利要求
1．一种分离的聚核苷酸，所含核苷酸序列编码的蛋白质具有以下氨基酸序列Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu-Met-Lys-Leu-Val-Asp-Ser-Lys-His-Gly-Gln-Leu-Ile-Lys-Asn-Phe-Thr-Ile-Leu-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Thr-Gly-Asn-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Arg-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-GIu-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Lys-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Lys-Gly-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Glu-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Thr-Val-Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Met-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Val-Val-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Asn-Glu-Pro-Thr-Pro-Ala-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Cys-Pro-Pro-His-Trp-Lys-Asn-Phe-Thr-Asp-Lys-Cys-Tyr-Tyr-Phe-Ser-Val-Glu-Lys-Glu-Ile-Phe-Glu-Asp-Ala-Lys-Leu-Phe-Cys-Glu-Asp-Lys-Ser-Ser-His-Leu-Val-Phe-Ile-Asn-Thr-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Trp-Ile-Lys-Lys-Gln-Met-Val-Gly-Arg-Glu-Ser-His-Trp-Ile-Gly-Leu-Thr-Asp-Ser-Glu-Arg-Glu-Asn-Glu-Trp-Lys-Trp-Leu-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Asp-Tyr-Lys-Asn-Trp-Lys-Ala-Gly-Gln-Pro-Asp-Asn-Trp-Gly-His-Gly-His-Gly-Pro-Gly-Glu-Asp-Cys-Ala-Gly-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn-Phe-Ile-Cys-Glu-Lys-Asp-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ser-Ala-Leu (SEQ ID NO:2,206-547)。
2．一种分离的聚核苷酸，所含核苷酸序列编码的蛋白质具有以下氨基酸序列Met-Lys-Leu-Val-Asp-Ser-Lys-His-Gly-Gln-Leu-Ile-Lys-Asn-Phe-Thr-Ile-Leu-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Thr-Gly-Asn-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Arg-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Lys-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Lys-Gly-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Glu-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Thr-Val-Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Met-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Val-Val-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Asn-Glu-Pro-Thr-Pro-Ala-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Cys-Pro-Pro-His-Trp-Lys-Asn-Phe-Thr-Asp-Lys-Cys-Tyr-Tyr-Phe-Ser-Val-Glu-Lys-Glu-Ile-Phe-Glu-Asp-Ala-Lys-Leu-Phe-Cys-Glu-Asp-Lys-Ser-Ser-His-Leu-Val-Phe-Ile-Asn-Thr-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Trp-Ile-Lys-Lys-Gln-Met-Val-Gly-Arg-Glu-Ser-His-Trp-Ile-Gly-Leu-Thr-Asp-Ser-Glu-Arg-Glu-Asn-Glu-Trp-Lys-Trp-Leu-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Asp-Tyr-Lys-Asn-Trp-Lys-Ala-Gly-Gln-Pro-Asp-Asn-Trp-Gly-His-Gly-His-Gly-Pro-Gly-Glu-Asp-Cys-Ala-Gly-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn-Phe-Ile-Cys-Glu-Lys-Asp-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ser-Ala-Leu(SEQ ID NO:2,229-547)。
