病毒的细胞中表达反而升高；APS对P-selectin的 影响与E-selectin相似，但在时间上有差异。E-selectin和P-selectin均为炎症中最初 出现的黏附分子，但是E-selectin需经基因转录和蛋白质的合成过程，所以迟于P选择素。
[0036] (5)延长细胞培养时间，针对猪瘟病毒可以抑制被感染细胞凋亡，但是影响周围未 感染细胞使之大量凋亡的特性，筛选出猪瘟调控细胞凋亡的对应基因和受体。
[0037] 第二步，确定与黄芪多糖搭配使用的疫苗，具体的确定过程如下：
[0038] (1)选取目前我国生产的猪瘟疫苗，主要有3种，即猪瘟兔化弱毒脾淋苗、猪瘟兔 化弱毒组织苗和猪瘟细胞苗。
[0039] (2)取猪的前腔静脉血，泛影葡胺密度梯度法提取外周血单个核细胞并培养。
[0040] ①准备抗凝管：10%柠檬酸葡萄糖（0. 15M柠檬酸钠，0. 076M柠檬酸，0. 287M葡萄 糖）抗凝；
[0041] ②猪前腔静脉取血，放入抗凝管中；
[0042] ③在IOmL离心管中加入3mL淋巴细胞分离液；
[0043] ④取I. 5mL抗凝血与等量PBS充分混匀，用微量移液管沿管壁缓慢叠加于分层液 面上，注意保持清楚的界面。水平离心（600g，20min);
[0044] ⑤离心后管内分为三层，下层主要是粒细胞和红细胞，中层是淋巴细胞分离液，上 层是血浆和PBS缓冲液，在上层和中层接触面处是以单个核细胞为主的白色薄层，为我们 需要提取的细胞，包括单核细胞，淋巴细胞和血小板；
[0045] ⑥从白色层小心吸取单个核细胞，置入另一离心管中，加入5倍以上体积的 RPMI1640培养液，4°C离心（600g，IOmin)，洗涤两次；
[0046] ⑦细胞计数：
[0047] 取一个干净的血球计数板，盖上盖玻片，从盖玻片边缘滴入细胞悬液使之充满计 数板和盖片之间。显微镜下找出计数板上的方格，计算四角大格内总细胞数。重复两次取 均值。按下面公式计算细胞浓度：
[0049] ⑧细胞活力检测：取一滴细胞悬液与一滴0. 2 %台盼蓝染液混合，于血球计数板 上计数，死细胞可被染成蓝色，活细胞不着色。数100个淋巴细胞，计算出活细胞百分率
[0050]
[0051] 细胞存活百分率在99%以上。
[0052] (3)以0. 05 μ g/mL疫苗，10 μ g/mL黄芪多糖和IO6个/mL预处理的细胞浓度共同 培养，并设置对照组，MTT法检测细胞增殖和活性；
[0053] 测定原理：
[0054] 活细胞特别是增殖期的细胞在能量代谢过程中，可通过线粒体中的琥珀酸脱氢 酶作用，把淡黄色的四甲基偶氮挫盐（3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)通过还原作用转化为蓝色结晶沉积于细胞内或周围，细胞增殖 程度与上面形成蓝色结晶的量呈正相关。死细胞和红细胞由于不能进行线粒体能量代谢， 也就不能转化MTT产生代谢产物蓝色结晶。能量代谢在非增殖状态的细胞中比处于增殖状 态的活化的细胞中低很多，所以产生的蓝色结晶的量也少很多，而增殖状态的活化的细胞 能量代谢都很活跃，所以产生的蓝色结晶沉积也多。这种沉积可通过酶标仪比色分析检测 到，即可了解细胞的增殖情况。
[0055] 实验步骤：
[0056] ①96孔板培养细胞，边缘孔用无菌水填充，每板设培养基对照和阴性对照（纯细 胞和培养基，无刺激物），每组设定3复孔；
[0057] ②每孔加入 10 μ L MTT 溶液（5mg/mL，即 0· 5% MTT)置 37°C，5% CO2孵育 4 小时；
[0058] ③配三联溶解液：10% SDS，5%异丁醇，0· 012mol/L HCL，蒸馏水溶解；
[0059] ④加入三联液100 μ L/孔，酶标仪OD 570nm (630nm校准）测量各孔的吸光值；
[0060] ⑤每组样品5个重复，OD值取平均数后算出SI (stimulation index):
[0061] SI =(样品孔平均OD值一培养基对照孔平均OD值）八阴性细胞对照一培养基对 照孔平均OD值）；
[0062] ⑥ConA作为阳性对照，刺激后培养24h、48h、72h计算SI，确定检测最佳时间为 48h ；
[0063] ⑦在48h根据细胞增殖最高的组，即SI最大值的组，确定病毒浓度：
[0064] (4)最终确认黄芪多糖与脾淋苗搭配使用对单个核细胞的增殖刺激最为明显；
[0065] 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是由外周血中 许多不同种类的细胞组成，包括单核细胞和T细胞，B细胞，NK细胞等免疫细胞。这些血细 胞在对抗外来病毒入侵和感染的免疫系统中起到了关键的作用。随着免疫细胞的体外实验 发展，PBMC已经成为人们体外检测猪免疫反应的重要对象，猪瘟病毒在感染的过程中也对 PBMC的功能有很大的影响。
[0066] 表1猪瘟疫苗加入细胞培养48小时后MTT法检测细胞增殖活性
[0067]
[0068] OD ：0ptical density ；SI Stimulation index.
