外膜囊泡的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请请求2012年9月18日提交的美国临时申请US61/702, 296和2013年3月 15日提交的美国临时申请US61/799, 311的权益，这两项申请的全部内容通过引用纳入本 文用于所有目的。
技术领域
[0002] 本发明涉及来自革兰氏阴性细菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的异源蛋白。该囊 泡特别有用于免疫原性组合物，例如疫苗。
【背景技术】
[0003] 由于细胞被膜的膨压，革兰氏阴性菌可在其生长期间自发释放外膜囊泡（OMV)。 可通过某些细菌组分的破坏来促进这类OMV的形成，例参考文献1和2中破坏了大肠杆菌 Tol-Pal系统以得到在生长期间向培养基释放囊泡的菌株。也可通过破坏完整的细菌来产 生0MV。已知的OMV生产方法包括使用去污剂处理（例如，用脱氧胆酸盐）[3和4]，无去污 剂方法[5]或声处理[6]等的方法。
[0004] OMV在免疫原性细胞表面相关的、周质和分泌的抗原中富集，并且已经用作例如针 对脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)血清组B的疫苗[7]。它们特别适于该用 途，因为囊泡含有发挥佐剂作用的化合物，这引发针对该抗原的强免疫应答。从而对于免疫 系统而言，囊泡是比纯化的抗原性蛋白质或其他细菌组分更为接近的天然细菌模拟物。OMV 因此保持疫苗和其他免疫原性组合物的更具吸引力的靶标。已经提出，通过使用ClyA作为 融合伙伴对OMV进行工程改造以在OMV表面上呈现多种抗原能够增加一些蛋白质抗原的免 疫原性[8]。
[0005] 已经进行了多次尝试以使异源蛋白，尤其是异源抗原靶向0MV。然而，很大程度上 因为与异源蛋白质向囊泡运输相关联的挑战，迄今为止，相对亲本细菌而言外来的抗原仍 然在大部分OMV中显著缺失[11]。大多数使异源蛋白靶向OMV的尝试依赖于异源蛋白与整 合膜蛋白的共价连接。这类共价连接的异源蛋白的示例包括FLAG表位与OmpA (外膜蛋白 A)的全长序列的融合物、FLAG表位与PagP (PhoPQ-激活基因 P)的全长序列的融合物[9] 以及GFP与ClyA(溶细胞素）的融合物[10]。凭借它们与膜蛋白的共价连接，所得的融合 蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。这些方法具有缺陷，尤其是由于难以在不对转化的 细菌造成有害影响的情况下过表达大量的整合膜蛋白。
[0006] 还已证明，难以使周质蛋白靶向OMV0GFP与Tat (双精氨酸转运体）信号序列的融 合导致靶向周质的GFP的过表达，但是GFP荧光几乎没有超过OMV中的背景荧光水平[11]， 表明GFP没有进入OMV中或者由于错误折叠而在OMV中没有功能。
[0007] 仍然存在对开发适于在OMV中表达异源蛋白的方法，尤其是在OMV中表达抗原性 蛋白质的方法的需求。也仍然存在对替代或改良的OMV(尤其用于疫苗）的需求。
【发明内容】
[0008] 发明人已经发现使异源蛋白靶向OMV的腔克服了许多与使异源蛋白靶向OMV的膜 相关的问题。令人惊讶地，发明人也已经发现当给予哺乳动物时，腔中含异源蛋白的OMV能 够引发针对该蛋白质的免疫应答。
[0009] 因此，本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡（OMV)，其中该OMV包含在其 腔中游离的至少一种异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白 的免疫应答。
[0010] 本发明也提供了制备本发明的OMV的方法，该方法包括在革兰氏阴性细菌的周质 中表达异源蛋白的步骤。本发明还提供通过该方法获得的或可通过该方法获得的0MV。 [0011] 本发明也提供包括（a)本发明的OMV和（b)药学上可接受的运载体的药物组合 物。
[0012] 本发明也提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，该方法包括向该哺乳动物给 予有效量的来自革兰氏阴性细菌的0MV，其中该OMV在其腔中包含至少一种异源蛋白，并且 其中该免疫应答针对OMV中的异源蛋白。在本发明的这一方面的一些实施方式中，在OMV 的腔中，该蛋白质是游离的。本发明也提供了在哺乳动物中产生免疫应答的方法，包括向该 哺乳动物给予本发明的药物组合物，其中该免疫应答针对OMV中的异源蛋白。
[0013] OMV
[0014] 本发明提供了来自革兰氏阴性细菌的外膜囊泡（OMV)，其中该OMV包含在其腔中 游离的至少一种异源蛋白，并且当给予哺乳动物时，该OMV能够引发针对该异源蛋白的免 疫应答。
[0015] OMV为本领域所熟知并且由细菌自发分泌到培养基中。"天然0MV"("N0MV"[12])、 微囊泡（MV[13])、去污剂提取的OMV(DOMV)、突变体衍生的OMV(m-〇MV)和小泡（其在以MV 形式释放之前是与细菌保持连接的外膜凸起）（[14] ;[15])，全部属于本发明的部分并且 在本文中统称为OMV蛋白。
