.1%胰蛋白酶液(和光纯药株式会社)inHBSS-/-中，在4°C下静置6小时。
[0097]接着，加入10% FBS(sigma)及含P/S液的DMEM(Low Glucose)(和光纯药株式会社)，使胰蛋白酶的反应停止。
[0098]在从容器中极力除去液体之后，在容器中加入含有Type2胶原酶(sigma)的HBSS-/-(不含Mg、Ca)(最终浓度0.8mg/ml)，在37度的恒温槽中反应5分钟后，废弃上清液。
[0099]在容器中再次加入胶原酶，在37度下反应15-20分钟。通过细胞过滤网回收上清液，以5分钟1000转进行离心。将得到的颗粒用10% DMEM进行再悬浮，接种于1mm的TypeI骨胶原涂敷培养皿(IWAKI)。60分钟后，从培养皿中仅回收上清液。
[0100]其结果，以85.6%?94.7%的生存率得到90%左右进行了纯化的心肌细胞。
[0101](1-2)血管内皮细胞(EC)的制备
[0102]作为血管内皮细胞，由Cosmo B1株式会社购入人类主动脉平滑肌细胞(HumanCardiac Microvascular Endothelial Cells) (HCMEC)(出售处为 Sciencell)。
[0103](http://www.primarycell, com/pdf/6000.pdf)
[0104]将该细胞在专用的ECM(Endothelial Cell Medium)中进行培养(使用传代数为第5-9代(P5-9)的血管内皮细胞)。
[0105]在得到目标细胞数之前，在1cm培养皿(I型胶原蛋白培养皿(Type I CollagenCoated Dish) =IffAKI)中进行培养。传代使用0.05%胰蛋白酶。
[0106](1-3)血管平滑肌细胞(SMC)的制备
[0107]作为血管平滑肌细胞，由Cosmo B1株式会社购入人类主动脉平滑肌细胞(HumanAortic Smooth Muscle Cells) (HASMC)(出售处为 Sciencell)。
[0108](http://www.primarycell, com/pdf/6110.pdf)
[0109]将该细胞在10% FBS (sigma)及含P/S液的DMEM(LowGlucose)(和光纯药株式会社)中进行培养(使用P5-10的细胞。)。传代使用0.05%胰蛋白酶。
[0110]就培养容器而言，使用1cm培养皿、15cm培养皿(NUNC、Corning株式会社制造等)或5层的BDFalcon多层细胞培养中进行培养。
[0111](http://www.bdj.c0.jp/falcon/products/falcon-mult1-flask.html)
[0112](1-4)成纤维细胞(FB)的制备
[0113]作为成纤维细胞，由takara-b1购入正常人皮肤成纤维细胞(成人)(NHDF-Ad)(出售处 CMff(LONZA))。
[0114](http://catalog.takara_b1.c0.jp/product/basic_inf0.asp ? unitid =U100002705)
[0115]将该细胞在10% FBS (sigma)及含P/S液的DMEM(LowGlucose)(和光纯药株式会社)中进行培养，使用P5-10的细胞(传代使用0.05%胰蛋白酶)。培养容器使用1cm培养皿、15cm培养皿(NUNC、Corning社制等)、或5层的BDFalcon多层细胞培养。
[0116](http://www.bdj.c0.jp/falcon/products/falcon-mult1-flask.html)
[0117](2)培养需要量的上述细胞，进行胰蛋白酶处理，使用指定的培养液制备细胞悬浮液。此时，将2种或3种细胞以一定的配比进行混合而制备悬浮液。
[0118]就心肌细胞而言，用作为上述的心肌纯化法的pr印Iating法(所述(1-1)项)回收细胞之后，接种于板上而形成球体。
[0119]板主要使用住友Bakelite株式会社制96孔板(prime surface)，在该板上以一定的细胞数接种时，用12-48小时形成球体。
[0120](http://www.sumibe.c0.jp/product/s-b1/cell-culture/primesurface-96u/spec/in dex.html)
[0121]将接种的细胞数和所形成的球体的大小的关系示于图1、图2。
[0122]图1是表示仅使心肌细胞凝集而形成了球体的单位球体的细胞数和直径的图(纵轴的单位:μπι)。
