艰难梭菌抗原的制作方法
【专利说明】艰难梭菌抗原
[0001] 本发明涉及用于艰难梭菌（Clostridiumdifficile)感染（CDI)的预防/治疗/ 抑制的抗原。还提供了用于产生所述抗原的方法、用于产生结合所述抗原的抗体的方法、以 及所述抗体用于CDI的预防/治疗/抑制的用途。
[0002] 目前艰难梭菌感染（⑶I)是全世界医院的主要难题。该细菌导致本身表现为从轻 微自限性腹泻至可能危及生命的、严重的结肠炎的几种形式的医院的、与抗生素相关的疾 病。老年患者最容易处于这些可能危及生命的疾病的风险中且⑶I事件在过去10年已显 著增加。2010年，英国存在超过21，000例的⑶I，其中有超过2, 700例相关的死亡。每年 CDI花费英国NationalHealthService超过￡500M。
[0003] 艰难梭菌的各种菌株可通过许多方法来分类。其中最常用的一种是聚合酶链式反 应（PCR)核糖体分型（ribotyping)，其中PCR用于扩增艰难梭菌的16S-23SrRNA基因的基 因间隔区。反应产物由此提供识别分离株的细菌核糖体型（ribotype)的特征性条带图谱。 毒素分型（Toxinotyping)是另一种分型方法，其中源自编码艰难梭菌毒素的DNA的限制性 图谱用于识别菌株毒素类型（toxinotype)。在不同菌株的毒素基因之间观察到的限制性图 谱的差异还表明了艰难梭菌毒素家族内的序列变异。例如，与毒素类型III毒素B中相同 区域相比，毒素类型0毒素B的C-末端60kDa区域存在约13%序列差异。
[0004] 艰难梭菌的菌株产生多种毒性因子，其中以下几种蛋白毒素值得注意：毒素A、 毒素B和，在一些菌株中与产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens)丝毫毒素（iota toxin)类似的二元毒素。毒素A是在感染的病理学中起作用并可影响肠道定殖过程的大的 蛋白细胞毒素/肠毒素。CDI的爆发已报道伴随毒素A阴性/毒素B阳性菌株，其表明毒素 B还能够在疾病病理学中起关键作用。
[0005] 编码毒素A和毒素B(分别Mw308k和Mw269k)的基因序列是已知的-参见，例 如Moncrief等人（1997)Infect.Immun63:1105-1108。两种毒素具有高度序列同源性，并 被认为起因于基因复制。毒素还共享共同的结构（参见图1)，即N-末端葡糖基转移酶结构 域、中央疏水区、四个保守的半胱氨酸、和长系列的C-末端重复单元（RU)。
[0006] 毒素A和B两者经由多步骤机制发挥其作用机制，该多步骤机制包括结合至细胞 表面上的受体，内化随后易位并将效应器结构域释放进细胞胞质中，以及最终细胞内作用。 所述的作用机制涉及Rho家族的小GTP酶的失活。在这点上，毒素催化葡萄糖部分（来自 UDP-葡萄糖）转移至Rho蛋白的氨基酸残基上。毒素A和B还包含半胱氨酸蛋白酶的形式 的第二酶的活性，其显示在易位后在效应器功能域释放进入细胞溶质中起作用。艰难梭菌 二元毒素通过涉及从NAD将ADP-核糖部分转移至其靶蛋白上的机制修饰细胞肌动蛋白。
[0007]目前用于治疗艰难梭菌感染的治疗方法依赖于抗生素，特别是甲硝唑和万古霉素 的使用。然而，在所有情况下这些抗生素是无效的并且20% -30%的患者经历该疾病的复 发。主要关注的是在英国出现的更强毒株，其于2002年在加拿大首次被确认。这些菌株， 包括属于PCR核糖体型027和毒素类型III的那些，导致⑶I，伴随直接可归因的多于先前 观察到的3倍的死亡率。
[0008] 由于目前抗生素的效力似乎在下降，因此，特别迫切需要新的疗法。
[0009] -种方法是结合毒素A和/或毒素B并中和毒素A和/或毒素B的活性的抗体的 使用。这基于不释放这些毒素的艰难梭菌的菌株，所谓非产毒的菌株，不导致CDI的知识。 例如，可将动物免疫，收集其血清并纯化抗体用于施用至患者_这被定义为被动免疫。在另 一个方法中，有CDI的患者或处于发展此类感染的风险中的受试者可用导致增加循环和针 对毒素A和/或毒素B的粘膜抗体的抗原来免疫-这被定义为主动免疫。
[0010] 对于主动和被动免疫两者的关键需要是用其分别免疫患者或动物的合适的抗原 的可用性。这些可包括可从其中已培养艰难梭菌的合适的产毒素菌株的培养基中纯化的天 然毒素。该方法存在几个缺点。毒素A和毒素B两者仅以少量存在于培养基中，并且很难 纯化而不产生显著损失。因此，其既昂贵又难以获得满足世界范围需要的必需量。此外，天 然毒素不稳定并有毒。
[0011] 以上提及的问题已导致存在很少可用的艰难梭菌疫苗候选物。至今，在后期开发 的唯一CDI疫苗基于天然（即天然存在）的毒素A和B的混合物，其已通过化学修饰被广 泛地灭活（Salnikova等人 2008,JPharmSci97:3735-3752)。
[0012] 天然毒素（及其类毒素）的一种备选用途涉及设计、开发并使用源自毒素A和B 的重组片段。旨在用于治疗/预防艰难梭菌感染的现有抗原的实例包括基于毒素A或毒素 B的C-末端重复单元（RU)的肽-参见，例如，WO00/61762。然而，伴随此类抗原的问题在 于，其或是弱免疫原性（即抗原产生差的抗体滴度），或，当产生较高的抗体滴度时，该抗体 表现出针对艰难梭菌细胞毒性活性的差的中和效力（即产生中和不足的抗体）。