[0016] 可从任何合适的革兰氏阴性细菌中得到本发明的0MV。典型的革兰氏阴性细菌是 大肠杆菌（E.coli)。然而，除了大肠杆菌，其可以是不同的革兰氏阴性细菌。本发明所用 的优选的革兰氏阴性细菌包括在人体中非致病性的细菌。例如，该细菌可以在人体中是共 生的。然而，在一些实施方式中，所用的细菌一般不在人类宿主中出现。本发明所用的示 例性物种包括以下任何属中的物种：大肠杆菌属（Escherichia)、志贺氏菌属（Shigella)、 奈瑟氏球菌属（Neisseria)、莫拉氏菌属（Moraxella)、博德特菌属（Bordetella)JS 疏氏螺旋体属（Borrelia)、布鲁氏菌属（Brucella)、衣原体属（Chlamydia)、嗜血菌 属（Haemophilus)、军团菌属（Legionella)、假单胞菌属（Pseudomonas)、耶尔森菌属 (Yersinia)、螺杆菌属（Helicobacter)、沙门菌属（Salmonella)、弧菌（Vibrio)等。具 体地，细菌可以是志贺氏菌物种（如痢疾志贺氏菌（S. dysenteriae)、弗氏志贺氏菌 (S. flexneri)、鲍氏志贺氏菌（S. boydii)或索氏志贺氏菌（S. sonnei))。或者，其可以是 奈瑟氏球菌物种，尤其是非致病性物种，如杆状奈瑟氏球菌（N. bacilliformis)、灰色奈瑟 氏球菌（N. cinerea)、长奈瑟氏球菌（N. elongata)、浅黄奈瑟氏球菌（N. f Iavescens)、乳糖 奈瑟氏球菌（N. Iactamica)、恒河猴瑟氏球菌（N.macacae)、粘液瑟氏球菌（N. mucosa)、多 糖瑟氏球菌（N. polysaccharea)、干燥瑟氏球菌（N. sicca)或微黄瑟氏球菌（N. subflava)， 并且尤其是乳糖奈瑟氏球菌（N. lactamica)。或者，可使用奈瑟氏球菌的致病物种，例如， 淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌（N. meningitidis)。在其他示 例中，细菌可以是百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi)、山羊布鲁氏菌（Brucella melitensis)、羊布鲁氏菌（Brucella ovis)、婴鸟鹉 热衣原体（Chlamydia psittaci)、砂眼衣原体（Chlamydia trachomatis)、粘膜炎莫拉氏菌 (Moraxella catarrhalis)、流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)(包括不可分型菌株）、 嗜肺军团菌（Legionellapneumophila)、绿胺假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、小肠 结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica)、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)、肠 沙门氏菌（Salmonella enterica)(包括伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，以及副伤寒沙 门氏菌和肠炎沙门氏菌）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae)、变形杆菌（Proteus)、朽1檬酸杆菌 (Citrobacter)、沙雷氏菌（Serratia)、欧文氏菌（Erwinia)、巴斯德氏菌（Pasteurella) 等。也可使用光合型革兰氏阴性细菌。细菌一般是感受态菌株。该特征便于对细菌进行遗 传修饰。
[0017] 在一个【具体实施方式】中，所述革兰氏阴性细菌是该细菌的"高发泡"菌株。 WO 02/062378中描述了在自然中更易于以较高产量产生较均匀小泡的高发泡革兰氏 阴性细菌。例如，小泡可以衍生自选自下组的细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis)、乳糖奈瑟氏球菌（Neisseria lactamica)、淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi)、 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌（Vibrio cholerae)、志贺氏菌属 (Shigella spp·)、流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)、百日咳博德特菌（Bordetella pertussis)、绿胺假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)和粘膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhal is)〇
[0018] 在一个【具体实施方式】中，细菌是大肠杆菌ompA突变体和/或大肠杆菌tolR突 变体。在一些实施方式中，细菌选自大肠杆菌BL21 (DE3) ΔοηιρΑ、大肠杆菌BL21 (DE3) ΔompAΔtolR、大肠杆菌BL21(DE3)ΔtolR、大肠杆菌ΔnlpI或大肠杆菌ΔdegP。本文所用 的Δ标记是指一种菌株，其中删除了在Λ标记之后所列基因的编码序列。因此，" AompA" 的细菌菌株并不包含ompA基因的编码序列。同样，" Λ tolR"的细菌菌株并不包含tolR基 因的编码序列。可以删除完整的编码序列。然而，可以替代性地部分删除所述编码序列。例 如，可以删除N-末端的那一半或C-末端的那一半。或者，可以通过引入一个或多个取代和 /或插入来对ompA和/或tolR基因进行突变。
