多价肺炎球菌多糖-蛋白质结合物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多价免疫原性组合物，包含：通过将源自肺炎链球菌血清型1、2、3、4、 5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F的荚膜多糖（capsularpolysaccharide)结合 至载体蛋白如CRM197制备的15种不同的多糖-蛋白质结合物（缀合物，conjugate)。本发 明总体上涉及医学领域，并且具体涉及微生物学、免疫学、疫苗以及通过免疫预防婴儿、儿 童和成人中的肺炎球菌疾病。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae)是肺炎的主要原因。根据国家统计局 公布的2010死亡趋势原因，肺炎是10大死亡原因之一，每100, 000人中有14. 9人死亡，比 2000年增加82. 9%。世界卫生组织（WHO)还估算了在2012年，全球小于5岁的476, 000例 HIV阴性儿童死于肺炎链球菌感染，对于小于5岁的儿童，其占各种原因死亡儿童的5%。
[0003] 在1977年，RobertAustrian博士研制出14价肺炎球菌多糖疫苗来预防肺炎球 菌疾病，之后该疫苗发展至23价多糖疫苗。已经证明多价肺炎球菌多糖疫苗对于预防中老 年人和高危患者中的肺炎球菌疾病是有用的。然而，由于T细胞独立的免疫应答，所以婴儿 和幼儿对大多数的肺炎球菌多糖应答很差。7价肺炎球菌结合疫苗（7vPnC，Prevnar?:)包 含来自7种最普遍的血清型4、68、听、14、18(：、19?和23?的荚膜多糖。自从2000年在美国 获得批准，已经证实Prevnar是高度免疫原性的并且有效抵抗婴儿和幼儿中的侵袭性疾病 和中耳炎。现在，该疫苗在全世界约80个国家获得批准。Prevnar分别在美国、欧洲和世界 的其他地区覆盖了大约80-90 %、60-80 %和40-80 %的侵袭性肺炎球菌疾病（Iro)。正如预 期的，在引入Prevnar后的几年中收集的监测数据已经清楚地证实，在美国由被Prevnar覆 盖的血清型引起的侵袭性肺炎球菌疾病降低。然而，血清型的覆盖率限于一些地区，并且由 没有被Prevnar覆盖的血清型（特别是19A)引起的侵袭性肺炎球菌疾病增加。
[0004]咨询委员会的免疫实践（TheAdvisoryCommitteeonImmunizationPractices， ACIP)在2010年2月公布了对于用于接种新批准的13价肺炎球菌结合疫苗（PCV-13)的建 议。PCV-13是包含除包含在Prevnar中的7种血清型（4、6B、9V、14、18C、19F、23F)之外的 6种另外的血清型（1、3、5、6A、7F、19A)的肺炎球菌结合疫苗。根据美国活性细菌核心监测 (ActiveBacterialCoresurveillance，ABCs)，在已知为小于5岁的儿童中的致病血清型 的IPD病例中的总共64%被PCV-13覆盖。在2007年，在小于5岁的儿童的4600例IPD中 的仅70病例被PCV7覆盖，而2900病例被PCV-13覆盖，其占主要部分。现在，正在研制15 价肺炎球菌结合疫苗，其覆盖发病率随血清型替换而增加的另外的血清型。
【发明内容】
[0005] 因此，本发明提供了用于预防婴儿、儿童和成人的肺炎球菌疾病的多价免疫原性 组合物，该多价免疫原性组合物包含源自15种肺炎球菌血清型、包括血清型2和9N的荚膜 多糖。
[0006]具体地，本发明提供 了包含血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F 和23F的15价肺炎球菌结合物（PCV-15)组合物。
[0007] 技术方案
[0008] 根据本发明的一个方面，提供了多价免疫原性组合物，其包含15种不同的多 糖-蛋白质结合物和生理用载体，其中，每种结合物包含源自结合至载体蛋白的肺炎链球 菌的不同血清型的荚膜多糖，并且荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、 19A、19F和 23F制备。
[0009] 在根据本发明的多价免疫原性组合物中，载体蛋白可以是CRM197。根据本 发明的多价免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，例如，包含铝类（铝基，基于铝的， aluminum-based)佐剂的佐剂。佐剂可以选自由磷酸错、硫酸错和氢氧化错组成的组，并且 优选的是磷酸铝。
[0010] 根据本发明的进一步方面，提供了用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫 应答的药物组合物，该药物组合物包含免疫学有效量的所述免疫原性组合物。
