蔗糖浓度。不需要向血清型1和 18C添加蔗糖。然后将浓缩的糖进料至玻璃瓶，冻干，然后保存在-25°C±5°C。
[0072] (2)结合过程
[0073] 对于血清型1、3、4、5、9N、9V、14和18C进行水性结合，以及对于血清型2、6A、6B、 7F、19A、19F和 23F进行DMSO结合。
[0074] 步骤1:溶解
[0075] 水性结合
[0076] 对于血清型3、4、5、9队听和14，在室温解冻以及平衡冻干的活化的糖-〇^ 197混合 物。然后在0.IM磷酸钠缓冲液中，以与血清型的通常比值，重建冻干的活化的糖_CRM197。 对于血清型1和18C，以0.IIL磷酸钠/ILCRM197溶液的通常比值，在CRM197于IM磷酸氢 二钠的溶液中，重建冻干的糖。
[0077]DMSO结合
[0078] 在室温平衡并且在DMSO中重建冻干的活化的糖血清型2、6A、6B、7F、19A、19F、23F 和冻干的CRM197载体蛋白。
[0079] 步骤2:结合反应
[0080] 水性结合
[0081] 对于血清型1、3、4、5、9队听、14和18(：，通过添加氰基硼氢化钠溶液（10〇1^/1^)开 始结合反应，以达到1. 0-1. 2摩尔氰基硼氢化钠/摩尔糖。在23°C至37°C温育反应混合物 44-96小时。根据血清型调节温度和反应时间。然后将温度降低至23°C±2°C，并且添加 0. 9%氯化钠至反应器。添加硼氢化钠溶液（lOOmg/mL)以达到1. 8-2. 2摩尔当量的硼氢化 钠/摩尔糖。在23°C±2°C温育混合物3-6小时。该过程还原存在于糖上的任何未反应的 醛。用0.9%氯化钠稀释混合物，并且使用1.2ym预过滤器过滤稀释的结合混合物至保留 容器中。
[0082]DMSO结合
[0083] 对于血清型2、64、68、7?、19八、19?和23?，以0.8 8-1.258糖/^冊197的比值范围 混合活化的糖和CRM197载体蛋白。通过以0. 8-1. 2摩尔的氰基硼氢化钠与1摩尔活化的糖 的比值，添加羟基硼氢化钠溶液（lOOmg/mL)开始结合反应。添加WFI至反应混合物达到 1% (v/v)目标，并且在23°C±2°C温育该混合物11-27小时。添加lOOmg/mL硼氢化钠溶 液（通常是1. 8-2. 2摩尔当量硼氢化钠溶液/摩尔活化的糖）和WFI(目标5%v/v)至反 应，并且在23°C±2°C温育3-6小时。该过程还原存在于糖上的任何未反应的醛。然后，用 0. 9%氯化钠稀释反应混合物，并且使用I. 2ym预过滤器过滤稀释的结合混合物至保留容 器中。
[0084] 步骤3:超滤
[0085] 在具有最小20体积0. 9%氯化钠或缓冲液的IOOkDaMWCO超滤过滤器上，浓缩和 渗滤稀释的结合混合物。废弃渗透物。
[0086] 步骤4:无菌过滤
[0087] IOOkDaMWCO渗滤之后，通过0.22ym过滤器过滤渗余物。在过滤的产物上进行过 程质量控制（糖含量、游离蛋白、游离糖、残余的DMSO和残余的氰化物；对于DMSO结合，除 此外残余的DMSO)。进行过滤的渗余物的过程质量控制以确定是否需要另外的浓缩、渗滤 和/或稀释。必要时，用〇. 9%氯化钠稀释过滤的结合物以达到小于0. 55g/L的最终浓度。 在该阶段进行糖含量、蛋白含量和糖：蛋白质比值的释放测试。最后，过滤（0.22ym)结合 物，并且进行释放测试（外观、游离蛋白、游离糖、内毒素、分子大小确定、残留的DMS0、糖识 别、CRM197识别）。将最终本体浓缩的溶液保存在2°C_8°C。
[0088] 实施例3:配制多价肺炎球菌结合疫苗
[0089] 基于批量体积和大部分糖的浓度，计算最终的本体浓缩物所需的体积。在所需的 0.85%氯化钠（生理盐水）的量后，添加聚山梨酯80和琥珀酸缓冲液至预标记的配制容器 中，添加本体浓缩物。然后充分混合并且通过0. 22ym的膜灭菌过滤制品。在添加本体磷 酸铝期间及以后，轻轻地混合配制的本体。如果必要，检测并调节pH。将配制的本体产物保 存在2-8°C。0. 5ml体积的产物包含2yg每种糖，除了在4yg的6B;大约34ygCRM197载体 蛋白；0? 125mg元素铝（0? 5mg磷酸铝）佐剂；4. 25mg氯化钠；295yg琥珀酸钠缓冲液；和 100Ug聚山梨酯80〇
[0090] 实施例4 :多价肺炎球菌结合疫苗的免疫原性
[0091] 测试多价肺炎球菌疫苗，即实施例3中制备的疫苗组合物（SK-15)在兔中诱导免 疫原性应答的能力。这些免疫原性效果通过血清IgG浓度的抗原特异性ELISA和抗体功能 的调理吞卩莖（opsonophagocytic)测定（OPA)来表征。用计划的人类临床剂量的各种多糖 (2yg每种PS，除了 4ug6B)，在第O周和第3周使新西兰白兔肌内免疫。免疫后每3周，采 样血清。
[0092] 测量血清塑特异件IgG浓度