[0123]图2是表示使用血管平滑肌、血管内皮细胞及成纤维细胞所制备的球体的直径和构成球体的细胞数之间的关系的图。例如，在SMC的“40000球体”中，是指:使SMC凝集40000个时，形成直径为1200 ( μ m)的球体。
[0124]需要说明的是，作为心肌单独球体的形成方法，优选在形成球体时添加10%左右的FBS (胎牛血清)。
[0125]构建球体后经过24至48小时时，使细胞进行搏动。将研究了心肌球体的搏动率和培养液之间的关系而得到的结果示于图3及图4。
[0126](3)细胞的各种检查
[0127](3-1)细胞荧光示踪剂
[0128]为了进行球体形成过程及形成后的分析，将细胞用细胞示踪剂(Cell Tracker)染色。
[0129]心肌细胞使用Cell Tracker Green (takara-b1, (http://catalog, takara-b1.c0.jp/product/basic_inf0.asp ? unitid = U100004642))。
[0130]以DMEM(无FBS)中如使用说明书中记载的浓度溶解细胞，用作为心肌纯化法的preplating法在37°C、5% CO2环境下培养60分钟时进行染色。
[0131]血管内皮细胞在达到80%细胞汇合的状态下用PBS清洗后，在DMEM(无FBS)中溶解Cell Tracker Red(takara-b1)，在37°C、5% CO2环境下培养2小时并进行染色而使用。
[0132]成纤维细胞使用Cell Tracker Blue (Invitorgen)同样地进行染色。
[0133](http://www.1nvitrogen.jp/catalogue/molecular_probes/cell_b1_new/contentO 8/index, html)
[0134](3-2)显微镜观察
[0135]细胞或立体结构体的荧光及位相差像使用BZ9000 (KEYENCE)拍摄静止画、动画。
[0136](3-3)动画分析
[0137]使用VW-9000 (KEYENCE)，进行搏动的心肌球体及结构体的功能分析。具体而言，分析球体内的4点(O时3时6时9时的点)的运动，求出平均速度。
[0138](3-4)组织学的评价
[0139]将血管结构体进行10%福尔马林固定，进行HE染色、MT、EVG染色。心肌结构体进行了 HE染色。
[0140](4)结果
[0141](4-1)球体的形成
[0142]将心肌细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞以图5所示的比例进行混合，形成心脏组织型球体。在形成后2小时、12小时、24小时、48小时观察形态，观察形成球形的球体的过程(图5)。在球体形成时，将成纤维细胞、血管内皮细胞进行混合时，球体形成效率提高。
[0143]与心肌细胞单独融合相比，混合有FB及EC时的球体进行了融合，其形成效率最好，可以形成3维的且功能性的血管网(图5)。
[0144]在图5中，各面板所示的球体的细胞组成如下所述。
[0145]⑴最左侧的面板:心肌细胞100%单一细胞球体
[0146](ii)从左边起第2号的面板:心肌细胞80%、成纤维细胞10%、血管内皮细胞10%的3种混合球体
[0147](iii)从左边起第3号的面板:心肌细胞80%、成纤维细胞0%、血管内皮细胞20%的2种混合球体
[0148](i ν)最右侧的面板:心肌细胞80 %、成纤维细胞20 %、血管内皮细胞O %的2种混合球体
[0149]在图5中，纵向的4个面板为:接种细胞而形成球体，使得总细胞数为1200个/球体，分别在2小时、12小时、24小时、48小时后观察到的结果。与心肌细胞单独组相比，由细胞的混合物得到的球体，明显地显示高的凝集效率。
[0150](4-2)利用球体的荧光色素染色的形态观察
[0151]将心肌细胞用绿色的荧光色素染色，将成纤维细胞用蓝色的荧光色素染色，将血管内皮细胞用红色的荧光色素染色，使其混合而形成球体，使得心肌:纤维芽:内皮的比成为2000:800:200，在48小时后观察形态。
[0152]其结果，可以制备出设想了血管壁的高功能血管球体(图6)。另外显示:通过对心肌细胞与血管内皮细胞及成纤维细胞进行共培养，球体形成效率上升。
[0153]在图6中，血管内皮细胞3维地形成血管网，同时，内皮细胞排列成管腔状(图6左下面板)。S卩，显示:将心肌细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞以适当的配合比例进行混合时，可以制备具有3维的血管网的球体。
[0154]血管内皮细胞的混合率优选为10-50%左右，增加为其以上比例，死细胞也增加，最