结合的TNF-a的量成比例，使用微孔板测定仪在450nm处检测。可以停 止颜色显现，并可以测量颜色的强度。在37°C下5%的C02中在EpiLife标准生长培养基 (CascadeBiologies)中培养的亚融合的正常人类成年角质细胞（CascadeBiologies)，可 以用佛波醇 _12-?蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA，10ng/ml，SigmaChemical，#P1585_1MG)和 本说明书中所公开的活性成分中的任一种、成分的组合或具有所述组合的组合物处理6小 时。PMA已经显示导致TNF-α分泌明显的增加，所述TNF-α分泌在处理6小时后达到峰 值。培养之后，可以收集细胞培养基，并使用来自R&DSystems(#DTA00C)的夹心酶联免疫 吸附分析（ELISA)定量TNF-α的分泌量。
[0131] 抗氧化（A0)分析：测量本说明书中所公开的活性成分中的任一种、成分的组合或 具有所述组合的组合物的总的抗氧化能力的体外生物分析。所述分析依赖样品中抗氧化 剂抑制ABTS? (2, 2' -联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐])被正铁肌红蛋白氧化成 ABTS@+的能力。活生物体的抗氧化系统包括酶，例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷 胱甘肽过氧化物酶；高分子，例如白蛋白、血浆铜蓝蛋白和铁蛋白；以及大量小分子，包括 抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素、还原型谷胱甘肽、尿酸和胆红素。内源的和源自食物 的抗氧化剂的总数表示细胞外液的总抗氧化能力。所有不同抗氧化剂的协作提供比单独 的任何单个化合物更强的对抗反应性氧或氮自由基侵袭的保护。因此，总的抗氧化能力与 测量单独组分获得的相比可以给出更相关的生物信息，因为其考虑了血浆和体液中存在的 所有抗氧化剂的累积效应。样品中抗氧化剂预防ABTS氧化的能力与Trolox，一种水溶性 生育酸类似物的进行比较，并以Trolox的摩尔当量进行定量。来自CaymanChemical(Ann Arbor，美国密歇根州）抗氧化能力试剂盒#709001可以用作体外生物分析来测量本说明书 中所公开的活性成分的任一种、成分的组合或具有所述组合的组合物中每一种的总的抗氧 化能力。方案可以根据制造商的建议进行。所述分析依赖样品中的抗氧化剂抑制ABTS? (2, 2' -联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐])被正铁肌红蛋白氧化成ABTS?+。可以 将样品中抗氧化剂预防ABTS氧化的能力与Trolox、即一种水溶性生育酚类似物的进行比 较，并以Trolox的摩尔当量进行定量。
[0132] 蘑菇酪氨酸酶活性分析：在哺乳动物细胞中，酪氨酸酶在来自酪氨酸（和来自多 巴色素聚合）的黑色素生物合成中催化两个步骤。酪氨酸酶位于黑素细胞中，并产生给予 皮肤、毛发和眼睛颜色的黑色素（芳香醌化合物）。纯化的蘑菇酪氨酸酶（Sigma)可以在 存在或不存在本说明书中所公开的活性成分的每一种、成分的任一种组合或具有所述组合 的组合物的条件下利用其底物L-Dopa(Fisher)来培养。色素形成可以通过在490nm的比 色板测定进行评价。蘑菇酪氨酸酶活性的抑制百分比可以通过与未处理的对照物比较进 行计算，以确定试验成分或其组合抑制纯化酶活性的能力。试验成分抑制作用可以与曲酸 (Sigma)的进行比较。
[0133] 环氧合酶（C0X)分析：体外环氧合酶-1和-2 (C0X-1、-2)抑制分析。C0X是一种 展现环氧合酶和过氧化物酶两者活性的双功能酶。环氧合酶活性将花生四烯酸转化为过氧 化氢内过氧化物（前列腺素G2 ;PGG2)，过氧化物酶组分将内过氧化物（前列腺素H2 ;PGH2) 还原为相应的醇，前列腺素、凝血噁烷和环前列腺素的前体。该COX抑制剂筛选分析测量环 氧合酶的过氧化物酶组分。过氧化物酶活性通过监测氧化的Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基-对苯二 胺（TMPD)的出现比色地进行分析。该抑制剂筛选分析包括C0X-1和C0X-2酶两者，以筛选 同工酶特异性抑制剂。比色的C0X(绵羊）抑制剂筛选分析（#760111，CaymanChemical) 可以用于分析本说明书中所公开的活性成分中的每一种、成分的任一种组合或具有所述组 合的组合物对纯化的环氧合酶（C0X-1或C0X-2)活性的影响。根据制造商的指示，纯化的 酶、血红素和试验成分可以在分析缓冲液中混合，并在室温下摇动孵育15分钟。孵育之后， 可以加入花生四烯酸和比色底物开始反应。颜色变化可以通过在590nm的比色板测定进行 评价。C0X-1或C0X-2活性的抑制百分比可以通过与未处理的对照物比较进行计算，以确定 试验成分抑制纯化酶活性的能力。
