一种单纯疱疹病毒性角膜炎疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，本发明涉及一种单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]单纯疱瘆病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是一种严重的世界性致盲性眼病，主要由单纯疱瘆病毒I型(HSV-1)感染引起，它病情迀延、易复发，终身不愈。HSK发病机制主要分为原发感染，潜伏及复发感染:原发感染为HSV-1直接感染角膜上皮细胞引起点状或树枝状角膜炎；原发感染后，HSV-1病毒能顺着神经轴突逆流至局部三叉神经节(TG)，形成潜伏。有报道称病毒可于感染后24小时内到达TG;在机体免疫力低下时，潜伏感染的HSV-1可重新活化，引起复发性感染，多表现为基质性角膜炎(stromalkeratitis, SK)，其病情较原发性HSK严重，常由于反复发作而导致失明。HSK在发达国家的发病率为每年5.9/105?20.7/105，患病率为149/105。据调查，在我国角膜盲是仅次于白内障盲而居第二位，而HSK盲为角膜盲首位，约占42.85%，其3年的复发率可达到33.5%。近年来，由于抗生素和皮质类固醇的广泛应用，HSK发病率有逐渐增高趋势。
[0003]HSK目前治疗方案主要为:眼局部结合全身口服应用抗病毒药物，对于基质性角膜炎，应用皮质类固醇激素；对于潜伏期患者给予预防用药:长期口服抗病毒药物，甚至终身服用。以上治疗可以一定程度地减轻HSK的症状以及控制HSV-1感染的复发，但不能避免HSK的发病，更无法有效清除处于潜伏期的病毒，也就不能达到根治。用药期间病毒易脱落仍可造成传播，且药物的长期使用，对患者不论从经济上还是心理上都是一个很大的负担；另一方面，由于抗病毒药物的长期使用，使病毒耐药株不断出现，疗效继而受到影响，而且将产生一定程度的副反应。针对病毒的特异性主动免疫是控制HSV-1感染的最有效途径，有初步研宄表明，在动物中能一定程度预防病毒原发感染及控制复发感染，表明研制和接种安全有效的抗HSK的疫苗，具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0004]针对上述【背景技术】中存在的问题，本发明的目的是提供一种单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，以安全有效的防治单纯疱瘆病毒性角膜炎。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，由质粒pRSC-gD.gC-1L-21构成，采用纳米壳聚糖包裹；其中，gC与gD分别为单纯疱瘆病毒I型的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组，IL-21为免疫佐剂。
[0007]所述质粒pRSC-gD.gC-1L-21 的浓度为 5 μ g/ μ I。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种制备上述单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，其技术方案如下:
[0009]一种制备单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗的方法，包括如下步骤:
[0010](I)HSV-1gD ;gC 基因的获取；
[0011](2)pRSC-gC.gD-1L-21 质粒的构建；
[0012](3)制备壳聚糖/质粒DNA纳米疫苗。
[0013]进一步的，所述步骤(I)包括:
[0014](Ia)细胞和病毒的培养；
[0015](Ib)HSV-1 基因组 DNA 的提取；
[0016](1(^0?扩增8(:邮基因；
[0017](ld)gC，gD基因的检测与凝胶回收。
[0018]进一步的，所述步骤(Ia)包括:
[0019](Ia-1)RPMI 1640 培养基的制备；
[0020](la-2)细胞培养:将绿猴肾传代(Vero)细胞复苏后传代；
[0021](la-3)病毒的培养:接种HSV-1病毒悬液于Ve1细胞中，培养基为胎牛血清(FCS)体积含量为10%的RPMI 1640，收获感染病毒的细胞，并离心，其上清含有病毒，TCID50滴定后_70°C保存备用；细胞沉淀用于HSV-1基因组DNA的提取。
[0022]进一步的，所述步骤(Ib)包括:设计引物，PCR扩增获得gC ;gD基因。
[0023]进一步的，所述步骤(2)包括:
