的病毒液0. 2ml， 每日照胚2次，观察5日，测定HA，同时收取胚液再盲传1代，观察5日，测定HA并记录鸡胚 病变。结果应灭活彻底，无血凝效价。
[0030] 1. 2新城疫抗原液的制备
[0031] I. 2. 1新城疫（Lasota)病毒的繁殖将生产用毒种（Lasota株）按I :10000比例 稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 2ml，接种后密封针孔，置36~37°C继续孵 育，不必翻胚。每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4~6小时照胚1次， 死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，照胚将已死亡的鸡胚和仍健活 的鸡胚分开，气室向上直立，置于2~8°C冷却4~24小时。
[0032] 1. 2. 2收获方法同上I. 1. 2项。
[0033] 1. 2. 3灭活方法同上I. 1. 3项。
[0034] 1. 2. 4半成品检验方法同上I. 1. 4项，其中灭活前新城疫病毒的含量应不低于 IO8.4EID50A). lml。
[0035] 实施例3 :
[0036] -、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中 各液体成分按体积比计）。
[0037] 1.油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后， 再加司本一 805份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0038] 2.水相制备将灭活的鸡新城疫病毒胚液、H9亚型禽流感病毒胚液以适当比例混 合，使每0.1 ml水相中含鸡新城疫病毒量不低于108_°EID5(I、H9亚型禽流感病毒含量不低 于IO 7 5EID5tl。取灭菌后的吐温-804份，加入混合抗原液96份，在水相制备罐中搅拌至吐 温-80完全溶解。
[0039] 3.乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析 出的水相应不超过0. 5ml。
[0040] 二、疫苗成品检验
[0041] 1.性状
[0042] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0043] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应 不扩散。
[0044] 稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水 相应不超过0. 5ml。
[0045] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0046] 2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0047] 3.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0048] 4.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射二联疫苗I. 0ml，同时设对 照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出 现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0049] 5.效力检验
[0050] 5· 1H9亚型禽流感部分效力检验
[0051] 5. 1.1抗体检测用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射二联疫苗，0.3ml/只， 另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组的抗体 效价应不低于2 8。对照组应均为阴性。
[0052] 5. 1. 2对地方流行毒株的攻毒保护28日龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射二联 疫苗，0. 3ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对 照组均采血测定抗体并随机分为5组，攻毒6株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射 0.1ml。结果表明，用QDY株制备的二联灭活免疫后，能抵御各地方分离毒的攻击（参见表 1)〇
[0053] 表1对地方流行毒株的攻毒保护
[0055] 5. 1. 3与目前市售的H9亚型禽流感病毒疫苗免疫效果比较使用QDY株制备的二 联灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0. 3ml/只；另1组使用目前 市售的H9亚型禽流感病毒疫苗，同样免疫剂量，于免疫后7日、14日、21日、28日、35日、 42日、60日采血检测抗体。结果，使用QDY株制备的二联疫苗的免疫组抗体水平显著高于 目前市售疫苗免疫组的抗体，抗体最高可提高22 (详见表2)。
[0056] 表2:与市售H9亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫效果的比较
[0058] 5. 14用本发明的QDY株作为病源进行攻毒实验，对象分别为免疫了目前市售的H9 亚型禽流感病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率 远低于其市售疫苗（P < 〇. 05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的H9亚型 禽流感病毒存在遗传背景上的差异。
[0059] 5. 2鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法和免疫攻毒法进行检验。用21~28 日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射二联灭活疫苗0. 3ml，另5只不免疫作对照。接 种后21~28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》附录进行HI抗体效价测 定。记录免疫组和对照组抗体效价。同时每只鸡肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）10 5_°ELD50,观察14日，记录免疫组和对照组情况。结果，使用二联灭活疫苗免 疫组均能抵抗新城疫强度的攻击，保护率为100%。
[0060] 表3:新城疫的攻毒保护结果
【主权项】
1. 一种二联疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含有抗原和佐剂，其中抗原为灭活的H9 亚型禽流感病毒和新城疫病毒。2. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的H9亚型禽流感病毒为QDY株，保 藏编号为CCTCCN0:V201517。3. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒为Lasota株。4. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为白油佐剂。5. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含 量不低于l〇7 °EID5Q/0. 3ml。6. 如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中新城疫病毒的含量不低 于KfciEID5tlA). 3ml。7. 权利要求1所述的二联疫苗的制备方法，是将H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒分别 接种鸡胚后收取病毒液，经甲醛溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联疫苗，包含有抗原和佐剂，所述的抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒；所述的H9亚型禽流感病毒为QDY株，保藏编号为CCTCC NO:V201517。本发明将H9亚型禽流感病毒QDY株、新城疫病毒Lasota株，分别接种鸡胚后收取病毒液，经甲醛溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明的鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治两种疾病，此疫苗具有高效、安全性好的优点。CCTCC NO:V20151720150429
【IPC分类】A61P31/14, A61K39/145, A61P31/16, A61K39/39, A61K39/17
【公开号】CN104922663
【申请号】CN201510393370
【发明人】刘新文, 范根成, 胡潇, 宫晓, 李陆梅, 邹敏, 王秀丽
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月7日