[0134] 脂肪氧合酶（L0)分析：体外的脂肪氧合酶抑制分析。L0是非血红素的含铁的加 双氧酶，其催化分子氧加成为脂肪酸。亚油酸盐/酯和花生四烯酸盐/酯是植物中和动物 中L0的主要底物。然后，花生四烯酸可以转化为羟基二十三烯（HETE)酸衍生物，其随后 转化为白三烯，有效的炎症介质。该分析通过测量利用花生四烯酸培养的脂肪氧合酶（5_、 12-或15-L0)产生的氢过氧化物提供一种精确的和方便的用于筛选脂肪氧合酶抑制剂的 方法。比色的L0抑制剂筛选试剂盒（#760700,CaymanChemical)可以用于确定本说明书 中所公开的活性成分中的每一种、成分的任一种组合或具有所述组合的组合物抑制酶活性 的能力。纯化的15-脂肪氧合酶和试验成分可以在分析缓冲液中混合，并在室温下摇动孵 育10分钟。孵育之后，可以加入花生四烯酸开始反应，混合物在室温下再培育额外的10分 钟。可以加入比色底物终止催化，颜色变化通过在490nm测定的荧光板进行评价。可以与 未处理的对照相比来计算脂肪氧合酶活性的抑制百分比以确定本说明书中所公开的活性 成分中的每一种、成分的任一种组合或具有所述组合的组合物抑制纯化酶的活性的能力。
[0135]弹性蛋白酶分析：来自MolecularProbes(美国俄勒冈州尤金）的EnzChek?· 弹性蛋白酶分析（试剂盒#E-12056)可以用作用于测量本说明书中所公开的活性成分中的 每一种、成分的任一种组合或具有所述组合的组合物的弹性蛋白酶活性抑制的体外酶抑制 分析。EnzChek试剂盒含有可溶的牛颈韧带弹性蛋白，其可以用染料标记以使共辄荧光可以 淬灭。非荧光的底物可以被弹性蛋白酶或其他蛋白酶消化以产生高荧光的片段。产生的荧 光增强可以用荧光微孔板测定仪进行监测。来自弹性蛋白底物的消化产物在约505nm处具 有吸收最大值，在约515nm处具有荧光发射最大值。当使用EnzChek弹性蛋白酶分析试剂 盒用于弹性蛋白酶抑制剂的筛选时，肽、氯甲基酮可以用作选择性的、共同的弹性蛋白酶抑 制剂。
[0136] 油控制分析：用于测量皮脂腺中皮脂分泌的减少和/或皮脂腺中皮脂产生的减少 的分析可以通过使用本领域普通技术人员已知的标准技术进行分析。在具体的例子中，可 以使用前额。本说明书中所公开的活性成分中的每一种、成分的任一种组合或具有所述组 合的组合物可以每天一次或两次地施用到前额的一部分一段固定的日子（例如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天），而前额的其他部分不用该组合物处理。在一段固 定的日子期满后，皮脂分泌可以通过将细吸墨纸施用到处理过的和未处理的前额皮肤上进 行分析。这是通过首先用湿的和干的布从处理过的和未处理的区域去除所有皮脂完成的。 然后吸墨纸施用到处理过的和未处理的前额区域，可以绕着前额放置橡皮筋以轻轻地将吸 墨纸压到皮肤上。2小时后，吸墨纸可以移去，使其干燥，然后进行透照。越深的吸墨纸对应 于越多的皮脂分泌（或较浅的吸墨纸对应于减少的皮脂分泌。
[0137] 氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺
[0138] 本说明书中所公开和要求保护的所有皮肤活性成分、组合物或方法根据本公开不 需要过度的实验即可制成和实现。尽管本发明的皮肤活性成分、组合物或方法按照具体的 实施方案进行了描述，但是对于本领域技术人员明显的是，可以对所述皮肤活性成分、组合 物或方法以及在本文所描述方法的步骤或步骤的顺序中实施变化，而不脱离本发明的概 念、精神和范围。
[0139]参考f献
[0140] 以下参考文献在一定程度上提供示例性程序或对本文所陈述细节的其他补充细 节，它们通过引用明确地并入本文。
[0141]Cao等，1993〇
[0142] 国际化妆品成分词典和手册，第12版，2008( "CTFA"），第2卷第2399页
[0143] 国际化妆品成分词典和手册，第12版，2008("〇1^")，第1卷第198页，第655页