[0011] 在一个实施方式中，药物组合物可以是被配制为包含以下的免疫原性组合物：除 了在4yg的6B，2yg的每种糖；大约34ygCRM197载体蛋白；0? 125mg元素错（0? 5mg磷酸 铝）佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。
[0012] 技术效果
[0013] 多价免疫原性组合物包含源自15种不同的肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N) 的荚膜多糖，从而导致升高的血清IgG效价（滴度，titer)和功能性抗体活性。因此，可以 将该多价免疫原性组合物有利地用于预防婴儿、儿童和成人中的肺炎球菌疾病。
【附图说明】
[0014] 图1至图15示出了在二次注射本发明的和比较例（Prevnar7和Prevnar13)的 疫苗组合物3周后（即，总共6周），测得的血清型特异性IgG的水平。
【具体实施方式】
[0015] 发明模式
[0016] 已经通过具有抗生素抗性和多重抗药性的一些血清型进行了血清型替 换。血清型分布的地区差异导致地区覆盖Prevnar的差异。（HarboeZB,Benfield TL,Valentiner-BranthP，etal.TemporalTrendsinInvasivePneumococcalDisease andPneumococcalSerotypesover7Decades.ClinInfectDis2010;50:329-37)。因 此，没有理由除去现有的肺炎球菌结合疫苗中的任何血清型。相反，需要通过添加血清型进 一步扩大覆盖率。
[0017]在2008年，全球肺炎球菌血清型项目（PneumococcalGlobalSerotypeProject， GSP)发布了基于选择的1980年至2007年的iro数据的报道，示出继血清型18C之后，血清 型2是前20个全球血清型中第11个最高发病率的血清型。此外，SamirK.Saha等人报道 血清型2可能成为威胁，因为血清型2具有在孟加拉国引起肺炎球菌性脑膜炎的高可能性， 但是没有被包含在任何肺炎球菌结合疫苗中（SahaSK，AlEmranHM，HossainB，Darmstadt GLjSahaS,etal. (2012)StreptococcuspneumoniaeSerotype-2ChildhoodMeningitis inBangladesh:ANewlyRecognizedPneumococcalInfectionThreat.PLoSONE2012 ； 7 (3) :e32134)。因此，如果包含血清型2,则可以降低肺炎球菌疾病的数量，并且可以进一步 为接种PCV-13可能发生的血清型替换做准备。
[0018] 肺炎球菌血清型示出不同的年龄分布格局。具体地，已经发现，与24个月至59个 月大的儿童相比，血清型9N对0个月至23个月大的婴儿相对重要。血清型9N是继包含在PCV-13中的13血清型之后第14个最常见的。这表明包含血清型9N将有助于减少特别是 婴儿中的肺炎球菌疾病。
[0019] 本发明提供了包含源自15种肺炎球菌血清型（包括血清型2和9N)的荚膜多糖的 多价免疫原性组合物。具体地，本发明提供了包含以下的多价免疫原性组合物：15种不同 的多糖_蛋白质结合物和生理用载体，其中，每种结合物包含来自结合至载体蛋白的肺炎 链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且该荚膜多糖由血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、 14、18C、19A、19F和 23F制备。
[0020] 荚膜多糖可以由本领域技术人员已知的标准技术制备。为了减少活化的荚膜多糖 的粘度或增加其溶解度，可以降低荚膜多糖的大小。在本发明中，由肺炎链球菌的血清型1、 2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖。通过分离方法制备这些 肺炎球菌结合物，并且将其配制成单剂量的制剂。例如，使每种肺炎球菌多糖血清型在大豆 基（基于大豆的，soy-based)培养基中生长，然后通过离心、沉淀、和超过滤纯化。
[0021] 载体蛋白优选的是无毒的和非反应原性的并且可得到充足量和纯度的蛋白。载 体蛋白应当可进行标准结合程序。在本发明的多价免疫原性组合物中，载体蛋白可以是CRM197。CRM197是从生长在基于酪蛋白氨基酸（casaminoacid)和酵母提取物的培养基上的 棒状杆菌白喉菌株C7 (M97)的培养物分离的白喉毒素的无毒变体（S卩，类毒素）。通过超 过滤、硫化铵沉淀和离子交换色谱法纯化CRM197。可替代地，根据美国专利号5, 614, 382重 组制备CRM197。
[0022] 其他白喉毒素也适于用作载体蛋白。其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素如 破伤风类毒素、百日咳类毒素；霍乱类毒素（W02004/083251);大肠杆菌（E.coli)