一种检测阿尔法突触核蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白含量的检测方法，特别涉及一种检测阿尔法突触核蛋白纯化 蛋白以及病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体和总量的方法，并可用两者之比值 用于帕金森疾病及类似疾病的诊断。
【背景技术】
[0002] AlphaScreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)技术是 一种基于微粒与微粒之间靠近的效应用于分析物均相检测方法，是由1994年发明的LOCI (luminescent oxygen channeling immunoassay)这种技术的基础上演化而来。供体含包 裹有光敏剂分子，受特殊波长680nm光激发，每秒产生6万个以上单线态氧分子，放大信号， 但单线态氧半衰期仅为4ys，在有水介质中衰减快，最远可传输200nm距离，如果受体能通过 一定方式，如抗体免疫吸附、亲和素-链霉素识别等接近抗体，则受体中的荧光基团可迅速 吸收单线态氧，以上转换方式产生520nm-620nm光信号，为检测器探测到。
[0003] AlphaLISA是在AlphaScreen技术的基础上，与经典的ELISA技术有相似之处的均 相检测方法，我们称之为均相化学发光技术。因为这种方法不用洗涤，反应在均相中进行， 其过程其实是个化学发光过程，已广泛用于药物筛选。
[0004] AlphaLISA方法的核心是供体（感光颗粒）和受体（发光颗粒）这两种直径约为 200nm的微珠，在两种微珠表面与生物分子(抗体或抗原蛋白）相偶联，每一个颗粒表面可以 覆盖成百上千个生物分子，可捕获待测分子。当微粒受到680nm的激光照射后，供体表面的 光敏剂就会将溶液(AlphaLISA反应液）中的氧气转化为单线态氧。单线态氧在溶液中的传 播距离约为200nm，如果供体和受体之间的距离小于200nm，单线态氧就能扩散至受体微粒， 受体中的光敏化合物就能和单线态氧发生化学反应，其中Eu配合物就产生高能级的发光。 相反，如果发光微粒和感光微粒之间的距离大于200nm，单体氧无法扩散至发光微粒，就不 会有光信号的产生。AlphaLISA均相反应就是基于以上原理，如果包被在两种微粒表面的生 物分子存在相互作用时，就拉近了两种微粒之间的距离，产生光信号。通过对光信号的强度 检测，来判断实际检测样品中有无待测目标物以及目标物的含量。
[0005] 基于AlphaLISA技术的原理，分子复合物小于200nm的范围内都可被检测到。而其 他均相技术，例如时间分辨荧光(HTRF)、荧光偏振(FP)，供体和受体之间的距离只能在10nm 内，仅限于小分子的检测。AlphaLISA可以应用于酶活性、受体配体反应、DNA、RNA、蛋白、多 肽、碳水化合物等检测。
[0006] 帕金森病是神经退行性疾病，有复杂的运动障碍，为人熟知的有震颤麻痹，表现为 休息震颤，运动迟缓，僵硬和姿势异常。此外，很多非运动特征也逐渐被认为是症状的完整 组成部分。帕金森病的神经病理标志是多巴胺能神经元在黑质体（SN)的缺失以及路易体 (LB)的神经内蛋白包涵体的形成，LB主要含有阿尔法突触核蛋白（Alpha Synuclein，a-syn)。阿尔法突触核蛋白错误折叠是导致帕金森病形成的病原，也被认为是脑脊液(CSF)可 被检测的潜在生物标志物(biomarker)。患有突触核蛋白相关疾病包括帕金森病(PD)，多系 统萎缩症(MSA)和路易体痴呆症(DLB)病人的脑脊液中阿尔法突触核蛋白单体浓度可能低 于其他神经疾病的病人，而聚集体可能增多。但由于检测手段所限，结果一直有争议。
[0007] 正如以上所述，AlphaLISA技术可以检测蛋白，多肽，核酸等物质，但是否能够用简 易方法，以灵敏度高的方式检测阿尔法突触核蛋白，仍属于未知领域。
[0008] 本发明发明人通过对检测条件以及分离方法的涉及，成功的研究出一种用 AlphaLISA技术检测纯化的阿尔法突触核蛋白，包括检测其聚集体及蛋白总含量，用该方法 获得的结果可以对帕金森病人体内阿尔法突触核蛋白的含量和正常人体内的含量进行对 比从而用于帕金森疾病的诊断。
【发明内容】