[0069] 第三步，确定黄芪多糖搭配使用脾淋苗的剂量，具体方法是：
[0070] (1)病毒滴定：由于猪瘟疫苗没有提供半数感染量（50 % tissue culture infective dose，TCID5tl)，需要滴定病毒的单位浓度。
[0071] 免疫标记法：
[0072] ①铺板，将胰酶消化好的猪髋动脉血管内皮细胞（购买自中国科学院细胞库）调 整密度为IX 105/mL，加到96空细胞培养板中，160ul/well.大约24小时长至50% ;
[0073] ②用无血清的M199培养基将猪瘟病毒溶解并作连续10倍的稀释，从5mg/mL至 5 X lO'mg/mL ;
[0074] ③将稀释好的病毒接种到单层细胞上，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种 40 μ L，正常细胞对照作两纵排；
[0075] ④48小时后把培养液倒掉，用PBS洗三遍，自然晾干；
[0076] ⑤丙酮固定5到lOmin，PBS冲洗三次。
[0077] 直接免疫荧光标记法：滴加猪三价荧光抗体，放置密闭湿盒中室温作用40min。 PBS洗三次，自然干燥，甘油封片。
[0078] 间接免疫生物素酶标法：猪瘟高免血清56 °C灭活30min ;1:400稀释滴 加至单层细胞上，37 °C孵育1小时；PBS洗三遍，加入1:100稀释的生物素标记羊 抗猪二抗，37°C孵育1小时；加入辣根过氧化物酶标记的亲和素-生物素复合物 (avidin-biotin-peroxide complex，ABC)，室温 30min，PBS 洗三遍；加入 DAB (增敏二氨基 联苯胺，3, 3N_Diaminobenzidine Tertrahydrochloride)液避光 10 ~15min，室温显色。
[0079] (2)如图5所示，将不同浓度的黄芪多糖与lmg/mL脾淋苗相混合与细胞共同培养， MTT法检测细胞变化率和活性，结果如下：
[0080] 表2黄芪多糖浓度的筛选
[0081]
[0082] (3)可见当病毒的含量一定时随着黄芪多糖量的减少，即黄芪多糖加入的量从 20mg/mL到10mg/mL的情况下细胞活性是升高的，则说明黄芪多糖对猪瘟病毒引起的细胞 凋亡的抑制随着含量降低而升高；当黄芪多糖的含量从5mg/mL，2. 5mg/mL，降到I. 25mg/ mL时细胞活性降低，说明黄芪多糖对病毒引起的细胞凋亡的抑制降低。黄芪多糖为IOmg/ mL浓度抑制率为最佳；病毒对照组则最低。
[0083] (4)最终确定lmg/mL脾淋苗搭配黄苗多糖的最佳用量为10mg/mL。换算成实际养 殖户注射疫苗通用的头份，每头份含脾淋苗l〇mg，对应黄芪多糖lOOmg。
[0084] 第四步，确定黄芪多糖搭配使用脾淋苗的使用时间，具体方法为：
[0085] (1)选取12头仔猪分为4组，由于需要提前注射黄芪多糖，所以选择30日龄注射 疫苗；
[0086] (2)在注射疫苗前，分别在刚出生（1组），10日龄（2组），和20日龄（3组）注射 黄芪多糖针剂（剂量按照商用针剂说明书）和不注射（4组）。
[0087] (3)注射疫苗后14天检测仔猪体内IgG
[0088] (4)确定黄苗多糖搭配使用时间20日龄最佳，平均IgG为835 μ g/mL，而10日龄 和刚出生分别为752 μ g/mL，731 μ g/mL，对照组为710 μ g/mL。
【主权项】
1. 一种利用黄芪多糖加猪瘟脾淋苗进行猪瘟防治的方法，其特征在于：包括： (1) 药物配置 ① 黄芪多糖的配制：黄芪多糖配制成l〇〇mg/mL的溶液； ② 选定搭配黄芪多糖的猪瘟疫苗，选定猪瘟兔化弱毒脾淋苗与黄芪多糖进行搭配，猪 瘟兔化弱毒脾淋苗浓度为IO6TCID 5cZmL ; (2) 猪瘟防治时间的确定 ①猪龄的确定，注射黄芪多糖的具体猪龄为20日龄，注射猪瘟兔化弱毒脾淋苗的具体 猪龄为30日龄； (3) 猪瘟防治剂量的确定，对于20日龄的幼猪一次性注射浓度为lOOmg/mL的黄芪多糖 1毫升，对于30日龄的幼猪一次性注射浓度为IO6TCID5ciAiL的猪瘟兔化弱毒脾淋苗1毫升。
【专利摘要】本发明涉及一种利用黄芪多糖加猪瘟脾淋苗进行猪瘟防治的方法，包括：药物配置，黄芪多糖配制成100mg/mL的溶液，猪瘟兔化弱毒脾淋苗浓度为106TCID50/mL；(2)猪瘟防治时间的确定，注射黄芪多糖的具体猪龄为20日龄，注射猪瘟兔化弱毒脾淋苗的具体猪龄为30日龄；(3)猪瘟防治剂量的确定，对于20日龄的幼猪一次性注射浓度为100mg/mL的黄芪多糖1毫升，对于30日龄的幼猪一次性注射浓度为106TCID50/mL的猪瘟兔化弱毒脾淋苗1毫升。本发明确定了黄芪多糖和具体猪瘟疫苗搭配使用的方法，从具体用药量，具体时间上确定了最佳的猪瘟防治效果，为养猪业的稳定发展提供了保障。
【IPC分类】A61P31/14, A61K31/715, A61K39/187, A61P37/04, A61K39/39
【公开号】CN104922664
【申请号】CN201510335073
【发明人】诸葛增玉, 张伟, 任超, 艾霞, 金天明, 李留安
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月17日