llbio)使用说明操作，测定蛋白浓度。
[0045] ①根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
[0046] ②完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什 么溶液稀释。
[0047] ③将标准品按0, 1，2, 3, 4, 5, 6ill加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品 的溶液补足到20iU。
[0048] ④加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20yl。
[0049] ⑤各孔加入200illBCA工作液，37°C放置30min。
[0050] ⑥测定A562,540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
[0051] 3. 4. 3 蛋白免疫印迹（westernblot)
[0052] 3. 4. 3. 1 电泳
[0053] ①配10%-12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后，用异丙醇封胶。
[0054] ②当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒 去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。
[0055] ③配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然 后将梳子插入浓缩胶中。
[0056] ④电泳样品准备，使每个样品总蛋白上50ug-IOOug计算各个样品所需取样量， 并与5*loadingbuffer混匀，沸水煮5min，放入冰盒中速冷。
[0057] ⑤上样，开始电泳。浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V。待溴酚蓝电 泳至胶底部时终止电泳。
[0058] 3. 4. 3. 2 转膜
[0059] ①准备6张与胶同样大小的滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与 滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。
[0060] ②按照3张滤纸，膜，胶，另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。
[0061] ③盖上仪器，接通电源，转膜约2h。
[0062] ④转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T中洗1次，时间5min。
[0063] ⑤用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。用TBS-T将丽春红洗净。
[0064] 3. 4. 3. 3 封闭
[0065] 用TBST配制5 %脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1小时。
[0066] 3. 4. 3. 4 -抗孵育
[0067] 用封闭液将一抗按照一定比例稀释，将膜与一抗一起孵育，4度过夜。孵育结束， TBS-T洗 3 次，每次 15min。
[0068] 3. 4. 3. 5 二抗孵育
[0069] 用封闭液稀释HRP标记的二抗（Proteintech)，稀释比例1 :3000,将稀释后的二抗 与膜共同孵育45-60min。孵育结束，TBS-T洗3次，每次15min。
[0070] 3. 4. 3. 6 显色 / 曝光
[0071]ECL显色曝光：使用ECL化学发光液（Thermo)与膜孵育3min，用吸水纸吸尽液体， 用保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟；显影冲洗。
[0072] 3. 4. 4数据分析
[0073] 将曝光后的底片扫描。
[0074] 4、统计学处理
[0075] 所有数据应用SPSS17. 0统计软件进行数据处理分析。对实验前后及组间进行t 检验。结果以均数土标准差（i±s)表示。本实验选取a= 0. 05为检验水准，P〈0. 05为 有统计学意义。
[0076] 实验结果
[0077] 1、体重增长的观察
[0078] 实验结束后共死亡小鼠4只，其中糖尿病模型对照组及黄精多糖治疗组各死亡2 只，最后18只小鼠、每组6只进入结果分析。实验期间对3组小鼠一般情况进行仔细观察， 结果显示：与对照组相比，模型鼠在末次注射STZ后4d起，开始出现多尿、多饮、多食，伴有 精神萎靡，毛发暗淡、凌乱、易脱等现象。应用黄精多糖治疗约4W后上述情况明显改善。
[0079] 于造模前、造模后0W、2W、4W、6W对小鼠的体重进行监测，如表3所示。结果显示正 常对照组小鼠的体重呈生理性增长，模型对照组小鼠平均体重显著下降，且明显低于正常 对照组（P〈〇. 05)，在造模后第4周左右模型对照组小鼠平均体重开始有所增长。应用黄精 多糖治疗2W对糖尿病小鼠体重无显著影响，治疗4W后与模型组比较，可见黄精多糖治疗组 体重显著增加（P〈0. 05)。
[0080] 表3黄精多糖对糖尿病小鼠体重的影响（g，5±Ssn= 6)
[0081]
[0082] 注：a)与正常对照组比较：P〈0. 05 ;b)与糖尿病模型组比较：P〈0.05
[0083] 2、黄精多糖对糖尿病小鼠血糖的影响
[0084] 于造模前、造模后0W、2W、4W、6W对小鼠的血糖进行监测，如表4所示。与正常对照 组比较，模型组血糖显著升高。应用黄精多糖治疗2W，黄精多糖治疗组与模型对照组血糖水 平无显著性差异（P>〇. 05);应用黄精多糖治疗4W后，与模型对照组比较，黄精多糖治疗组 血糖显著下降（P〈〇. 05)。
[0085] 表4黄精多糖对糖尿病小鼠血糖的影响（mmol/1，士&n=6)
[0086]
[0087] 注：a)与正常对照组比较：P〈0. 05 ;b)与糖尿病模型组比较：P〈0.05
[0088] 3、黄精多糖对糖化血红蛋白水平的影响
[0089] 采用柱层析法检测血清糖化血红蛋白水平。Hb的单位为百分比（％)，即GHb占 全部血红蛋白的百分比，结果如表5显示。与正常对照组比较，模型组糖化血红蛋白明显增 高。黄精多糖治疗组血清糖化血红蛋白较模型组显著降低，提示黄精多糖组小鼠长期血糖 水平控制较模型组理想。
[0090] 表5黄精多糖对糖尿病小鼠糖化血红蛋白的影响$ 土s,n= 6)
[0091]
[0092] 注：a)与正常对照组比较：P〈0. 05 ;b)与糖尿病模型组比较：P〈0.05
[0093] 4、黄精多糖对海马组织上P-gP表达的影响
[0094] 结合附图1、图2,以及表6，WesternBlot结果显示，与正常对照组相比较，模型组 大鼠脑组织内P-gP含量增高（P〈〇.〇5);与模型对照组比较，黄精多糖组P-gP含量显著增 高（P〈0. 05)，表6如下：
[0095] 表6Western-blot检测P_gP的表达（P_gP/P-actin,Y.1.. ,n=6)
[0096]
[0097] 注：a)与正常对照组比较：P〈0. 05 ;b)与糖尿病模型组比较：P〈0. 05
[0098] 通过上述实验分析可知，黄精多糖不仅可以降低实验性糖尿病鼠血糖及血红蛋白 水平，表明黄精多糖具有调节糖代谢和治疗实验性糖尿病的作用；并且可显著提高糖尿病 小鼠BBB上P-gP表达水平，即表明黄精多糖对糖尿病并发神经系统疾病具有干预作用，能 用于治疗糖尿病并发神经系统疾病。其中，糖尿病并发神经系统疾病可以是糖尿病脑病、脑 卒中、帕金森病中的一种。
[0099] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的保护范 围内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 黄精多糖在治疗糖尿病并发神经系统疾病中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病并发神经系统疾病包括糖尿 病脑病、脑卒中、帕金森病中的至少一种。3. -种治疗糖尿病并发神经系统疾病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为黄 精多糖。4. 一种P-糖蛋白促进剂，其特征在于，所述P-糖蛋白促进剂的活性成分为黄精多糖。
【专利摘要】本发明公开了黄精多糖在治疗糖尿病并发神经系统疾病中的应用，以及黄精多糖作为治疗糖尿病并发神经系统疾病的药物的活性成分，黄精多糖作为P-糖蛋白促进剂的活性成分的技术方案。通过本发明的研究，得到黄精多糖能显著提高糖尿病状态下BBB上P-糖蛋白的表达水平，从而得到黄精多糖能应用于治疗糖尿病并发神经系统疾病治疗的结论。
【IPC分类】A61P25/16, A61P3/10, A61P9/10, A61K31/715, A61P25/00
【公开号】CN105079022
【申请号】CN201410190241
【发明人】李友元, 万奇
【申请人】长沙梅珍生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月7日