下为4 μ g ;大约34 μ g的CRM197载体蛋白；0. 125mg元 素铝（0. 5mg磷酸铝）佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲液。将该液体填充至无 任何防腐剂的单剂量注射器中。震荡之后，该液体变为即可用于肌内给药的均匀、白色悬浮 液的疫苗。
[0037] 在进一步的实施方式中，可以以单次给药给予本发明的组合物。例如，可以以适当 的时间间隔如1、2、3、4、5或6个月间隔或它们的组合给药2、3、4或更多次本发明的疫苗组 合物。免疫时间表可以遵循对于Prevnar疫苗指定的时间表。例如，婴儿和幼儿抵抗由肺 炎链球菌引起的侵袭性疾病的常规时间是在2、4、6和12-15个月的年龄。因此，在该方面， 给药4次该组合物，即在2、4、6和12-15个月的年龄。
[0038] 本发明的组合物还可以包含来自肺炎链球菌的一种或多种蛋白。适于包含在组合 物中的肺炎链球菌蛋白的实例包括国际专利申请W002/083855中识别的那些，以及国际专 利申请W002/053761中描述的那些。
[0039] 可以通过本领域技术人员已知的一种或多种给药途径将本发明的组合物给药至 受试者，如肠胃外、透皮、或经粘膜、鼻内、肌内、腹膜内、皮内、静脉内或皮下途径，并且据此 配制本发明的组合物。在一个实施方式中，可以作为液体制剂通过肌内、腹膜内、皮下、静脉 内、动脉内、或经皮注射或呼吸道粘膜注射给药本发明的组合物。用于注射的液体制剂可以 包括溶液等。
[0040] 可以以单位剂量小瓶、多剂量小瓶或预填充的注射器的形式配置本发明的组合 物。用于液体制剂的药学上可接受的载体包括水或非水溶剂、悬浮液、乳剂或油。非水溶剂 的实例包括丙二醇、聚乙二醇和油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶剂、乳剂或悬浮液、 生理盐水和缓冲溶液。油的实例包括植物油或动物油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花子油、 鱼肝油、合成的油如海洋油，以及由牛奶或鸡蛋得到的脂质。药用组合物可以是等渗的、高 渗的或低渗的。然而，优选的是用于输注或注射的药用组合物是基本上等渗的。因此，等渗 或高渗对于存储组合物可能是有利的。当药用组合物是高渗的时，在给药前，可以将组合物 稀释至等渗。张度剂可以是离子张度剂如盐，或非离子张度剂如碳水化合物。离子张度剂包 括氯化钠、氯化钙、氯化钾和氯化镁，但不限于此。非离子张度剂包括山梨醇和丙三醇，但不 限于此。优选地，至少包括一种药学可接受的缓冲液。例如，当输注或注射药用组合物时， 优选的是在具有pH 4至10 (如pH 5-9或6-8)的缓冲能力的缓冲液中配制。缓冲液可以 选自由TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘 氨酸、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、和三乙醇胺缓冲溶液组成的组。
[0041] 具体地，如果将药用组合物用于肠胃外给药，那么缓冲液可以选自为美国药典 (USP)所接受的那些。例如，缓冲液可以选自由一元酸如乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甘油酸和乳 酸；二元酸如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；多元酸如 柠檬酸和磷酸；以及碱如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺和TRIS组成的组。对于肠胃外给 药，载体（用于皮下、静脉内、关节内、和肌肉内注射）包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液、 右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液和不挥发油。用于静脉给药的载体包括林格氏右旋糖溶 液或类似基于右旋糖的输注溶液、营养补剂和电解质补剂。实例包括具有或不具有表面活 性剂和药学上可接受的佐剂的无菌液体，如水和油。通常，水、生理盐水、右旋糖溶液、相关 的糖溶液和二醇如丙二醇或聚乙二醇（特别是聚山梨醇酯80)适合于注射。油的实例包括 动物和植物油、花生油、大豆油、橄榄油、葵花子油、鱼肝油、合成油如海洋油以及来自于牛 奶或蛋的脂质。
[0042] 本发明的制剂可以包含表面活性剂。优选地，聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（通常称 为吐温），特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;环氧乙烷（EO)、环氧丙烷（PO)、环氧丁烷（BO) 的共聚物（如D0WFAX?);具有不同数目重复的乙氧基（氧基-1，2-乙二基）基团的辛苯 昔醇（oxtocynol)，特别是辛苯昔醇-9 (Triton-100);乙基苯氧基聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如卵磷脂；壬基酚乙氧基化物如Tergitol? NP系列；月桂醇、鲸蜡 醇、硬脂醇、油醇衍生的聚氧乙烯脂肪醚（Brij表面活性剂），特别是乙二醇单月桂基醚 (Bri j30);称为斯盘（SPAN)的脱水山梨醇醚，特别是脱水山梨糖醇三油酸酯（斯盘85)和 脱水山梨糖醇单月桂酸酯，但不限于此。优选地将吐温80包含在乳剂中。