3．根据权利要求2所述的聚核苷酸，其中所述蛋白质在第一个甲硫氨酸残基上游还含有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2,229):Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,226-228)；或Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,211-228)。
4．根据权利要求2所述的聚核苷酸，其中所述蛋白质在第一个甲硫氨酸残基上游还含有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2,229):Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:102-228)；Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu (SEQ ID NO:2,91-228)；Met-Asn-Leu-Asn-Asn-Leu-Asn-Leu-Thr-Gln-Val-Gln-Gln-Arg-Asn-Leu-Ile-Thr-Asn-Leu-Gln-Arg-Ser-Val-Asp-Asp-Thr-Ser-Gln-Ala-Ile-Gln-Arg-Ile-Lys-Asn-Asp-Phe-Gln-Asn-Leu-Gln-Gln-Val-Phe-Leu-Gln-Ala-Lys-Lys-Asp-Thr-Asp-Trp-Leu-Lys-Glu-Lys-Val-Gln-Ser-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Ala-Asn-Asn-Ser-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asn-Asn-Asp-Thr-Leu-Glu-Asp-Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,9-228)；或Met-Tyr-Ser-His-Asn-Val-Val-Ile-Met-Asn-Leu-Asn-Asn-Leu-Asn-Leu-Thr-Gln-Val-Gln-Gln-Arg-Asn-Leu-Ile-Thr-Asn-Leu-Gln-Arg-Ser-Val-Asp-Asp-Thr-Ser-Gln-Ala-Ile-Gln-Arg-Ile-Lys-Asn-Asp-Phe-Gln-Asn-Leu-Gln-Gln-Val-Phe-Leu-Gln-Ala-Lys-Lys-Asp-Thr-Asp-Trp-Leu-Lys-Glu-Lys-Val-Gln-Ser-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Ala-Asn-Asn-Ser-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asn-Asn-Asp-Thr-Leu-Glu-Asp-Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,1-228)。
5．一种分离的聚核苷酸，含有如下核苷酸序列atgcaacaag atttgatgag gtcgaggtta gacactgaag tagccaactt atcagtgattatggaagaaa tgaagctagt agactccaag catggtcagc tcatcaagaa ttttacaatactacaaggtc caccgggccc caggggtcca agaggtgaca gaggatccca gggaccccctggcccaactg gcaacaaggg acagaaagga gagaaggggg agcctggacc acctggccctgcgggtgaga gaggcccaat tggaccagct ggtccccccg gagagcgtgg cggcaaaggatctaaaggct cccagggccc caaaggctcc cgtggttccc ctgggaagcc cggccctcagggccccagtg gggacccagg ccccccgggc ccaccaggca aagagggact ccccggccctcagggccctc ctggcttcca gggacttcag ggcaccgttg gggagcctgg ggtgcctggacctcggggac tgccaggctt gcctggggta ccaggcatgc caggccccaa gggcccccccggccctcctg gcccatcagg agcggtggtg cccctggccc tgcagaatga gccaaccccggcaccggagg acaatggctg cccgcctcac tggaagaact tcacagacaa atgctactatttttcagttg agaaagaaat ttttgaggat gcaaagcttt tctgtgaaga caagtcttcacatcttgttt tcataaacac tagagaggaa cagcaatgga taaaaaaaca gatggtagggagagagagcc actggatcgg cctcacagac tcagagcgtg aaaatgaatg gaagtggctggatgggacat ctccagacta caaaaattgg aaagctggac agccggataa ctggggtcatggccatgggc caggagaaga ctgtgctggg ttgatttatg ctgggcagtg gaacgatttccaatgtgaag acgtcaataa cttcatttgc gaaaaagaca gggagacagt actgtcatctgcatta (SEQ ID NO:1,670-1695)。
