家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]肾移植是治疗终末期肾病最有效的手段。据统计，中国目前每年进行肾移植5000例左右【1】，但日益严重的供肾匮乏困扰着广大患者及移植医生。为此，卫生部自2010年起开始启动心脏死亡器官捐献(donat1n after cardiac death，DO))试点工作，运行良好，自2015年I月I日起，公民逝世后器官捐献已成为供体的唯一来源。但D⑶相比于脑死亡供者(donor after brain death, DBD)来说存在一些缺点【2】。例如，D⑶供体器官热缺血时间较长，导致术后移植物原发性无功能(primarynonfunct1n，PNF)或功能延迟恢复(delayed graft funct1n，DGF)的发生率高【3】。此外，供肾保存方式对移植后肾功能恢复亦有影响。多个移植中心报道传统静态冷储保存的DCD供肾移植受者移植肾功能延迟恢复(delayed graft funct1n, DGF)发生率高达40%?90%【4-5】。DGF是肾移植术后早期常见并发症，常导致受者和移植肾长期存活率降低【6】，发生DGF受者I年生存率低于未发生DGF受者(74%与90% )【7】。鉴于此，随着边缘供者和D⑶供肾的增加，传统的静态冷储(cold storage，CS)已经无法应对新形势下的保存需求，故新的保存策略肾脏低温机械灌注(machine perfus1n，MP)得到推崇。多个国际随机临床试验均证实，MP相比CS来说，可以明显降低脑死亡、D⑶和扩大标准供体(E⑶)的DGF发生率、提高移植物的I年生存率和3年生存率。
[0003]从理论上讲，MP可能促进毒素的排泄和提供营养；MP也可以减少血管痉挛但是没有直接证据；MP能够将灌注液从肾动脉灌入到肾脏内部，起到冲刷血管，保护血管床的作用。但MP的保护机制仍然不为人所知。为了进一步研宄机制，稳定可靠、重复性高的动物模型成为首选。目前，低温机械灌注模型多以猪、犬等大型动物为研宄对象，如:AnjaGallinat、Nader Vaziri等人分别做过同种异体猪肾移植和Susanne Lindell等人用犬来研宄UW液的保护供肾的作用【8-10】。Hauet T等人于2000年在J Am Soc N印hrol发表过一篇关于猪的自体肾移植的模型制作方法的文章，他选用的手术方式为自体肾移植，其意义在于消除了由同种异体的供肾所导致的免疫排斥反应，排除免疫系统的干扰，但存在缝合时间长，血管损伤大的缺陷，对于观察MP的保护机制仍有影响【11】。另外，参照临床肾移植的整个过程，是否能在小型动物上模拟人体DCD肾移植全过程？家兔，相较于大小鼠，其实验难度减少，虽然Gregory M.Fahy和Suja E.Ali做过家兔肾脏常温灌注【12】，但未见有利用家兔为模型基础来研宄低温机械灌注机制的报道。因此，我们提出了家兔肾脏在体低温机械灌注模型，希望能够为将来MP机制的研宄提供稳定的模型基础。
[0004]参考文献:
1、全国器官移植概况暨数据质量核查[DB/0L]。中国肾移植科学登记系统，2011[2013-01-10]。 http://www.haven, net.cn/main/index, d0.2、Deng，R.，GujG.，Wang, D.，et al.Machine perfus1n versus cold storageof kidneys derived from donat1n after cardiac death: a meta-analysis.PLoS.0ne.8，e56368 (2013).3、Tsoulfas，G., Nagelschmidtj M., Minor, T., et al.Commentary on: Lipidperoxidat1n in machine perfus1n of older donor kidneys.J.Surg.Res.185，e43-4 (2013).4、FarneyAC， Singh RPj Hines MH ， et al.Experience in renal and extrarenaltransplantat1n with donat1n after cardiac death donors with selective use ofextracorporeal support.J Am Coll Surgj 206(5): 1028-1037 (2008).5、Barlow ADj Metcalfe MS, Johari Y， et al.Case-matched comparisonof long-term results of non-heart beating and heart-beating donor renaltransplants.Br J Surgj 96(6): 685-691 (2009).6、Halloran PFj Hunsicker LG.Delayed graft funct1n: state of the art.AmJ Transplant, 1 (2): 115-120(2001).7、MoersC， Smits JMj Maathuis MHj et al.Machine perfus1n or cold storagein deceased-donor kidney transplantat1n.N Ensl J Medj 360(1): 7-19 (2009).8、Gallinat，A.，Fox,M.，Llierj B.，et al.Role of pulsatility in hypothermicrecondit1ning of porcine kidney grafts by machine perfus1n after coldstorage.Transplantat1n 96， 538-42 (2013).9λ Vazirij N., Thuillierj R., Favreauj F.D., Eugene, M., Milinj S.&Chatauretj N.P.Analysis of machine perfus1n benefits in kidney grafts: apreclinical study.J.Transl Med.25，9-15 (2011).10、Lindell，S., Nobel, M., Rankin, M., et al.0ptimal pH for simple coldstorage or machine perfus1n of dog kidneys with Uff solut1n.Transpl.1nt.11，208-11 (1998).1K Hauetj T., Goujon, J.M.，Vandewallej A., et al.Trimetazidine reducesrenal dysfunct1n by limiting the cold ischemia/reperfus1n injury inautotransplanted pig kidneys.J.Am.Soc.Nephrol.11，138 - 148 (2000).12、Fahy，G.M.& Alij S.E.Cryopreservat1n of the mammalian kidney I1.demonstrat1n of immediate ex vivo funct1n after introduct1n and removal of7.5 M cryoprotectant.Cryob1logy 35， 114-31 (1997).
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种不将肾脏完全离体，使得血管缝合变得简单，而且缝合时间缩短，血管损伤减少的家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法。
[0006]本发明提供的家兔肾脏在体低温机械灌注模型由下述方法构建。构建方法的具体步骤如下:
1、术前准备
每次挑选两只3.2-3.8kg的雄性家兔在术前36-48h撤去饲槽，术前禁食36_48h，但需要给予充足水分。
[0007]2、术中操作
2.1麻醉抓取禁食后的雄性家兔，称取体重。按3ml/kg右耳缘静脉注射1%的戊巴比妥钠溶液。待家兔出现角结膜反应消失或迟钝，钳夹反射消失，呼吸平稳，身体紧张度降低时，表示麻醉完成。固定头皮针，建立静脉通道，静注5%葡萄糖溶液，维持家兔基础体温(38±0.50Oo
[0008]2.2固定将加热板放在手术台上，温度设定为45.(TC。将家兔放在加热板上，采取仰卧位固定家兔四肢和头部，保持呼吸通畅。
[0009]2.3备皮自剑突至耻骨联合腹部正中切口的备皮，同时将左腹部及左腰部充分备皮。左股内侧备皮，贴上电刀负极板。同时将肛温探头插入肛门，注意将粪便排出后插入。
[0010]2.4洗手、消毒、铺巾。
[0011]2.5开腹连接好电刀、吸引器后常规开腹，采用腹部正中切口，自剑突下至耻骨联合上3-5cm，将皮肤划开。发现出血时，可采用纱布按压法和电凝法止血，少用结扎法。待皮肤切口出血止住后，再用电刀沿腹白线切开肌肉。注意切开肌层时一定要稍稍提起肌肉，防止损伤腹腔脏器。肌层出血较多，血液易渗出，常采用电凝止血或切口缝扎法止血。确定血