一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Jo-1抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Jo-ι抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 1980年首次报道抗Jo-ι抗体在多发性肌炎(PM)患者的血清中发现，其抗原为组氨 酰tRNA合成酶，存在于细胞质中，并因患者名为John而得名，被命名为抗Jo-Ι抗体。
[0003] 大量临床研究证实，抗Jo-Ι抗体（Anti-Jo-1 antibody)是肌炎特异性抗体 (Myositis-specific antibodies，MSA)中最重要的抗体，它对多发性肌炎(Polymyositis， PM)/皮肌炎(Dermatomyositis，DM)的诊断、鉴别诊断、分型、治疗选择和预后评估均具有重 要临床意义。1983年证实其抗原为组氨酰-tRNA合成酶抗体(HRS)。目前临床上抗Jo-Ι抗体 IgG的检测有的膜条免疫法和酶联免疫吸附法。膜条免疫法应用的是膜条显色技术，其特点 为固定几个项目在同一膜条测定，一般通过手工或者半自动膜条仪进行实验操作，最终通 过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，反应时间长，检测项目只能固定搭配组合，灵活性 差。酶联免疫吸附法的灵敏度在膜条免疫法基础上有所提升，但仍然较低，并且线性范围 窄，重复性差，反应时间也较长，仍然不能很好满足临床的应用。
[0004] 磁微粒化学发光免疫分析法，较以前的膜条免疫法和酶联免疫吸附法，在检测灵 敏度、检测范围、检测时间及自动化操作上有了大大提高，且没有污染，临床应用广。
[0005] 目前，使用磁微粒化学发光分析法在抗Jo-Ι抗体IgG免疫分析产品的应用仍未见。
[0006] 中国专利CN103105489A公开了检测自身免疫性疾病抗体的免疫印迹试剂盒及其 制备方法，涉及一种检测多种自身免疫性疾病相关抗体的免疫印迹试剂盒，解决目前尚无 用于多种自身免疫性疾病体检筛查的免疫印迹产品技术上的不足:在所述的硝酸纤维素膜 或尼龙膜上含有：分别由(^0ΝΑ、5ι?/ΚΝΡ、(ΧΡ、55Α，55Β，6Α0、ΚΑ、ΙΑ-2Α、Τ6，ΑΜΑ-Μ2,1(^Φ* 的至少两种天然或重组抗原包被而成的两条以上平行的检测线，1条高浓度质控带，1条中 浓度质控带及1条低浓度质控带。该专利公开的是一种膜条免疫法，更能说明膜条免疫法存 在的灵敏度较低、线性范围窄、重复性差和反应时间长的问题。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种使用磁微粒化学发光定量检测抗 Jo-Ι抗体IgG的试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现抗Jo-Ι抗体IgG准确和 高精确地定量测定。
[0008] 本发明是通过如下技术方案来实现的：一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Jo-1 抗体IgG的试剂盒，所述试剂盒包括:Anti-Jo-1 IgG校准品、Anti-Jo-1 IgG试剂1号、Ant i-Jo-1 IgG试剂2号、Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂、Anti-Jo-1 IgG质控品和清洗液。
[0009] 所述Anti-Jo-lIgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别 为0、5、20、50、100、200RU/mL的抗Anti-Jo-1抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；
[00?0]所述Anti-Jo-lIgG试剂1号为1个含有5mL生物素标记的Jo-Ι抗原和牛血清白蛋白 的Tris缓冲液的瓶；
[0011]所述Anti-Jo-lIgG试剂2号为1个含有15mL碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体 和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；
[0012] 所述Anti-J0-lIgG磁分离试剂为1个含有5mL链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清 白蛋白的Tris缓冲液瓶;所述Anti-Jo-1 IgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的 范围分别为：16_24RU/mL 和80-120RU/mL。
[0013]所述试剂盒检测原理为将待测样品、所述Anti-Jo-lIgG试剂1号混合温育，样品中 的抗Jo-Ι抗体IgG与Jo-Ι抗原特异性结合，再加入所述Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂，抗Jo-Ι抗 体IgG与Jo-Ι抗原的免疫复合物被吸附到磁微粒表面，洗涤去除未结合的抗体和杂质，加入 Anti-Jo-lIgG试剂2号并混合温育。碱性磷酸酶标记(ALP)的羊抗人IgG抗体与已经结合在 磁珠上的抗Jo-Ι抗体IgG特异性结合。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入化学发光底物， ALP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样品中抗Jo-Ι抗体IgG浓 度呈正比，通过RLU就可以从标准曲线上计算出待测样品的抗Jo-Ι抗体IgG含量。
[0014]本发明采取的又一技术方案是：一种抗Jo-Ι抗体IgG的磁微粒化学发光定量检测 试剂盒的制备方法，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
