小鼠抗gD)，混匀，37度孵育lh，用PBS/吐温缓冲液冲洗5次。向酶标板各实验孔中加入100 μ I稀释后的二抗(10ml PBS加3.5 μ I 二抗，二抗为抗小鼠抗体Fe)，37度孵育30min，PBS/吐温缓冲液冲洗5次。
[0106]9.3、加底物:向酶标板各实验孔中加入100 μ I底物，37°C孵育1min (计时器计时)后，加入50 μ I终止液(0.125Μ H2SO4)，酶标仪492nm处读取光密度值。
[0107]9.4、实验数据与结果分析。
[0108]步骤十:动物免疫接种实验
[0109]10.1、实验动物分组
[0110]取6周龄BALB/c小鼠20只，随机分为2组。实验组:接种壳聚糖/PRSC-gD.gC-1L-21实验疫苗；对照组:接种壳聚糖/PRSC (空质粒)。每组10只。均采用眼表粘膜局部滴眼接种相应疫苗或质粒。
[0111]10.2、动物免疫
[0112]两组每只鼠双眼结膜囊滴相应疫苗或质粒20 μ I (含100 μ g DNA)。免疫3次，每次间隔2周。
[0113]10.3、HSV-1病毒临床攻击实验
[0114]于末次加强免疫后3周，用病毒HSV-1F株攻击小鼠眼角膜。即小鼠先行腹腔注射麻醉，然后在显微镜下用Iml空针针头轻微划伤角膜，最后向结膜囊内滴加20 μ I病毒悬液，轻柔小鼠眼球。从接种病毒后第I天开始，用眼科裂隙灯显微镜对小鼠角膜病变情况进行连续观察记录15天，并根据下面的标准进行角膜病变程度进行积分:0分:上皮无病变或点状病变，基质无水肿、混浊；1分:上皮星状病变或基质轻度水肿、混浊；2分:上皮树枝状或地图样病变面积小于角膜25%，或者基质水肿、混浊病变小于二分之一角膜直径；3分:上皮树枝状或地图样病变占角膜面积25%?50%，或者基质水肿、混浊病变大于二分之一角膜直径；4分:上皮树枝状或地图样病变占角膜面积超过50%，或者基质严重水肿、混浊，虹膜不可见。
[0115]10.4、实验结果:如图1所示，在整个单纯疱瘆病毒性角膜炎病程中，实验组小鼠的角膜炎病变程度都较对照组明显减轻(*P < 0.05);代表性图片(图2)也显示了实验组鼠角膜炎明显较对照组减轻。以上结果表明该疫苗明显抵抗了 HSV-1的眼部感染及减轻了HSK的发生、发展。
[0116]上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0117]本实施例中所使用的菌株为购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。
[0118]实施例中制备的疫苗的免疫安全性评价:
[0119]在上述动物实验中显示，该疫苗未发生任何全身及眼局部的毒副反应。
[0120]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，其特征在于:由质粒pRSC-gD ^gC-1LIl构成，采用纳米壳聚糖包裹；其中，gC与gD分别为单纯疱瘆病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组，IL-21为免疫佐剂。2.如权利要求1所述的单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，其特征在于:所述质粒pRSC-gD.gC-1L-21 的浓度为 5 μ g/ μ I。3.一种制备权利要求1或2所述的单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)HSV-1gD;gC基因的获取； (2)pRSC-gC.gD-1L-21 质粒的构建； (3)制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗。4.如权利要求3所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤(I)包括: (Ia)细胞和病毒的培养； (Ib)HSV-1基因组DNA的提取； (1(^0?扩增8(:邮基因； (Id) gC，gD基因的检测与凝胶回收。5.如权利要求4所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤(Ia)包括: (Ia-1)RPMI 1640培养基的制备； (la-2)细胞培养:将绿猴肾传代细胞复苏后传代； (la-3)病毒的培养:接种HSV-1病毒悬液于Vero细胞中，培养基为胎牛血清体积含量为10%的RPMI 1640，收获感染病毒的细胞，并离心，其上清含有病毒，TCID50滴定后_70°C保存备用；细胞沉淀用于HSV-1基因组DNA的提取。6.如权利要求4所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤(Ib)包括:设计引物，PCR扩增获得gC;gD基因。7.如权利要求3所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤⑵包括: (2a)构建 pRSC-gD-1L-21 质粒； (2b)构建 pRSC-gD-Linker-1L-21 质粒； (2c)构建pRSC-gD.gC-1L-21融合表达质粒。