[0009] 本发明提供一种用AlphaLISA方法检测阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体及蛋白总含 量的方法，可用于帕金森疾病的诊断。
[0010]本发明所述方法，步骤如下：
[0011] 步骤1，收集病人脑脊液
[0012] 对病人进行腰穿，收集病人脑脊液，收集到的脑脊液必要时进行冷冻。
[0013] 步骤2，用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白蛋白聚集体及 蛋白总含量。
[0014]其中，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白聚 集体及蛋白总含量，方法如下：
[0015]取脑脊液样品，加入结合抗体的AlphaLISA受体微珠;再加入生物素化抗体;再加 入链霉素亲和素供体微珠;用AlphaLISA测定仪器获取测定信号，用所得信号计算样品中的 寡聚体和蛋白总量的比值。
[0016]优选的，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检须彳病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋白 聚集体及蛋白总含量，方法如下：
[0017] 脑脊液样品4-6yL，加入5yL结合抗体的AlphaLISA受体微珠；室温避光孵育0 · 5-2 小时;然后加入5yL生物素化抗体;室温避光孵育0.5-2小时；再加入10yL链霉素亲和素供 体微珠;室温避光孵育0.5-2小时;AlphaLISA测定仪器获取测定信号，用所得信号计算样 品中的聚集体和蛋白总含量比值。
[0018] 最优选的，步骤2中所述用AlphaLISA检测法检测病人脑脊液中的阿尔法突触核蛋 白聚集体及蛋白总含量，方法如下：
[0019] 脑脊液样品5yL以及5yL结合抗体的AlphaLI SA受体微珠;室温避光孵育1小时；加 入5yL生物素化抗体;室温避光孵育1小时；加入10yL链霉素亲和素供体微珠;室温避光孵育 30分钟;AlphaLISA测定仪器获取测定信号计算样品中的Ab2-A/Ab2-B信号与Abl-A/Ab2-B 信号的比值。
[0020] 本发明的方法可以分开进行，如：
[0021 ] -种检测阿尔法突触核蛋白聚集体的方法，其特征在于，它包括步骤：
[0022] (1)将阿尔法突触核蛋白的C端抗体Ab2分别标记AlphaLISA受体微珠和生物素得 至ljAb2-A 和 Ab2-B;
[0023] (2)在样品中加入步骤（1)标记好的Ab2_A和Ab2_B，并加入链霉亲和素供体微珠进 行AlphaLISA实验;得到阿尔法突触核蛋白的聚集体AlphaLISA信号，测定Ab2-A/Ab2-B。
[0024] -种检测阿尔法突触核蛋白蛋白总量的方法，其特征在于，它包括步骤：
[0025] (1)将一种阿尔法突触核蛋白的C端抗体Ab2标记生物素得到Ab2_B，并将另一种阿 尔法突触核蛋白抗体Ab 1标记AlphaLI SA受体微珠 Ab 1-A;
[0026] (2)在样品中加入步骤（1)标记好的抗体微珠 Ab2_B和Abl-A，并加入链霉亲和素供 体微珠进行A1 phaLISA实验；得到阿尔法突触核蛋白的总量A1 phaLISA信号，测定Ab 1-A/ Ab2-B
[0027] 有关的抗体说明：
[0028]检测过程中，需要将Abl抗体和Ab2抗体分别交联上AlphaLISA受体微珠以及生物 素化。该技术属于现有技术，即最常见的AlphaLISA免疫检测方法，其以传统的"三明治"结 构为基础，采用链霉亲和素供体微珠和偶联了抗体的AlphaLISA受体微珠。将一个抗体生物 素化，并与链霉亲和素包被的供体微珠结合。另一个抗体与AlphaLISA受体微珠直接偶联 (用于直接测定方法）。利用两种抗体，一种是阿尔法突触核蛋白整体作为抗原的抗体，称为 Abl，另一种是识别阿尔法突触核蛋白C端的抗体，称为Ab2。其中，标记了的抗体有四种，分 别命名为：AlphaLISA受体微珠标记的Abl，称为Abl-A;生物素标记的Abl，称为Abl-B; AlphaLISA受体微珠标记的Ab2，称为Ab2-A;生物素标记的Ab2，