6．一种分离的聚核苷酸，含有如下核苷酸序列atgaagctag tagactccaa gcatggtcag ctcatcaaga attttacaat actacaaggtccaccgggcc ccaggggtcc aagaggtgac agaggatccc agggaccccc tggcccaactggcaacaagg gacagaaagg agagaagggg gagcctggac cacctggccc tgcgggtgagagaggcccaa ttggaccagc tggtcccccc ggagagcgtg gcggcaaagg atctaaaggctcccagggcc ccaaaggctc ccgtggttcc cctgggaagc ccggccctca gggccccagtggggacccag gccccccggg cccaccaggc aaagagggac tccccggccc tcagggccctcctggcttcc agggacttca gggcaccgtt ggggagcctg gggtgcctgg acctcggggactgccaggct tgcctggggt accaggcatg ccaggcccca agggcccccc cggccctcctggcccatcag gagcggtggt gcccctggcc ctgcagaatg agccaacccc ggcaccggaggacaatggct gcccgcctca ctggaagaac ttcacagaca aatgctacta tttttcagttgagaaagaaa tttttgagga tgcaaagctt ttctgtgaag acaagtcttc acatcttgttttcataaaca ctagagagga acagcaatgg ataaaaaaac agatggtagg gagagagagccactggatcg gcctcacaga ctcagagcgt gaaaatgaat ggaagtggct ggatgggacatctccagact acaaaaattg gaaagctgga cagccggata actggggtca tggccatgggccaggagaag actgtgctgg gttgatttat gctgggcagt ggaacgattt ccaatgtgaagacgtcaata acttcatttg cgaaaaagac agggagacag tactgtcatc tgcatta(SEQ ID NO:1,739-1695)。
7．根据权利要求6所述的聚核苷酸，在所述核苷酸序列的5′上游还具有如下核苷酸序列atggaagaa(SEQ ID NO:1,730-738)；或atgaggtcga ggttagacac tgaagtagcc aacttatcag tgattatgga agaa(SEQ ID NO:1,685-738)。
8．根据权利要求6所述的聚核苷酸，在所述核苷酸序列的5′上游还具有如下核苷酸序列atggagaaca tcaccactat ctctcaagcc aacgagcaga acctgaaaga cctgcaggacttacacaaag atgcagagaa tagaacagcc atcaagttca accaactgga ggaacgcttccagctctttg agacggatat tgtgaacatc attagcaata tcagttacac agcccaccacctgcggacgc tgaccagcaa tctaaatgaa gtcaggacca cttgcacaga tacccttaccaaacacacag atgatctgac ctccttgaat aataccctgg ccaacatccg tttggattctgtttctctca ggatgcaaca agatttgatg aggtcgaggt tagacactga agtagccaacttatcagtga ttatggaaga a (SEQ ID NO:1,358-738)；atgaacagcc agctcaactc attcacaggt cagatggaga acatcaccac tatctctcaagccaacgagc agaacctgaa agacctgcag gacttacaca aagatgcaga gaatagaacagccatcaagt tcaaccaact ggaggaacgc ttccagctct ttgagacgga tattgtgaacatcattagca atatcagtta cacagcccac cacctgcgga cgctgaccag caatctaaatgaagtcagga ccacttgcac agataccctt accaaacaca cagatgatct gacctccttgaataataccc tggccaacat ccgtttggat tctgtttctc tcaggatgca acaagatttgatgaggtcga ggttagacac tgaagtagcc aacttatcag tgattatgga agaa(SEQ ID NO:1,325-738)；atgaacctca acaacctgaa cctgacccag gtgcagcaga ggaacctcat cacgaatctgcagcggtctg tggatgacac aagccaggct atccagcgaa tcaagaacga ctttcaaaatctgcagcagg tttttcttca agccaagaag gacacggatt ggctgaagga gaaagtgcagagcttgcaga cgctggctgc caacaactct gcgttggcca aagccaacaa cgacaccctggaggatatga acagccagct caactcattc acaggtcaga tggagaacat caccactatctctcaagcca acgagcagaa cctgaaagac ctgcaggact tacacaaaga tgcagagaatagaacagcca tcaagttcaa ccaactggag gaacgcttcc agctctttga gacggatattgtgaacatca ttagcaatat cagttacaca gcccaccacc tgcggacgct gaccagcaatctaaatgaag tcaggaccac ttgcacagat acccttacca aacacacaga tgatctgacctccttgaata ataccctggc caacatccgt ttggattctg tttctctcag gatgcaacaagatttgatga ggtcgaggtt agacactgaa gtagccaact tatcagtgat tatggaagaa(SEQ ID NO:1,79-738)；atgtattctc ataatgtggt catcatgaac ctcaacaacc tgaacctgac ccaggtgcagcagaggaacc tcatcacgaa tctgcagcgg