利用黄芪多糖加猪瘟脾淋苗进行猪瘟防治的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域中的猪瘟免疫技术领域，特别是一种利用黄芪多糖加猪 瘟脾淋苗进行猪瘟防治的方法。
【背景技术】
[0002] 猪瘟病毒（CSFV)是一种不致细胞病变的病毒，可以有效地逃避宿主的免疫系统。 CSFV对免疫细胞有很高的亲和性，感染和复制的靶细胞主要是单核细胞（monocytes)和巨 噬细胞（macrophages)，这些细胞构成了病毒入侵宿主后早期感染的靶细胞；通常引起猪 淋巴细胞大量减少，血小板减少，凝血功能障碍和胸腺、骨髓萎缩等病理特征。CSFV的细胞 感染谱已被确定：病毒在所有外周血单个核细胞亚群中都可复制，包括CD4+、CD8+和IgM+ 淋巴细胞、单核细胞和肺泡巨噬细胞，而且病毒较集中于单核细胞和肺泡巨噬细胞。
[0003] 近年来，猪瘟的流行形式从频发的大流行转变为周期性、波浪形的地区性散发性 流行。通常3~4年一个周期，疫点显著减少。病程由急性转为慢性，临床症状从典型转为 非典型、温和型猪瘟和无名高热，症状显著减轻，死亡率降低，病理变化也不明显，并出现持 续感染（亚临床感染），胎盘感染，初生仔猪先天性震颤和妊娠母猪的带毒综合症（母猪繁 殖障碍）。出现免疫耐受或无明显症状的带毒猪，这些病猪成为猪瘟发生的祸根，尤其是亚 临床感染猪，依靠常规方法很难确诊并剔除。另外在有上述迹象的地区往往同时伴随疫苗 的免疫失败。
[0004] 现有猪瘟疫苗的使用在近年来出现很多免疫失败的例子，使用不安全的疫苗甚至 会引起疾病的爆发和生产的损失。正在广泛使用的疫苗C株具有缺陷：很难区分C株与野 毒的抗体，这非常不利于猪瘟的彻底根除，C株缺乏相应的血清学标志和精确的鉴别诊断方 法。另外C株疫苗的生产方法存在技术瓶颈，需要建立一套稳定高效、安全可靠、可批量生 产、有收毒指征的病毒培养体系。由于缺乏一种具有配套鉴别诊断方法且与C株效力相当 的标记疫苗，欧盟至今拒绝接种。目前在欧洲获准上市的E2亚单位标记疫苗还无法广泛应 用，C株病毒的致弱机制也不够完善。这就有赖于对新的控制方法和疫苗的研宄。
[0005] 今年来越来越多的研宄证明APS具有免疫调控作用，并且对病毒感染具有特殊的 功效，但是APS的具体调节机制以及受体等还没有详细的研宄。
[0006] 黄苗多糖（Astragalus polysaccharide，APS)是黄苗中提取的重要有效成分， 在黄芪各组分中有决定性的作用，具有调节免疫系统功能，对机体特异性免疫与非特异 性免疫都有广泛的影响。APS能促进抗体的形成和T细胞的分化成熟，增强自然杀伤细胞 (nature killer cell，NK cell)活性，抑制血小板钻附，降低纤维蛋白原及全血比粘度；此 外，还有增强超氧化物歧化酶活性，消除自由基，减少过氧化脂质的作用。
[0007] APS还可增强疫苗对动物的保护力，并且对疫苗具有很好的保护效果。APS是黄芪 这味中药的天然活性生物成分，已经被证实可以促进白细胞增殖，对淋巴细胞转化有促进 作用，还可以增强巨噬细胞活性、诱导干扰素产生和加强机体免疫力。APS对动物体内环境 具有调节作用，对身体内分泌、基因表达等能够进行协调，值得注意的是APS是天然药物成 分，所以对动物机体毒副作用小，一直被人们普遍重视。但目前，将APS具体应用于猪瘟的 预防防治并没有找出具体的高效解决方法，还存在很多具体问题：比如APS和何种疫苗搭 配效果最好，比如APS的分阶段给量如何控制，比如APS的具体给药时间，还有APS的给药 方式等等都有待于本领域的技术人员进行不断地不断地探索。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种利用黄芪多糖加猪瘟脾淋苗进 行猪瘟防治的方法。