[0024](2a)构建 pRSC-gD-1L-21 质粒；
[0025](2b)构建 pRSC-gD-Linker-1L-21 质粒；
[0026](2c)构建 pRSC-gD.gC-1L-21 融合表达质粒。
[0027]进一步的，所述(2a)构建pRSC-gD-1L-21 质粒、(2b)构建 pRSC-gD-Linker-1L-21质粒的步骤包括:
[0028](2ab-l)制备 LB 培养基；
[0029](2ab-2)酶切、连接获得pRSC-gD-1L-21质粒并筛选鉴定；
[0030](2ab-3)将纯化的gD_Linker基因片段和pRSC-gD-1L-21分别进行酶切反应，回收纯化，鉴定后，以紫外分光光度计定量两种双酶切产物的量；
[0031 ] (2ab-4)质粒和目的基因片段的连接:将上述的酶切产物gD_Linker和质粒pRSC-1L-21进行连接反应；
[0032](2ab-5)制备新鲜感受态细菌及转化:接种Ecoli DH5 α单菌落于LB培养基，于37°C培养，转速250rpm过夜；转种过夜培养菌液于LB培养基，37°C培养至细菌密度OD6c?为
0.4，取菌液至离心管，于4°C，转速4000rpm下，离心lOmin，弃上清；加入75mM CaCl2混勾，冰浴30min ;于4°C，转速4000rpm，离心lOmin，弃上清；加75mM CaCl；^新混勾，此即为新鲜的感受态细菌；另取离心管，加连接反应液，再加新鲜感受态细菌，混匀，冰浴30min ;于42°C水浴100s，再冰浴2min ;加LB培养基，于37°C下Ih后，取涂布于含100 μ g/ml Amp的LB平皿，37 °C培养过夜；
[0033](2ab-6)重组质粒PCR鉴定:在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定，所得产物以1.2%琼脂糖电泳检测；
[0034](2ab-7)重组质粒酶切鉴定:上述PCR产物阳性之克隆移入LK液体培养基中，于37°C恒温振荡细菌摇床中250rpm培养12小时，抽取质粒后，按设计好的反应体系进行酶切反应，分别取DNA Marker、酶切产物后，10v电压电泳30min后观察结果。
[0035]进一步的，所述步骤(2c)包括:
[0036](2c-l)酶切反应:将纯化的gC基因PCR产物片段和质粒pRSC-gD-Linker-1L-21分别进行酶切反应；
[0037](2c-2)连接反应:将上述的酶切产物gC DNA片段和质粒pRSC-gD-Linker-1L-21进行连接反应；
[0038](2c-3)制备新鲜感受态Ecoli DH5 α细菌及转化；
[0039](2c-4)PCR鉴定:在培养的转化菌平板上随机挑取8个大小均匀一致的克隆进行PCR鉴定，所得产物以1.2%琼脂糖电泳检测；
[0040](2c-5)重组质粒的酶切鉴定:上述PCR产物阳性之克隆进行酶切反应，分别取DNAMarker、酶切产物，10v电压电泳30min后观察结果；
[0041](2c-6)阳性克隆测序。
[0042]进一步的，所述步骤(3)包括:
[0043](3a)配制5mM NaAc缓冲液，且ρΗ5.5，并用其将壳聚糖配成0.02% (w/v)浓度的溶液；
[0044](3b)将质粒DNA溶液用5mMNa2S04溶液稀释；
[0045](3c)将壳聚糖溶液和质粒溶液，分别于55°C水浴lOmin，将两种溶液等体积相混合于一个指形管中，在涡旋震荡器上震荡混匀。
[0046]本发明的有益效果是:本发明提供的单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，能够安全有效地抵抗HSV-1的感染，明显抑制了 HSK的发生、发展。下一步将逐步过渡到临床试验，并进一步进行产品开发、生产及应用。正如前所述，单纯疱瘆病毒性角膜炎发病率较高，危害性也较大，所以防疫的需求较大，预示着该疫苗的成功研制将有较光明的应用前景，产生较大的社会效益。
[0047]本发明选用有机纳米颗粒壳聚糖，它是由甲壳素脱乙酰基作用形成的一种阳离子多糖，带有很多带正电的氨基基团，它可以包裹质粒DNA，对组合的DNA形成保护作用，以免各种核酸酶的降解，且具有溶液可塑性及良好的粘膜粘附作用，可以有效的减少滴眼时反射性瞬目所致的药物流失。
【附图说明】
[0048]图1是实施例中实验组和对照组的小鼠的角膜炎病变程度曲线；
[0049]图2是实施例中实验组和对照组的小鼠的角膜炎病变对照图片。
【具体实施方式】
[0050]下面结合【具体实施方式】对本发明作更进一步的说明。
[0051]本发明提供的单纯疱瘆病毒性角膜炎疫苗，由质粒pRSC-gD.gC-1L-21构成，