8.如权利要求7所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述(2a)构建 pRSC-gD-1L-21 质粒、(2b)构建 pRSC-gD-Linker-1L-21 质粒的步骤包括: (2ab-l)制备LB培养基； (2ab-2)酶切、连接获得pRSC-gD-1L-21质粒并筛选鉴定； (2ab-3)将纯化的gD-Linker基因片段和pRSC-gD-1L-21分别进行酶切反应，回收纯化，鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量； (2ab-4)质粒和目的基因片段的连接:将上述的酶切产物gD-Linker和质粒pRSC-1L-21进行连接反应； (2ab-5)制备新鲜感受态细菌及转化:接种Ecoli DH5 α单菌落于LB培养基，于37°C培养，转速250rpm过夜；转种过夜培养菌液于LB培养基，37°C培养至细菌密度0D_为0.4，取菌液至离心管，于4°C，转速4000rpm下，离心lOmin，弃上清；加入75mM 0&(:12混匀，冰浴30min ;于4°C，转速4000rpm，离心lOmin，弃上清jp75mM CaCl^新混勾，此即为新鲜的感受态细菌；另取离心管，加连接反应液，再加新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30min ;于42°C水浴10s，再冰浴2min ;加LB培养基，于37°C下Ih后，取涂布于含100 μ g/ml Amp的LB平皿，37 °C培养过夜； (2ab-6)重组质粒PCR鉴定:在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定，所得产物以1.2%琼脂糖电泳检测； (2ab-7)重组质粒酶切鉴定:上述PCR产物阳性之克隆移入LK液体培养基中，于37°C恒温振荡细菌摇床中250rpm培养12小时，抽取质粒后，按设计好的反应体系进行酶切反应，分别取DNA Marker、酶切产物后，10v电压电泳30min后观察结果。9.如权利要求7所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤(2c)包括: (2c-l)酶切反应:将纯化的gC基因PCR产物片段和质粒pRSC-gD-Linker-1L-21分别进行酶切反应； (2c-2)连接反应:将上述的酶切产物gC DNA片段和质粒pRSC-gD-Linker-1L-21进行连接反应； (2c-3)制备新鲜感受态Ecoli DH5a细菌及转化； (2c-4)PCR鉴定:在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定，所得产物以1.2%琼脂糖电泳检测； (2c-5)重组质粒的酶切鉴定:上述PCR产物阳性之克隆进行酶切反应，分别取DNAMarker、酶切产物，10v电压电泳30min后观察结果； (2c-6)阳性克隆测序。10.如权利要求3所述的制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其特征在于:所述步骤⑶包括: (3a)配制5mM NaAc缓冲液，且pH5.5，并用其将壳聚糖配成0.02% (w/v)浓度的溶液； (3b)将质粒DNA溶液用5mMNa2S04S液稀释； (3c)将壳聚糖溶液和质粒溶液，分别于55°C水浴lOmin，将两种溶液等体积相混合于一个指形管中，在涡旋震荡器上震荡混匀。
【专利摘要】本发明公开了一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法，该疫苗由质粒pRSC-gD·gC-IL-21构成,采用纳米壳聚糖包裹；其中，gC与gD分别为单纯疱疹病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组，IL-21为免疫佐剂。其制备方法包括：(1)HSV-1gD；gC基因的获取；(2)pRSC-gC·gD-IL-21质粒的构建；(3)制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗。本发明提供的单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗，能够安全有效地抵抗HSV-1的感染，明显抑制了HSK的发生、发展，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61P31/22, C12N15/85, A61K39/245, C12N15/66, A61P27/02
【公开号】CN104940923
【申请号】CN201510362541
【发明人】胡凯
【申请人】东南大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月26日