tctgtggatg acacaagcca ggctatccagcgaatcaaga acgactttca aaatctgcag caggtttttc ttcaagccaa gaaggacacggattggctga aggagaaagt gcagagcttg cagacgctgg ctgccaacaa ctctgcgttggccaaagcca acaacgacac cctggaggat atgaacagcc agctcaactc attcacaggtcagatggaga acatcaccac tatctctcaa gccaacgagc agaacctgaa agacctgcaggacttacaca aagatgcaga gaatagaaca gccatcaagt tcaaccaact ggaggaacgcttccagctct ttgagacgga tattgtgaac atcattagca atatcagtta cacagcccaccacctgcgga cgctgaccag caatctaaat gaagtcagga ccacttgcac agatacccttaccaaacaca cagatgatct gacctccttg aataataccc tggccaacat ccgtttggattctgtttctc tcaggatgca acaagatttg atgaggtcga ggttagacac tgaagtagccaacttatcag tgattatgga agaa (SEQ ID NO:1,55-738)；或gtcacgaatc tgcagcaaga taccagcgtg ctccagggca atctgcagaa ccaaatgtattctcataatg tggtcatcat gaacctcaac aacctgaacc tgacccaggt gcagcagaggaacctcatca cgaatctgca gcggtctgtg gatgacacaa gccaggctat ccagcgaatcaagaacgact ttcaaaatct gcagcaggtt tttcttcaag ccaagaagga cacggattggctgaaggaga aagtgcagag cttgcagacg ctggctgcca acaactctgc gttggccaaagccaacaacg acaccctgga ggatatgaac agccagctca actcattcac aggtcagatggagaacatca ccactatctc tcaagccaac gagcagaacc tgaaagacct gcaggacttacacaaagatg cagagaatag aacagccatc aagttcaacc aactggagga acgcttccagctctttgaga cggatattgt gaacatcatt agcaatatca gttacacagc ccaccacctgcggacgctga ccagcaatct aaatgaagtc aggaccactt gcacagatac ccttaccaaacacacagatg atctgacctc cttgaataat accctggcca acatccgttt ggattctgtttctctcagga tgcaacaaga tttgatgagg tcgaggttag acactgaagt agccaacttatcagtgatta tggaagaa (SEQ ID NO:1,1-738)。
9．根据权利要求5-8中任一项所述的聚核苷酸，还在所述核苷酸序列的3′段下游含有如下核苷酸序列taacggactg tgatgggatc acatgagcaa attttcagct ctcaaaggca aaggacactcctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat tgaaaaaaaa aaaagcactg aaaaccaattactgaaaaaa aattgacagc tagtgttttt taccatccgt cattacccaa agacttgggaactaaaatgt tccccagggt gatatgctga ttttcattgt gcacatggac tgaatcacatagattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt atacaaatta tgtcttccaa agtatggaacactccaatca gaaaaaggtt atcatcccg (SEQ ID NO:1,1696-2024)。
10．编码新聚集蛋白的分离的聚核苷酸，它能在严谨条件下与一种PCR扩增所得探针杂交，所述PCR使用以下核苷酸序列的引物caatctgatgagaaggtgatg(SEQID NO:4)和acgaggggctggatgggacat(SEQID NO:5)。
11．一种聚核苷酸，能在严谨条件下与权利要求1-10中任一项所述的聚核苷酸杂交，由该聚核苷酸编码的蛋白质是一种新的聚集蛋白，它具有(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)，和(2)胶原样区域。
12．根据权利要求1-11中任一项所述的聚核苷酸，所述聚核苷酸是cDNA。
13．一种新的聚集蛋白，具有权利要求5-12中任一项所述聚核苷酸所编码的氨基酸序列。
14．一种新的聚集蛋白，具有如下氨基酸序列Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu-Met-Lys-Leu-Val-Asp-Ser-Lys-His-Gly-Gln-Leu-Ile-Lys-Asn-Phe-Thr-Ile-Leu-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Thr-Gly-Asn-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Arg-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Lys-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Lys-Gly-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Glu-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