[0019] 大肠杆菌AtolR突变株和大肠杆菌Δ ompA突变株相对于野生型大肠杆菌过量产 生0MV。因此，ompA基因和/或Tol-Pal复合物的一个或多个组分的突变产生突变体细菌， 该细菌产生与其相应的携带野生型ompA基因和/或Tol-Pal复合物的野生型菌株相比增 多量的OMV。ompA是整合膜蛋白并且是大肠杆菌中外膜蛋白中丰度最大的。因此，令人惊 讶地发现缺少OmpA蛋白的大肠杆菌是有活力的。事实上，根据Murakami等[16]，大肠杆菌 ompA单一突变体不能促进囊泡释放。
[0020] 异源蛋白
[0021] 本发明的异源蛋白靶向并且在革兰氏阴性细菌的周质中表达，从而该异源蛋白在 OMV的腔内。在一些实施方式中，在OMV的腔中，异源蛋白是游离的。
[0022] 该蛋白可以是任意长度的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是直链或支链的，其 可包含修饰的氨基酸并可被非氨基酸打断。该术语也包括经天然修饰或通过介入修饰的氨 基酸聚合物；例如，二硫键形成、其他糖基化、部分或完全去糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或 任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类 似物（包括例如，非天然氨基酸等），以及本领域已知的其它修饰的蛋白质。蛋白质可以单 链或结合链的形式出现。本
【发明内容】
中的蛋白质可以是天然或非天然糖基化的（即该多肽 的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖基化模式）。
[0023] 本文使用的术语"异源"表示蛋白质来自与获得OMV的细菌物种不同的物种（异 源生物体）。该蛋白质一般是来自与获得OMV的细菌属不同的病原体属的抗原。
[0024] 在本发明的【具体实施方式】中，异源蛋白是可在受体中引发免疫应答的免疫原性蛋 白质。在一个【具体实施方式】中，免疫原性蛋白质，并且因而异源蛋白，包含抗原或由抗原组 成。该抗原可引发针对原生生物、细菌、病毒、真菌或任何其他病原体，包括多细胞病原体或 寄生虫（或者在一些实施方式中针对变应原；并且在其它实施方式中针对肿瘤抗原）的免 疫应答。所述免疫应答可包括抗体应答（通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫应答。所 述多肽抗原通常会引发免疫应答，所述免疫应答识别对应的细菌、病毒、真菌或寄生虫（或 变应原或肿瘤）多肽，但在一些实施方式中，所述多肽可作为模拟表位来引起识别细菌、病 毒、真菌或寄生虫糖类的免疫应答。所述抗原通常是表面多肽，例如粘附素、血凝素、包膜糖 蛋白、突起糖蛋白等。
[0025] 在一些实施方式中，所述抗原引发针对下列细菌之一的免疫应答：
[0026] 脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis):可用的抗原包括，但不限于，膜蛋 白如粘附素、自体转运蛋白、毒素、摄铁蛋白（iron acquisition proteins)、H因子结合蛋 白（fHbp或741)、奈瑟氏球菌肝素结合抗原（NHBA或287)、NadA (或961)、953/936和脑膜 炎奈瑟氏球菌血清组B bp(fHbp)。三种有用多肽的组合公开于参考文献17中。
[0027] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae):有用的多肽抗原公开于参考文献18 中。其包括但不限于RrgB菌毛亚基、β -N-乙酰-己糖胺酶前体（spr0057)、spr0096、一般 应激蛋白GSP-781 (spr2021、SP2216)、丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面 粘附素 PsaA。
[0028] 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes):可用的抗原包括但不限于，参考文献19 和 20 中公开的多肽，例如，GAS25-574,如 GAS 25(SEQ ID:41、SEQ ID:42)、GAS40(SEQ ID: 43、SEQ ID :44、SEQ ID :45、SEQ ID :46、SEQ ID :47、SEQ ID :48、SEQ ID :49、SEQ ID :50、 SEQ ID :51、SEQ ID :52、SEQ ID :53、SEQ ID :54、SEQ ID :55、SEQ ID :56、SEQ ID :57、SEQ ID :58、SEQ ID :59、SEQ ID :60、SEQ ID :61、SEQ ID :62、SEQ ID :63、SEQ ID :64、SEQ ID : 65、SEQ ID :66、SEQ ID :67、SEQ ID :68、SEQ ID :69、SEQ ID :70)、GAS57 (SEQ ID :39、SEQ ID :40、SEQ ID :71、SEQ ID :72、SEQ ID :73、SEQ ID :74、SEQ ID :75)、88、23、99、97、24、5、 208、193、67、64、101、205、268、68、189、165 或 201。
[0029] 粘膜炎莫拉氏菌（Moraxella catarrhalis):
[0030] 百日咳博德特菌（Bordetella pertussis):可用的百日咳抗原包括但不限于：无 细胞或全细胞百日咳抗原、百日咳全毒素或类毒素（PT)、丝状血细胞凝集素（FHA)、百日咳 菌粘附素和凝集原2及3。
[0031] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus