液固比对总黄酮得率、Fe3+还原能力和· OH清除率的影响
[0061] 准确称取加拿大一枝黄花花粉6份，每份5. 000g，在40°C超声30min，超声功率为 100W，按液固比（mL · g 3 为 10:1、20:1、30:1、40:1、50 :1、60:1，分别加入体积分数为40% 的丙酮水溶液提取2h，考察液固比对总黄酮得率、Fe3+还原能力和· OH清除率的影响，结果 见图5和6。
[0062] 如图5和6所不，液固比（mL · g 3为10:1~40:1时随着液固比的增大，总黄酮 得率呈增加的趋势，液固比（mL ^g1)为50:1时，黄酮得率骤降。随液固比的增加对铁的还 原能力降低，对羟基的清除率先降后升，当液固比（mL ^g1)大于30:1时，· OH清除率开始 增大。综合这三方面考虑液固比（mL ^g1)为20:1时，黄酮得率、对铁的还原能力和对羟基 的清除率都较好，因此，本发明中优选液固比（mL · g 4为20:1进行提取。
[0063] 实施例4
[0064] 超声时间对总黄酮得率、Fe3+还原能力和· OH清除率的影响
[0065] 准确称取加拿大一枝黄花花粉6份，每份5. 000g，在40°C超声功率为100W，液固比 (mL .g 3 为 20:1，超声波时间分别为 10min、20min、30min、40min、50min 和 60min 加入体积 分数为40%的丙酮水溶液提取2h，考察超声时间对总黄酮得率、Fe3+还原能力和· OH清除 率的影响，结果见图7和8。
[0066] 如图7和8所示，随超声时间的增加黄酮得率增大，而对Fe3+的还原能力是V字型 的，30min时最低，对羟基的清除率是呈Z字型的，在40min时· OH清除率达到最大。超声 60min时，总黄酮得率最高，对Fe3+的还原能力和·0Η清除率处在第二位，因此，本发明优选 的超声时间为60min。
[0067] 实施例5
[0068] 提取次数对总黄酮得率的影响
[0069] 准确称取加拿大一枝黄花花粉5. 000g，在40°C超声功率为100W，超声时间为 6〇!1^11，液固比（1111^81)为20:1，用体积分数为40%的丙酮水溶液提取211，离心分离后得 上清液，分别测定每次提取液的黄酮浓度，考察提取次数对总黄酮得率的影响，结果见图9。
[0070] 由图9可知，随着提取次数的增加，总黄酮的提取率显著降低，第二次总黄酮的提 取率是第一次的30. 6%、第三次是第一次的10. 3%、第四次是第一次的3. 19%、第五次是 第一次的2. 87%，故提取次数选3次为宜。提取次数不影响中心组合实验的结果，考虑到效 率中心组合实验的提取次数为一次。
[0071] 实施例6
[0072] 超声温度对总酚得率的影响
[0073] 称取1.0 OOOg加拿大一枝黄花花粉，按液固比20:1加入体积分数为40%的丙酮 水溶液，超声功率为100W、超声时间40min，由于丙酮的沸点为56. 48°C，故选30°C、40°C和 50°C三个温度点来考察超声波温度对黄酮得率的影响，结果见表1。
[0074] 表1超声波温度对黄酮类得率的影响
[0076] 由表1可知，超声温度在40°C时黄酮得率最高，因此，本发明优选此温度为提取温 度。由于丙酮的沸点比较低，故后面的中心组合实验不把超声温度作为自变量来考虑。
[0077] 实施例7
[0078] 响应面法优化加拿大一枝黄花抗氧化成分的提取工艺
[0079] 根据单因素试验的结果，在40°C超声功率为100W时提取1次，对丙酮体积分数 (A)、超声时间（B)和液固比（C) 3个单因素实验所确定的水平范围，采用Design-Expert 8. 0. 6软件中的Box-Behnken Design实验设计方法设计了 3因素3水平实验，见表2。以 A、B、C为自变量，以加拿大一枝黄花总黄酮提取率、· OH清除率和对Fe3+的还原能力为响 应值（Y1、1和Y 3)，进行响应面分析试验，试验方案及结果见表3。
[0080] 表2 Box-Behnken试验因素与水平编码
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[0084] 根据表3进行试验，对试验数据进行多元回归拟合，得加拿大一枝黄花黄酮的提 取率（Y1)^OH清除率（Y2)和铁还原能力（Y3)对丙酮浓度（A)、超声时间⑶）、液固比（C) 的二次多项回归模型方程为：
[0085] Y1= 2. 845+0. 01452A+0. 1913B-0. 002196C+0. 2873AB+0. 06714AC+0. 3846BC+0. 07 788A2-0. 4391B2+0. 1573C2；
[0086] Y2= 31. 05+1. 160A+1. 309B+2. 684C
[0087] Y3= 0. 806+0. 05475A+0. 0235B+0. 09C-0. 00525AB-0. 08375AC-0. 00075BC+0. 0133 75A2-0. 06562B2-0. 05962C2。
[0088] 为了检验方程的有效性，对超声波提取一枝黄花总黄酮的数学模型进行方差分 析，并对各因子的偏回归系数进行检验，结果见表4,交互项BC的偏回归系数显著，说明超 声时间和液固比的交互项对总黄酮的得率有显著影响；二次项中B2的偏回归系数达到极显 著水平，说明超声时间与黄酮提取率之间不是简单的线性关系。由表5可知，一次项中C的 回归系数极显著，说明液固比对· OH的清除率的影响显著。表6得知，一次项中A、C的回 归系数极显著，说明丙酮浓度和液固比对铁还原能力有极显著影响；B的回归系数显著，说 明超声时间对铁还原能力有显著影响。交互项AC的偏回归系数极显著，说明丙酮浓度和液 固比的交互项对铁还原能力有极显著影响；二次项中B2、C2的偏回归系数达到极显著水平， 说明超声时间、液固比与铁还原能力之间不是简单的线性关系。回归方差分析显著性检验 结果表明，该模型回归显著，且失拟项不显著，说明该方程对试验拟合较好。
[0089] 表4黄酮提取率实验结果方差分析表
[0092] 表5 · OH清除率试验结果方差分析表
[0093]