Thr-Val-Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Met-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Val-Val-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Asn-Glu-Pro-Thr-Pro-Ala-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Cys-Pro-Pro-His-Trp-Lys-Asn-Phe-Thr-Asp-Lys-Cys-Tyr-Tyr-Phe-Ser-Val-Glu-Lys-Glu-Ile-Phe-Glu-Asp-Ala-Lys-Leu-Phe-Cys-Glu-Asp-Lys-Ser-Ser-His-Leu-Val-Phe-Ile-Asn-Thr-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Trp-Ile-Lys-Lys-Gln-Met-Val-Gly-Arg-Glu-Ser-His-Trp-Ile-Gly-Leu-Thr-Asp-Ser-Glu-Arg-Glu-Asn-Glu-Trp-Lys-Trp-Leu-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Asp-Tyr-Lys-Asn-Trp-Lys-Ala-Gly-Gln-Pro-Asp-Asn-Trp-Gly-His-Gly-His-Gly-Pro-Gly-Glu-Asp-Cys-Ala-Gly-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn-Phe-Ile-Cys-Glu-Lys-Asp-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ser-Ala-Leu (SEQ ID NO:2,206-547)。
15．一种新的聚集蛋白，具有如下氨基酸序列Met-Lys-Leu-Val-Asp-Ser-Lys-His-Gly-Gln-Leu-Ile-Lys-Asn-Phe-Thr-Ile-Leu-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Thr-Gly-Asn-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Arg-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Gly-Lys-Gly-Ser-Lys-Gly-Ser-Gln-Gly-Pro-Lys-Gly-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Lys-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Lys-Glu-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Thr-Val-Gly-Glu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Pro-Gly-Met-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Ser-Gly-Ala-Val-Val-Pro-Leu-Ala-Leu-Gln-Asn-Glu-Pro-Thr-Pro-Ala-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Cys-Pro-Pro-His-Trp-Lys-Asn-Phe-Thr-Asp-Lys-Cys-Tyr-Tyr-Phe-Ser-Val-Glu-Lys-Glu-Ile-Phe-Glu-Asp-Ala-Lys-Leu-Phe-Cys-Glu-Asp-Lys-Ser-Ser-His-Leu-Val-Phe-Ile-Asn-Thr-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Trp-Ile-Lys-Lys-Gln-Met-Val-Gly-Arg-Glu-Ser-His-Trp-Ile-Gly-Leu-Thr-Asp-Ser-Glu-Arg-Glu-Asn-Glu-Trp-Lys-Trp-Leu-Asp-Gly-Thr-Ser-Pro-Asp-Tyr-Lys-Asn-Trp-Lys-Ala-Gly-Gln-Pro-Asp-Asn-Trp-Gly-His-Gly-His-Gly-Pro-Gly-Glu-Asp-Cys-Ala-Gly-Leu-Ile-Tyr-Ala-Gly-Gln-Trp-Asn-Asp-Phe-Gln-Cys-Glu-Asp-Val-Asn-Asn-Phe-Ile-Cys-Glu-Lys-Asp-Arg-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ser-Ala-Leu(SEQ ID NO:2,229-547)。
16．根据权利要求15所述的新聚集蛋白，其中所述的新聚集蛋白在其第一个甲硫氨酸残基的上游还含有如下氨基酸序列(SEQ ID NO:2,229):Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,226-228)；或Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ IDNO:2,211-228)。
