一种猪瘟活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备猪瘟活疫苗的方法，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（Classical Swine Fever，CSF)俗称"烂肠瘟"，是由猪瘟病毒引起的一种急 性热性全身性败血性传染病，各种年龄猪只均可发病，病程从急性到慢性等多种多样。一年 四季流行，传染性极强，具有高度发病率和死亡率，一旦发生具有毁灭性。目前使用的猪瘟 病毒兔化弱毒（C株)是国际公认的最佳猪瘟病毒疫苗株，已被欧洲很多国家采用，它有效的 控制了猪瘟的流行。近年来，猪瘟常有免疫失败的报道，其原因虽然很多，但疫苗的质量有 很重要的影响。
[0003] 猪瘟活疫苗现在采用的仍是传统的转瓶生产工艺技术，随着生物反应器在兽用 疫苗行业逐步应用，许多企业也致力于开发生物反应器生产工艺技术，但是由于猪瘟病毒 及制苗细胞的生物学特性，还经常出现半成品效价低、批间差异大、疫苗质量不够稳定等问 题，这就限制了猪瘟活疫苗的质量与产量。因此从行业需求出发，也急需开发一种高效、快 捷、稳定的猪瘟活疫苗生产方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪瘟活疫苗的制备方法，它具有产品质量批间稳定性 高，产品副反应发生率低、工艺简单、成本低，适于规模化生产的特点。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种猪瘟活疫苗的制备方法，制备按以下步骤进行： a. 生产用细胞的制备 用EDTA-胰酶细胞分散液消化已长满良好单层的猪睾丸细胞（ST)，加入细胞生长液终 止消化，制备细胞悬液。将猪瘟病毒毒种与细胞悬液同步接入转瓶中，补入细胞生长液进行 培养，每4d收获一次毒液，收获1~3次，收获后补加细胞维持液继续培养，最后一次收获 毒液后将带毒细胞消化、冻存，作为生产用细胞，备用； 所述猪瘟病毒毒种为猪瘟兔化弱毒株脾毒或猪瘟兔化弱毒株细胞毒； b. 制苗用毒液的制备 复苏生产用细胞，接种至转瓶或生物反应器中培养。细胞长满后更换细胞维持液继续 培养，每2d或4d收获换液一次，共10~15次，收获的毒液为制苗用毒液； c. 疫苗制备 向制苗用毒液中加入冻干保护剂，分装、冻干，即得猪瘟活疫苗。
[0006] 上述制备方法，所述步骤a中，在接入猪瘟病毒的同时加入聚乙二醇（PEG)，所述 聚乙二醇选用PEG4000和PEG6000, PEG的使用浓度为2% (m:V)。
[0007] 上述制备方法，所述步骤a中，细胞冻存时二甲基亚砜（DMS0)的使用浓度为10~ 15% (V:V)〇
[0008] 上述制备方法，所述步骤b中，在收获制苗用毒液过程中，当第8~10次收获换液 时，补入生产用细胞，补入量为接种量的1/5。
[0009] 上述制备方法，在步骤a和步骤b中，细胞生长液为含4% (V:V)新生牛血清的低 血清培养基，细胞维持液为含1% (V:V)新生牛血清的低血清培养基。
[0010] 上述制备方法，在步骤a和步骤b中，所述低血清培养基为低血清DMEM培养基 (DMEM/F12 )或低血清 MEM 培养基（MD611、OPT I -MEM )。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 1、本发明采用同步接毒的方法接种猪瘟病毒，且利用PEG促进胞膜融合，加快了猪瘟 病毒感染制苗用细胞的速度，提高了病毒感染率，进一步提升病毒产量。
[0012] 2、本发明将带毒细胞直接用于生产，省略了接种病毒步骤，简化了操作，有利于提 高产品质量批间稳定性，降低生产成本，更适合规模化生产。
[0013] 3、本发明在毒液收获过程中补加生产用细胞，增加了高效价毒液收获次数，提高 了单批次制苗用毒液产量。
[0014] 4、本发明使用低血清培养基，降低生产成本，减少产品副反应发生率。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本 发明而并非限定本发明的专利保护范围。
[0016] 猪睾丸细胞（ST)购自中国兽医药品监察所；猪瘟病毒疫苗株为猪瘟病毒兔化弱 毒株（C株)，购自中国兽医药品监察所；猪瘟兔化弱毒株脾毒由本公司自行繁殖并保存。
[0017] 实施例1 本实施例采用转瓶制备猪瘟活疫苗 细胞生长液的配方为：体积百分含量96%的MD611液，4%新生牛血清，调整pH值为 7. 2； 细胞维持液的配方为：体积百分含量99%的MD611液，1%新生牛血清，调整pH值为 7.4； 1、生产用细胞的制备 A.从液氮罐中取出冻存的猪睾丸细胞（ST细胞)复苏后，转至10L转瓶中培养，长满良 好单层后用EDTA-胰酶分散液消化，加入细胞生长液终止消化后，按1 :2~3分散制备成细 胞悬液(含细胞及细胞生长液)。
[0018] B.按照3. 0g/转瓶的接毒量，称取猪瘟兔化弱毒株脾毒，去除脂肪组织后研磨， MD611液冲洗，过滤、离心取上清，制备成脾毒悬液。
[0019] C.分别量取细胞悬液、猪瘟兔化弱毒株脾毒悬液、100ml PEG6000(质量浓度20%) 接入转瓶中，补加细胞生长液至l〇〇〇ml，置于37°C温室培养。每4d收获一次，收获毒液后 补加1000ml细胞维持液。
[0020] D.第3次收获完成后，将收获的病毒液冻存，作为猪瘟兔化弱毒株细胞毒；消化 带毒细胞并冻存，作为生产用细胞(标记为SC3)，使用的冻存液二甲基亚砜（DMS0)使用浓 度为 15% (V:V)。
[0021] 2、制苗用毒液的制备 A、从液氮罐中取出冻存的生产用细胞（SC3)复苏并转至10L转瓶中培养，细胞长满良 好单层后将培养液更换为细胞维持液继续培养。收获制苗用毒液，每4d收获换液一次，在 第10次收获换液时，补入生产用细胞（SC3)，补入量为接种量的1/5,继续培养，收获至第15 次。收获的病毒液作为制苗用毒液，-20°C保存备用。
[0022] B.制苗用毒液效力检验 用标准的兔体定型热反应法测定制苗用毒液效价，15批次收获病毒液效价均 彡 0? 4X106RID/ml。（如表