一种鸡新城疫和h9亚型禽流感二联疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物兽药技术领域，具体涉及一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联疫 苗。
【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是新城疫、大肠杆菌混合感 染能够提高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。 [0003] 低致病H9亚型禽流感的发生是潜在性的，分布极为广泛，危害持久和难以控制， 给养禽业带来灭顶之灾，对人类的威胁同样严重。目前已有的禽流感（H9亚型）疫苗已在 临床广泛使用，但存在抗体水平较低和抗体整齐度方面的问题，影响到疫苗的防治效果。而 且，疫苗制造用的毒株为多年前的流行毒株，随着时间推移和环境变化，禽流感（H9亚型） 临床流行毒株已经发生抗原变异，使用原有毒株制造的疫苗免疫产生的抗体，无法针对流 行毒株提供完全的免疫保护，临床应用效果不佳。因此，H9N2禽流感的研宄工作非常重要， 迫切需要从临床上分离到免疫原性好、与现在流行毒株抗原性接近的毒株来制造疫苗，为 禽流感（H9亚型）的防治奠定基础。
[0004] 新城疫是新城疫病毒引起的禽类一种以呼吸道、消化道黏膜出血为特征的高度接 触性、急性败血性传染病。同时感染其他病原如H9亚型禽流感，可引起的内源性感染，将会 使产蛋鸡产蛋量下降，育成鸡死亡率增加，是危害我国养禽业的主要疫病之一。
[0005] 本发明从全国各地临床发生H9亚型禽流感的养殖场分离H9N2禽流感，并对其临 床流行病学和遗传变异进行分析，筛选到一株免疫原性好、与现有流行毒株同源性高的H9 亚型禽流感病毒（QDY株）。本发明应用筛选到的新型H9亚型禽流感病毒与新城疫Lasota 毒株制备二联灭活疫苗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联疫苗，从而弥补现有技 术的不足。
[0007] 本发明的二联疫苗，包含有抗原和佐剂，所述的抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒 和新城疫病毒；所述的H9亚型禽流感病毒为QDY株（Avian influenza virus)，已于2015 年4月29日保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:V201517 ；
[0008] 作为优选，新城疫病毒为Lasota株，
[0009] 所述的疫苗佐剂为白油佐剂。
[0010] 上述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含量不低于107_°EID5Q/0. 3ml，新城疫病毒的 含量不低于 l〇8_°EID5Q/0· 3ml。
[0011] 本发明将H9亚型禽流感病毒（QDY株）、新城疫病毒Lasota株，分别接种鸡胚后收 取病毒液，经甲醛溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。
[0012] 本发明的鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生 快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针 防治两种疾病，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
【具体实施方式】
[0013] 本发明筛选出效价高、免疫原性好的H9亚型禽流感毒株（QDY株），接种于10日龄 的鸡胚中进行培养，收获含病毒的尿囊液灭活；采用新城疫病毒Lasota株（中国兽医微生 物菌种保藏管理中心CVCC AV1615)接种于鸡胚培养，收获尿囊液灭活，将两种灭活抗原按 一定比例混合，加入油佐剂，制备了新型的鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗。
[0014] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0015] 实施例1、制苗用抗原毒株（H9亚型禽流感病毒QDY株）的筛选
[0016] 2013年从山东城阳地区已接种了 H9亚型禽流感病毒疫苗的发病鸡群中，无菌采 集发病鸡的心、脾等脏器和喉头、泄殖腔拭子，灭菌平皿中无菌条件下进行研碎，按1:5的 比例加入含4000单位/ml双抗的生理盐水，于-20°C反复冻融3次。棉拭子直接放入含1 万单位双抗的生理盐水中，2~8°C作用4h，脏器及棉拭子均3500rpm离心10min，取上清， 混合后接种10日龄的SPF鸡胚5枚，0. 2ml/枚。鸡胚置37°C孵育，每天早晚各照检一次， 及时取出死胚置4°C冰箱中保存，弃去24h内的死亡胚，至96h时取出全部鸡胚。逐胚收集 鸡胚尿囊液，血凝试验检测病毒效价，连续传代3次。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含 量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为 10 8_9EID5tlA). Iml，该病毒仅与H9亚型禽流感病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病 毒污染，适合作为制苗用毒株。
[0017] 将筛选QDY株保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所 的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO !M201517。
[0018] 对筛选的QDY株的基因 HA进行测序，结果HA全长为1683bp，编码560个氨基酸； NCBI的blast序列分析表明，QDY株的结构基因 HA与已公开的禽流感病毒的HA存在差异 位点，同源性为97. 5%~98. 8%;表明本发明所筛选的QDY株为一新型的H9亚型禽流感病 毒株。
[0019] 上述的结果证明筛选的QDY株符合制备疫苗的标准，用筛选的QDY株与新城疫病 毒Lasota株（中国兽医微生物菌种保藏管理中心CVCC AV1615)制备二联疫苗。
[0020] 实施例2 :鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的制备及检验
[0021] 1.制苗用抗原液的制备
[0022] I. 1禽流感（H9亚型）抗原液的制备
[0023] I. I. 1禽流感（H9亚型）病毒的繁殖将毒种（QDY株）用灭菌生理盐水作20000 倍稀释，经尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml，接种后密封针孔，置36~37°C 继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4~6小时照 胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至72小时，无论死亡与否，全部取出，照胚将已死亡的鸡胚和 仍健活的鸡胚分开，气室向上直立，置于2~8°C冷却4~24小时。
[0024] I. 1. 2收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊 液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价，红 细胞凝集价低于1:256(微量法）者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收 获的胚液灭活前在2~8°C保存。
[0025] I. 1. 3灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启 搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为〇. 1 %。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以 避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时（以罐内温度达到37°C开始 计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2~8°C保存。
[0026] 1.1. 4半成品检验
[0027] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0028] (2)病毒含量测定将收获的病毒液（灭活前取样）用灭菌生理盐水作10倍系列 稀释，取1〇_ 5、1〇_6、1〇_7、1〇_8、1〇_95个稀释度，分别尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚，每胚 0. lml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0. lml。置36~37°C继续孵育，每日照胚2次， 观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于24,判为感染并计算EID 5tl, 病毒含量应不低于IO8 5EID5tlA). lml。
[0029] (3)灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，每个尿囊腔内接种灭活