[00?5 ] 步骤1 ·制备所述An t i -Jo-11 gG校准品包括:An t i - Jo-11 gG校准品稀释液配制步骤 和Ant i -Jo-11 gG校准品配制步骤：
[0016] 所述Anti-Jo-1 IgG校准品稀释液的配制步骤包括：
[0017] 加800mL纯化水和11.2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠和2mL 的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，搅 拌至完全溶解，再将pH值调为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的 所述校准品稀释液保存在2_8°C待用；
[00?8] 所述Anti-Jo-1 IgG校准品的配制步骤包括：
[0019]用上述Anti-Jo-lIgG校准品稀释液将抗Jo-Ι抗体IgG分别配制为0、5、20、50、100、 200RU/mL共6个浓度点；
[0020] 步骤2.制备所述Anti-Jo-1 IgG试剂1号包括:Anti-Jo-1 IgG试剂1号稀释液配制步 骤和Anti-Jo-1 IgG试剂1号配制步骤：
[0021 ] 所述Anti-Jo-lIgG试剂1号稀释液的配制步骤：
[0022] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调 为7.0-7.5,用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在 2_8°C待用；
[0023 ] 所述Ant i -Jo-ι I gG试剂1号的配制步骤：
[0024]用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照Jo-Ι抗原与 生物素溶液质量比为10:1的比例在jo-l抗原溶液中加入到上述〇. 5mg/mL的生物素溶液，混 合均匀，室温静置18h，反应生成Jo-Ι抗原-生物素连接物的反应液，将得到的Jo-Ι抗原-生 物素连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到Jo-Ι抗原-生物素 连接物，再用所述试剂1号稀释液将Jo-ι抗原-生物素连接物稀释到0.1-0.3yg/mL，得到所 述的试剂1号；
[0025] 步骤3.制备所述Anti-J〇-lIgG试剂2号包括:Anti-J〇-lIgG试剂2号稀释液配制步 骤和Anti-Jo-1 IgG试剂2号的配制步骤：
[0026] 所述Anti-Jo-1 IgG试剂2号稀释液的配制步骤：
[0027] 加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0. lg的ZnCl2、0.2mL的Proclin 300和0. lg的MgCh，搅拌至 完全溶解，将pH值调为7.5-8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述试 剂2号稀释液保存在2-8°C待用；
[0028] 所述Anti-Jo-1 IgG试剂2号的配制步骤：
[0029]将lmg的羊抗人抗体和2-4yL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静 置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10yL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后 抗体，将活化后的抗体保存在2_8°C备用，取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20yL，室温静置30min，用G-25凝 胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2_8°C备用，再将上述活 化的羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8°C条件下静置12-24h，用Supperdex200凝 胶纯化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8°C保存备用，将羊抗人 抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02-0. lyg/mL，得到所述的 试剂2号；
[0030] 步骤4.制备所述Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂包括:Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂稀释液 配制步骤和Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂配制步骤：
[0031 ] 所述Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：
[0032] 加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300,搅拌至完全溶解，将pH值调为 7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μπι滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在 2_8°C待用；
[0033] 所述Anti-Jo-1 IgG磁分离试剂配制步骤：
[0034] 取10011^磁微粒，磁分离去上清，取用0.025111〇1/1的？!1值为4.5-6的2-吗啉乙磺酸 缓冲液1 〇mL重悬，室温下混勾2~3h，加入0.5 -1. OmL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温