[0144] 国际化妆品成分词典和手册，第4版，1991 ( "CTFA"），第12页和第80页
【主权项】
1. 一种局部皮肤用组合物，其包含： 胡莫柳酯； 奥克立林； 奥替柳酯； 氧苯酮； 阿伏苯宗； 苯甲酸C12-15烷基酯； 碳酸二辛酯； 甘油； VP/二十烯共聚物； 鲸蜡硬脂醇； 辛基聚甲基硅氧烷； 鲸蜡醇聚醚-20磷酸酯； 二氧化硅；和 丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物。2. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其包含： 1重量％至15重量％的胡莫柳酯； 1重量％至15重量％的奥克立林； 1重量％至15重量％的奥替柳酯； 1重量％至10重量％的氧苯酮； 1重量％至10重量％的阿伏苯宗； 1重量％至10重量％的苯甲酸C12-15烷基酯； 1重量％至10重量％的碳酸二辛酯； 〇. 5重量％至5重量％的甘油； 〇. 5重量％至5重量％的￥?/二十烯共聚物； 0. 5重量％至5重量％的鲸錯硬脂醇； 0. 5重量％至5重量％的辛基聚甲基硅氧烷； 0. 1重量％至5重量％的鲸蜡醇聚醚-20磷酸酯； 0. 1重量％至5重量％的二氧化硅；和 0. 1重量％至5重量％的丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物。3. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其还包含水。4. 权利要求3所述的局部皮肤用组合物，其包含40重量％至70重量％的水。5. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其还包含： 苯氧乙醇； 磷酸二鲸蜡酯； 辛甘醇； 脱氢乙酸钠； 乙酸生育酚酯； 抗坏血酸棕榈酸酯； 三乙醇胺；和EDTA二钠。6. 权利要求5所述的局部皮肤用组合物，其包含： 0. 1重量％至3重量％的苯氧乙醇； 0. 1重量％至3重量％的磷酸二鲸蜡酯； 0. 1重量％至3重量％的辛甘醇； 0. 1重量％至3重量％的脱氢乙酸钠； 0. 01重量％至1重量％的乙酸生育酚酯； 0. 01重量％至1重量％的抗坏血酸棕榈酸酯； 〇. 〇1重量％至1重量％的三乙醇胺；和 0. 01重量％至1重量％的EDTA二钠。7. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其还包含茶树叶提取物。8. 权利要求7所述的局部皮肤用组合物，其包含0. 0001 %至0. 1 %的茶树叶提取物。9. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其还包含仙人果果提取物。10. 权利要求9所述的局部皮肤用组合物，其包含0. 00001 %至0. 1 %的仙人果果提取 物。11. 权利要求1所述的局部皮肤用组合物，其中，所述组合物配制为乳液、润肤露、凝 胶、精华或软膏。12. 权利要求11所述的局部皮肤用组合物，其中，所述组合物配制为润肤露。13. -种用于防止皮肤受到紫外线辐射的方法，其包括对有此需要的皮肤施用权利要 求1所述的局部皮肤用组合物。14. 权利要求13所述的方法，其中将所述局部皮肤用组合物施用到面部皮肤。15. 权利要求13所述的方法，其中将所述局部皮肤用组合物施用到使用者的臂部或手 部的皮肤。
【专利摘要】本文所述的是可用于防止皮肤受到太阳影响的局部皮肤用组合物。局部皮肤用组合物包含化妆品成分，如胡莫柳酯；奥替柳酯；氧苯酮；奥克立林；阿伏苯宗；苯甲酸C12-15烷基酯；碳酸二辛酯；甘油；VP/二十烯共聚物；鲸蜡硬脂醇；辛基聚甲基硅氧烷；鲸蜡醇聚醚-20磷酸酯；二氧化硅；和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物。组合物还可以包含其他化妆品成分，其实例包括成膜剂、防腐剂、乳化剂、调节剂和保湿剂。还公开了使用该局部皮肤用组合物的方法。
【IPC分类】A61K8/35, A61K8/37, A61K8/92, A61Q17/04
【公开号】CN105250157
【申请号】CN201510408977
【发明人】毛利西奥·卡斯特罗
【申请人】玫琳凯有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年7月13日
【公告号】DE202015004866U1, US20160008244