[0009] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
[0010] 一种利用黄芪多糖加猪瘟脾淋苗进行猪瘟防治的方法，包括：
[0011] (1)药物配置
[0012] ①黄芪多糖的配制：黄芪多糖配制成lOOmg/mL的溶液；
[0013] ②选定搭配黄芪多糖的猪瘟疫苗，选定猪瘟兔化弱毒脾淋苗与黄芪多糖进行搭 配，猪瘟兔化弱毒脾淋苗浓度为IO 6TCID5cZmL ;
[0014] (2)猪瘟防治时间的确定
[0015] ①猪龄的确定，注射黄芪多糖的具体猪龄为20日龄，注射猪瘟兔化弱毒脾淋苗的 具体猪龄为30日龄；
[0016] (3)猪瘟防治剂量的确定，对于20日龄的幼猪一次性注射浓度为100mg/mL的黄芪 多糖1毫升，对于30日龄的幼猪一次性注射浓度为IO 6TCID5ciAiL的猪瘟兔化弱毒脾淋苗1 毫升。
[0017] 本发明的优点和积极效果是：
[0018] 1、本发明确定了 APS和猪瘟兔化弱毒脾淋苗搭配用于防治猪瘟的最佳效果。
[0019] 2,本发明确定了对于防治猪瘟病毒时APS的具体分阶段给量。
[0020] 3,本发明确定了对于防治猪瘟病毒时APS的给药时间，相对于作为佐剂同时注 射，在疫苗注射前给一定剂量的APS更有利于各免疫因子的提升，能更好地防治猪瘟。
【附图说明】
[0021] 图1为Real-time PCR检测血管内皮细胞中⑶80的表达：6组细胞，每组3个重 复，同一时间点内各组比较，其中，*，P〈〇. 050 ;#，P〈0. 010 ;*#，P〈0. 001 ;
[0022] 图2是Real-time PCR检测血管内皮细胞中⑶86的表达：6组细胞，每组3个重 复，同一时间点内各组比较，其中，*，P〈〇. 050 ;#，P〈0. 010 ;*#，P〈0. 001 ;
[0023] 图3是Real-time PCR检测血管内皮细胞中E-selectin的表达：6组细胞，每组3 个重复，同一时间点内各组比较差异，其中，*，P〈〇. 050 ;#，P〈0. 010 ;*#，P〈0. 001 ;
[0024] 图4是Real-time PCR检测血管内皮细胞中P-selectin的表达：6组细胞，每组3 个重复，同一时间点内各组比较差异，其中，*，P〈〇. 050 ;#，P〈0. 010 ;*#，P〈0. 001 ;
[0025] 图5是不同剂量的黄芪多糖（APS)与猪瘟疫苗用弱毒共同作用于猪单个核细胞上 的对比图。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定 性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0027] 第一步，为了找出黄芪多糖加辅助疫苗进行猪瘟防治的方法，本发明首先要确定 在黄芪多糖的参与下，猪髋动脉血管内皮细胞各细胞因子和免疫调节分子的变化，得到各 项技术指标，确定黄芪多糖的调控作用，具体方法步骤是：
[0028] (1)体外严格无污染培养猪髋动脉血管内皮细胞并稳定传代，荧光免疫滴定疫苗 用弱毒株的病毒浓度（TCID50)，CSFV、APS或两者同时刺激细胞，使用不同浓度和时间途 径，并且收集细胞和培养液。
[0029] (2)酶联免疫吸附方法检测细胞上清液中免疫相关蛋白，主要是白细胞介素、血管 内皮粘附因子以及免疫共刺激因子的含量，从中筛选对病毒敏感蛋白以及APS反应相关蛋 白。