[0043] 可以使用表面活性剂如吐温80/斯盘85的混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（如 吐温80)和辛苯昔醇如Triton X-100的组合也是适合的。月桂醇聚醚9和吐温和/或辛 苯昔醇的组合也是适合的。优选地，包含的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯（如吐温80)的量是 0.01 %至1 % (w/v)，特别是0. 1 % ;包含辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇（如 Triton X-100)的量是0.001%至0.1% (w/v)，特别是0.005%至0.02%;包含的聚氧乙 稀醚（如月桂醇聚醚9)的量是0. 1%至20% (w/v)，可能地0. 1%至10%，特别是0. 1%至 1%或约0.5%。在一个实施方式中，通过释放控制系统传递药用组合物。例如，可以将静脉 内输注、透皮贴剂、脂质体或其它途径用于给药。一个方面，可以使用大分子如微球或植入 物。
[0044] 以上公开一般性地描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以得到更全面的理 解。然而，描述这些实施例仅是用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。 实施例
[0045] 实施例1 :肺炎链球菌荚膜多糖的制备
[0046] 根据本领域技术人员已知的进行肺炎链球菌的培养和荚膜多糖的纯化。肺炎链球 菌血清型是从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)得到 的。肺炎链球菌由在血液琼脂培养基中的荚膜、不动性、革兰氏阳性柳叶刀形双球菌和α 溶血表征。通过使用特异性抗血清的荚膜肿胀试验识别血清型（美国专利号5, 847, 112)。
[0047] 细朐库的制各
[0048] 生成几代种子原液（seed stock)以扩大菌株并且除去动物源组分（F1、F2和F3 代）。产生另外两代种子原液。由F3小瓶制成第一另外的代，并且由第一另外的代的小瓶 制成随后的代。冷冻（<-70°C)保存种子小瓶，用合成甘油作为冷藏剂。为了制备细胞 库，使所有培养物在大豆基培养基上生长。冷冻之前，通过离心浓缩细胞，除去用尽的培养 基，并且将细胞颗粒重新悬浮于包含冷藏剂（如合成甘油）的新鲜培养基中。
[0049] 接种
[0050] 使用来自工作细胞库的培养物来接种包含大豆基培养基的种子瓶。使用种子瓶来 接种包含大豆基培养基的种子发酵罐。
[0051] 种子发酵
[0052] 在具有受控的温度和pH的种子发酵罐中进行种子发酵。在达到目标光密度之后， 使用种子发酵罐接种包含大豆基培养基的生产发酵罐。
[0053] 牛产发酵
[0054] 生产发酵是发酵的最后步骤。控制温度、pH和搅拌速度。
[0055] 失活
[0056] 通过添加灭活剂停止生长后，终止发酵。灭活后，冷却发酵罐中的内容物，并且调 节其pH。
[0057] 纯化
[0058] 离心和过滤发酵罐中的肉汤以除去细菌细胞碎片。使用几次浓缩/渗滤操作、沉 淀/洗脱和深层过滤除去污染物并纯化荚膜多糖。
[0059] 实施例2 :制备肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197结合物
[0060] 根据不同的途径活化不同血清型的多糖，然后将其结合至CRM197。活化处理包括降 低荚膜多糖的大小至目标分子量、化学活化和通过超滤更换缓冲液。将纯化的CRM197结合 至活化的荚膜多糖，并且使用超滤纯化结合物，以及最后通过〇. 22 μ m的过滤器过滤。过程 参数如pH、温度、浓度和时间如下。
[0061] (1)活化
[0062]步骤 1
[0063] 用注射用水、乙酸钠和磷酸钠稀释每种血清型的多糖至I. 0至2. Omg/mL的最 终浓度范围。对于血清型1，添加氢氧化钠（最终碱浓度0.05M)，并且在50°C ±2°C温 育该溶液。然后，将溶液冷却至21至25°C，并且通过添加 IM HCl停止水解，直到达到目 标pH 6. 0±0. 1。对于血清型3,添加 HCl (最终酸浓度0. 01M)，并且在50°C±2°C温育该 溶液。然后，将溶液冷却至21至25°C，并且通过添加 IM磷酸钠停止水解，直到达到目标 pH 6. 0±0. 1。对于血清型4,添加 HCl (最终酸浓度0. 1M)，并且在45°C±2°C下温育该溶 液。然后，将溶液冷却至21至25°C，并且通过添加 IM磷