[0093] 以500ng/孔将每种血清型的荚膜多糖（PnP)涂覆在96孔板上。从每个受试者采 样等效量的血清，并且将其汇集为组。依次用包含4ug/mL吐温20 (C-PS)和4ug/mL血清型 22F荚膜多糖（PnP22F)的抗体稀释缓冲液稀释血清池10次，然后在室温反应30分钟。用 洗涤缓冲液洗涤板5次，然后用预吸附和稀释的50uL血清涂覆孔板，并且使其在室温温育 18小时。以相同的方式洗涤孔板，然后将山羊抗兔IgG-碱性磷酸酯酶结合物（1:50000)添 加至每个孔，随后在室温温育2小时。根据以上描述的洗涤板，并且添加作为基质的lmg/mL 对硝基苯胺缓冲液至每个孔，然后在室温温育2小时。通过添加50uL3MNaOH淬灭反应， 并且在405nm和690nm处测量吸光度。作为比较例，使7价疫苗（Prevnar7，Pfizer)和13 价疫苗（Prevnar13,Pfizer)经受相同的过程。结果示于图1-15。
[0094] 功能免痔原件测试（OPA)
[0095] 通过测试OPA测定中的血清，评估抗体功能。从每个受试者采样等效量的血清， 汇集成组并且稀释10次。根据血清型将肺炎链球菌培养在THY培养基中，并且稀释至 1000CFU/10uL。混合200uL调理缓冲液、IOuL稀释的血清、和IOuL稀释的肺炎链球菌，并使 其在室温反应1小时。添加预分化的HL-60细胞和补体的混合物，并使其在0)2温室（37°C) 中反应1小时。降低温度以停止吞噬作用，并且将5uL反应物涂到预干燥30-60分钟的琼 脂板上。在CO2温室（37°C)中温育板12-18小时，然后计数菌落。将OPA效价表示为观察 到50%死亡的稀释速率。作为比较例，使13价疫苗（Prevnar13,Pfizer)经受相同的过 程。结果示于表1-3。
[0096] [表 1]
[0097]初次免疫3周后，15种多糖血清型的OPA效价
【主权项】
1. 一种多价免疫原性组合物，包含：15种不同的多糖-蛋白质结合物以及生理用载体， 其中，每种所述多糖-蛋白质结合物包含来自结合至载体蛋白的肺炎链球菌的不同血清型 的荚膜多糖，并且所述荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F* 23F制备。
2. 根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其中，所述载体蛋白是CRM 197。
3. 根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
4. 根据权利要求3所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂是铝类佐剂。
5. 根据权利要求4所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂选自由磷酸铝、硫酸铝 和氢氧化铝组成的组。
6. 根据权利要求5所述的多价免疫原性组合物，其中，所述佐剂是磷酸铝。
7. -种药物组合物，用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答，所述药物组 合物包含免疫学有效量的权利要求1至6中任一项所述的多价免疫原性组合物。
8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述多价免疫原性组合物是单一 0. 5ml剂 量，被配制为包含： 除了在4 y g的6B，2 y g的每种糖； 大约34yg的CRM197载体蛋白； 〇? 125mg的元素铝（0? 5mg磷酸铝）佐剂；以及 作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。
【专利摘要】提供了包含15种不同的多糖-蛋白质结合物的免疫原性组合物。每种结合物包含由结合至载体蛋白的不同血清型肺炎链球菌，即，血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备的荚膜多糖。配制成包含铝类佐剂的疫苗的免疫原性组合物增加对于婴儿和儿童中的肺炎球菌疾病的应用范围。
【IPC分类】A61K38-00, A61K47-48, A61K31-70, A61P31-00
【公开号】CN104755102
【申请号】CN201380044326
【发明人】申珍焕, 梁智慧, 咸东洙, 朴万勋, 金勋, 卢明柱, 朴秀真, 梁先荣
【申请人】Sk化学公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年6月19日
【公告号】CA2877648A1, EP2865392A1, US20150190520, WO2013191459A1