[0030] (3)提取细胞中mRNA进行基因芯片检测筛选出APS和CSFV相关基因，实时定量 PCR验证细胞表面的免疫共刺激因子⑶28, CTLA-4及其在抗原递呈细胞上的受体B7-1， B7-2的转录水平调控，
[0031] 如图1所示，刺激3小时后，APS组细胞的CD80mRNA表达升高（P〈0. 001)，6小时 后，⑶80 mRNA的表达在提前加 APS的病毒组（P = 0. 001)和同时加 APS的病毒组（P = 0. 009)中表达均明显升高，并且提前加 APS的病毒组中的表达比病毒组高（P = 0. 008)。
[0032] 如图2所示，刺激后3小时，各刺激组细胞中⑶86 mRNA的表达与培养液组相比 均有所降低（p〈0. 001)。提前单独加 APS组比单独APS组细胞中⑶86 mRNA的表达明显降 低（P〈0. 001)。⑶86 mRNA的表达在病毒组中的表达比加了 APS的病毒组细胞中表达显著 降低（P〈〇. 001)。刺激后6小时，单独加 APS的细胞比提前单独加 APS组细胞中⑶86 mRNA 的表达明显降低（P〈〇. 001)。提前加 APS的病毒组中⑶86 mRNA的表达比病毒组明显升高 (P〈0. 001)，但是同时加 APS的病毒组没有显著变化，结论是：提前加入APS会更好的加强疫 苗刺激⑶80的增多，⑶80/⑶86既能与⑶28结合为T细胞提供活化信号从而促进T细胞 的增殖与分化；又能与CTLA-4结合介导抑制信号，从而下调或终止T细胞效应。CD80/CD86 与T细胞上的⑶28/CTLA-4的相互作用，可促进TH细胞与APC之间的直接接触，提供了 T 细胞识别抗原后启动活化过程中必不可少的共刺激信号。
[0033] (4)实时定量PCR检测病毒相关促炎抗炎因子的调控，尤其是观察内皮细胞特 有的粘附相关因子P-selectin和E-selectin在病毒刺激以及APS刺激时的调控，并用 Western blot在蛋白水平检测，找出APS对内皮细胞粘附相关的免疫调控；
[0034] 如图3所示，病毒刺激后3小时，E-selectin出现一个高峰（P = 0. 043)，而在病 毒和APS同时刺激后3小时，也出现很大的升高（P〈0. 001)。在6小时后，以上两组都降低 恢复至对照组的水平；同时，APS组的E-selectin表达降低（P〈0. 001)，提前加 APS的病毒 组表达却升高（P〈〇. 010) ;E-Selectin是诱导性黏附分子，介导白细胞在炎症和组织损伤 区域的滚动，介导白细胞向炎症部位迀移。在炎性反应中大多数的白细胞与内皮细胞形成 接触时需要E-selectin作为起动因子。此外，E-selectin还介导内皮细胞与单核细胞、记 忆T细胞、前T细胞、成人T细胞性白血病细胞、嗜酸及嗜碱性粒细胞、血液树突状淋巴细胞 等的结合。E-selectin可锚定白细胞，继而介导其活化，从而使白细胞稳定地黏附于内皮细 胞，迀移至血管外组织。
[0035] 如图4所示，APS刺激后3小时的细胞中P-selectin表达降低（P = 0. 001)，病 毒刺激的细胞中，提前加 APS的组中P-selectin表达明显升高（P = 0. 010)，但同时加 APS 的病毒组并没有变化。6小时后，P-selectin在病毒组中的表达明显比无病毒组细胞中高 (P〈 0.010)。在含病毒的三组细胞中，提前加 APS的细胞中P-selectin的表达比只有病毒 的细胞组低（P〈〇. 001)，而同时加 APS和