17．根据权利要求15所述的新聚集蛋白，其中所述的新聚集蛋白在其第一个甲硫氨酸残基的上游还含有如下氨基酸序列(SEQ ID NO:2,229):Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,102-228)；Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu (SEQ ID NO:2,91-228)；Met-Asn-Leu-Asn-Asn-Leu-Asn-Leu-Thr-Gln-Val-Gln-Gln-Arg-Asn-Leu-Ile-Thr-Asn-Leu-Gln-Arg-Ser-Val-Asp-Asp-Thr-Ser-Gln-Ala-Ile-Gln-Arg-Ile-Lys-Asn-Asp-Phe-Gln-Asn-Leu-Gln-Gln-Val-Phe-Leu-Gln-Ala-Lys-Lys-Asp-Thr-Asp-Trp-Leu-Lys-Glu-Lys-Val-Gln-Ser-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Ala-Asn-Asn-Ser-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asn-Asn-Asp-Thr-Leu-Glu-Asp-Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu(SEQ ID NO:2,9-228)；或Met-Tyr-Ser-His-Asn-Val-Val-Ile-Met-Asn-Leu-Asn-Asn-Leu-Asn-Leu-Thr-Gln-Val-Gln-Gln-Arg-Asn-Leu-Ile-Thr-Asn-Leu-Gln-Arg-Ser-Val-Asp-Asp-Thr-Ser-Gln-Ala-Ile-Gln-Arg-Ile-Lys-Asn-Asp-Phe-Gln-Asn-Leu-Gln-Gln-Val-Phe-Leu-Gln-Ala-Lys-Lys-Asp-Thr-Asp-Trp-Leu-Lys-Glu-Lys-Val-Gln-Ser-Leu-Gln-Thr-Leu-Ala-Ala-Asn-Asn-Ser-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Asn-Asn-Asp-Thr-Leu-Glu-Asp-Met-Asn-Ser-Gln-Leu-Asn-Ser-Phe-Thr-Gly-Gln-Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Thr-Ile-Ser-Gln-Ala-Asn-Glu-Gln-Asn-Leu-Lys-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-His-Lys-Asp-Ala-Glu-Asn-Arg-Thr-Ala-Ile-Lys-Phe-Asn-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Phe-Gln-Leu-Phe-Glu-Thr-Asp-Ile-Val-Asn-Ile-Ile-Ser-Asn-Ile-Ser-Tyr-Thr-Ala-His-His-Leu-Arg-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-Leu-Asn-Glu-Val-Arg-Thr-Thr-Cys-Thr-Asp-Thr-Leu-Thr-Lys-His-Thr-Asp-Asp-Leu-Thr-Ser-Leu-Asn-Asn-Thr-Leu-Ala-Asn-Ile-Arg-Leu-Asp-Ser-Val-Ser-Leu-Arg-Met-Gln-Gln-Asp-Leu-Met-Arg-Ser-Arg-Leu-Asp-Thr-Glu-Val-Ala-Asn-Leu-Ser-Val-Ile-Met-Glu-Glu (SEQ ID NO:2,1-228)。
18．根据权利要求13-17中任一项所述的新聚集蛋白，它是人源的。
19．一种新的聚集蛋白，所含氨基酸序列包括权利要求13-18中任一项所述的新聚集蛋白内有一处或多处氨基酸缺失、取代和/或增加，而且，所述新聚集蛋白具有(1)Ca2+依赖性糖识别区(CRD)，和(2)胶原样区域。
20．一种载体，含有权利要求1-12中任一项所述的聚核苷酸，并表达新的聚集蛋白。
21．一种宿主细胞，含有权利要求20所述的载体，并能进行表达。
22．一种探针，用于筛选新聚集蛋白相关分子，这些分子具有权利要求1-12中任一项所述的聚核苷酸或其片段。
23．一种抗体，具有与权利要求13-19中任一项所述新聚集蛋白起特异性免疫反应的活性。
24．根据权利要求23所述的抗体，它是一种单克隆抗体。
25．根据权利要求23或24所述的抗体，其对人免疫原性已减弱。
26．一种获得新聚集蛋白相关分子的方法，包括用权利要求23-25中任一项所述的抗体筛选蛋白质。
27．一种获得新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用权利要求23-25中任一项所述的抗体筛选蛋白质。
28．根据权利要求26-27所述的方法，其中所述的筛选是cDNA文库的表达筛选。
29．一种定量测定新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用权利要求23-25中任一项所述的抗体测定样品中新聚集蛋白和/或其衍生分子的含量。
30．根据权利要求29所述的方法，其中所述的抗体被用于ELISA法。
31．一种定量测定新聚集蛋白和/或其衍生分子的试剂盒，其中，用权利要求23-25中任一项所述的抗体通过ELISA法测定新聚集蛋白和/或其衍生分子的含量。
32．一种获得新聚集蛋白和/或其衍生分子的方法，包括用权利要求23-25中任一项所述的抗体分离出新聚集蛋白和/或其衍生分子。
33．根据权利要求32所述的方法，其中采用结合有所述抗体的支持体进行亲和层析，和/或免疫沉淀。
34．根据权利要求32或33所述的方法，包括在分离步骤前，用权利要求1-12中任一项所述的聚核苷酸表达该新聚集蛋白。
35．一种转基因非人动物，其染色体中稳定引入了一个重组基因，该基因含有权利要求1-12中任一项所述的聚核苷酸，并能表达新聚集蛋白。
36．一种转基因非人动物，成功引入其中的基因含有权利要求13-19中任一项所述新聚集蛋白的类似物，引入的方式可修饰所述类似物的基因表达。
37．一种基因敲除的非人动物，在含有权利要求13-19中任一项所述新聚集蛋白类似物的非人动物中改变该类似物的编码基因以抑制其表达，从而获得所述动物。
全文摘要
与新的聚集蛋白相关的分子,即,含SEQ ID NO:1核苷酸序列的新聚集蛋白基因,和含SEQ ID NO:2氨基酸序列的新聚集蛋白,它们有望在人体内表现出抗菌、抗病毒等活性。本发明还提供以上分子的使用方法。
文档编号A61K38/00GK1320164SQ99811366
公开日2001年10月31日 申请日期1999年8月24日 优先权日1998年8月24日
发明者若宫伸隆 申请人:扶桑药品工业株式会社