[0013] 因此，本领域存在对能够特定致力于艰难梭菌感染（CDI)的新疫苗/治疗方法/ 疗法的需要。本发明通过解决了一个或更多个以上提及的问题而致力于该需要。
[0014] 总之，本发明提供了能够诱导针对艰难梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反 应的抗原。本发明还提供了用于制备重组抗原的方法、及其作为免疫原能够大规模制备治 疗性抗体的用途。所述抗体能够诱导针对艰难梭菌毒素A和/或B的有效的毒素中和反应， 并因此具有预防和/或治疗应用。
[0015] 如以上提及的（参见，例如，WO00/61762)，在先研宄描述了基于毒素A和/或毒 素B的C-末端重复单元（RU)的疫苗制剂。所述RU片段具有差的毒素中和效应，和/或难 以大批量制造。
[0016] 相比之下，本发明提供了不包含或包括毒素A和/或毒素B的一个或更多个（例 如，全部）的重复单元（RU)的基于毒素A和/或毒素B的艰难梭菌多肽抗原。本发明的多 肽抗原由以下组成或包含以下：来自毒素的中心区域的一个或更多个结构域。本发明的所 述抗原表现出良好的毒素中和性免疫应答和/或容易大批量制造。
[0017]本发明人已出人意料地确定了由以下组成或包括以下的艰难梭菌抗原多肽提供 与包含一个或更多个RU的相应艰难梭菌毒素片段相比（参照表1和2)被大大提高的保护 性（毒素中和性）免疫应答：来自效应器结构域和RU的区域之间的中心区域的一个或更多 个功能域（参见图1)。在一个实施方案中，艰难梭菌抗原多肽包含毒素B片段。
[0018] 表1和2中的数据的比较证实了本发明的多肽抗原引起比基于包括艰难梭菌毒素 的一个或更多个C-末端重复单元的相应多肽诱导的毒素中和性免疫应答有效得多的毒素 中和性免疫应答（由指定的多肽TxB2示例）。更详细地，18周免疫期后，由本发明的多肽 提供的毒素中和性免疫应答比由相应的含RU的多肽提供的毒素中和性免疫应答高60倍更 多。因此，本发明的多肽诱导有效的毒素中和性免疫应答。
[0019] 出于许多理由，这些发现是出人意料的。最重要地，其中动物单独地接种了 艰难梭菌毒素的中心结构域片段（由残基510-1530组成的片段，和由残基1530-1750 组成的片段）的先前研宄报道了这些片段未能引起毒素中和性抗体的产生（Kink& Williams(1993)Infect.Immun. 66:2018-2025)。因此，这项研宄表明，残基 510-1530 内 的结构域没有贡献有意义的抗体结合结构决定簇。此外，进一步的研宄已显示了针对完 整艰难梭菌产生的抗体，尽管识别由全部RU区域单独组成的片段，未能识别由基于艰难 梭菌相同毒素的残基901-1750的中心毒素区域组成的片段（Genth等人，（2000)Infect. Immun.，68:1094-1101)。因此，这项研宄表明，残基901-1750内的结构域没有贡献有意 义的抗体结合结构决定簇。此外，虽然针对艰难梭菌毒素的效应器结构域（残基1-543) 的抗体已显示引起有效的免疫应答（通过简单的酶免疫分析测量），但所述抗体没有毒 素中和活性，显示抗体与毒素的结合并不相应于毒素中和（Roberts等人（2012)Infect. Immun.，80:875-882)。共同地，因此，基于位于效应器结构域和重复区域之间的艰难梭菌毒 素的中心结构域的重组免疫原能够诱导此类有效的毒素中和性免疫应答是非常出人意料 的。
[0020] 本发明的一个方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽：具有与由艰 难梭菌毒素A序列的残基1500-1700 (例如1450-1750、或1400-1800)组成的氨基酸序列的 至少80%序列同一性的氨基酸序列，条件是该多肽不是包含艰难梭菌毒素A的氨基酸残基 1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366之间的一个或更多个（例如全部）RU 单元的多肽。在一个实施方案中，所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨基酸残基1851-2710 和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
[0021] 本发明的另一个方面提供了包含以下、由以下组成、或包括以下的多肽：具有与由 艰难梭菌毒素A序列的残基542-1850组成的氨基酸序列的至少80 %序列同一性的氨基酸 序列，条件是该多肽不包含艰难梭菌毒素A的残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残 基1853-2366之间的任何RU单元。在一个实施方案中，所述多肽缺少艰难梭菌毒素A的氨 基酸残基1851-2710和/或艰难梭菌毒素B的残基1853-2366的序列。
[0022] 提及艰难梭菌毒素A序列意指天然存在的艰难梭菌毒素A的氨基酸序列（还称为 艰难梭菌毒素A参考序列）。本领域技术人员容易理解此类序列的实例，并且仅用于说明的 目的，一些更常见的天然存在的毒素A序列在本说明书中而且贯穿文献被确定（参见，例如 SEQIDN0s:l&3)。