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[0097] [注]* :差异显著（Ρ〈0· 05) ; * * :差异极显著（Ρ〈0· 01)。
[0098] 根据回归方程，做出响应面，结果见图10~16。图10~16直观地给出了各因子 交互作用的响应曲面3D与等高线分析图，等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形 表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反，同时有闭合的椭圆或圆表示有最大值。
[0099] 为检验响应曲面法的可靠性，采用上述优化条件进行试验，考虑到实际操作 的便利，将提取工艺参数修正为：丙酮体积分数为50%，超声波时间69min，液固比 (mL · g )30:1。以此工艺参数做3次平行试验，总黄酮得率分别为2. 992%、2. 981 %和 3. 033%，平均得率为3. 002%，实验观测值与理论预测值相对误差为0. 4103% ;· OH清除 率分别为32. 68 %、33. 04 %和32. 81 %，平均清除率为32. 85 %，与理论预测值33. 09 %相 比，相对误差为-〇. 7253%。回归分析和验证实验表明了该响应面法的合理性和可行性。 [0100] 以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有 等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
【主权项】
1. 一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在于：所述提取方法主要 包括以下步骤： a. 将加拿大一枝黄花花粉粉碎，然后采用索氏提取器，以石油醚为溶剂进行回流脱 脂； b. 将经过脱脂处理的加拿大一枝黄花花粉加入到具有一定体积分数的丙酮中，进行超 声提取，采用响应面法设定提取的变量参数； c. 超声提取结束后，进行离心分离，得到含有抗氧化成分的提取液； 上述步骤b中，响应面法设定提取的变量参数通过以下二次多项回归方程： Y1= 2. 845+0. 01452A+0. 1913B-0. 002196C+0. 2873AB+0. 06714AC+0. 3846BC+0.07788A 2-0. 4391B2+0. 1573C2； Y2= 31. 05+1. 160A+1. 309B+2. 684C ； Y3= 0. 806+0. 05475A+0. 0235B+0. 09C-0. 00525AB-0. 08375AC-0. 00075BC+0. 013375A 2 -0. 06562B2-0. 05962C2； 上述式中，响应值Y1为加拿大一枝黄花黄酮的提取率；响应值Y 2为? OH清除率；响应 值丫3为Fe 3+还原能力；且设定提取的变量参数A为丙酮体积分数；B为超声时间；C为液固 比；所述A为30~50%，所述B为50~70min，所述C为10:1~30:1，所述超声处理的温 度为30~50°C。2. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在 于：所述超声提取的次数为1~3次。3. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在 于：上述步骤b超声提取中，丙酮的体积分数A为40~50%，超声时间B为60~69min，液 固比C为20~28:1，超声处理的温度为40 °C。4. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在 于：所述步骤c离心分离中，处理时间为15min，转数为3600r/min。5. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在 于：所述超声提取液中的黄酮含量采用NaNO 2-Al (NO3)3-NaOH法测定。6. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征在 于：所述超声提取液中的? OH清除率采用水杨酸捕获法测定。7. 根据权利要求1所述的一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，其特征 在于，所述超声提取液中的Fe3+还原能力的测定采用铁氰化钾还原法，具体方法如下：向 试管中加入提取液2mL，再分别加入pH6. 6的磷酸缓冲液2. 5mL、1 %铁氰化钾2. 5mL，混匀 后密封50°C水浴20min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2. 5mL，混匀并离心 10min(3600r/min)。取上清液5mL，再依次加入蒸馏水4. OmL和0. 1%三氯化铁溶液1.0 mL， 充分混匀，静置lOmin，以蒸馏水为参比，在700nm波长下测定其吸光度，吸光值高表明还原 力强。
【专利摘要】本发明公开了一种加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法，该方法包括将加拿大一枝黄花花粉粉碎，脱脂处理；经过脱脂处理后，加入丙酮和水的混合溶剂中，进行超声提取，采用响应面法设定提取的变量参数为A、B和C，所述变量参数A为丙酮体积分数，B为超声时间，C为液固比；响应值Y1为加拿大一枝黄花黄酮的提取率；响应值Y2为·OH清除率；响应值Y3为Fe3+还原能力；超声提取结束后，离心分离，得到含有抗氧化成分的提取液。该加拿大一枝黄花抗氧化成分的超声提取方法具有精度和效率高的优点。
【IPC分类】A61P39/06, A61K36/28
【公开号】CN105125611
【申请号】CN201510633113
【发明人】余蕾, 尤嘉, 顾文炎, 王海坤, 毛惠慧
【申请人】嘉兴职业技术学院
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月30日