7’-乙基-8’-氯-3-羟基苯并[c]吡啶并[4,3,2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抑制血管生成的应用。更具体地说，本发明涉及7'-乙基-8'-氯-3-羟 基苯并[c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 视网膜病变、风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病的发生与血管生成有密切关系。
[0003] (1)肿瘤新生血管生成是指在肿瘤组织中，血管内皮细胞在相关刺激血管生成信 号的作用下由相对静止转为快速生长，在已存在的血管组织中产生新生血管的过程，是肿 瘤生长的重要前提。肿瘤新生血管的生成满足了肿瘤组织进一步生长代谢的需要，使肿瘤 细胞不断分裂增殖，并成为肿瘤细胞浸润侵袭、远处转移的重要路径。
[0004]Folkman教授于1971年首次提出了肿瘤的生长需要新生血管形成。血管生成抑 制剂是通过抑制促血管生成的生长因子、生长因子受体及下游信号通路等抑制新生血管生 成，从而抑制肿瘤的生长和转移的发生。抗肿瘤新生血管生成治疗已成为恶性肿瘤综合治 疗中的重要方法之一。针对肿瘤新生血管形成或血管生成的治疗手段在癌症治疗中占有重 要地位，贝伐单抗等针对血管内皮生长因子（VEGF)的单克隆抗体生物制剂在临床上已被 广泛运用。
[0005] (2)在视网膜血管性疾病的病理改变过程中，血管内皮生长因子（VEGF)呈高表达 状态；抗VEGF治疗的临床试验证实，治疗可使脉络膜新生血管膜缩小、液体渗漏减少，在新 生血管性年龄相关性黄斑变性、各种病因的脉络膜新生血管膜、糖尿病和静脉阻塞导致的 黄斑水肿、早产儿视网膜病变及新生血管性青光眼的治疗中，抗VEGF治疗显示出一定程度 的有效性。
[0006] (3)血管生成是类风湿性关节炎（RA)早期滑膜病理改变的特征之一，也是产生和 维持RA血管翳的主要因素，新血管生成被认为形成和维持RA血管翳的重要因素，抑制血管 生成的药物可以有效缓解RA的病情。
[0007] (4)动脉粥样硬化引起血管阻塞的同时也涉及到动脉新血管生成。新血管从动脉 外膜的营养血管开始生长并延伸入粥样斑块下内膜层，这些新生毛细血管可以起到促进粥 样斑块生长的作用。因此抑制血管生成的药物对于抗动脉粥硬化治疗有着重要意义。
[0008] 实验已经建立体内外的各类血管生成模型，应用于抗血管生成药物筛选。近年来 新兴的模式生物斑马鱼（Daniorerio)已成为一个较为理想的血管生成模型，并用于抗血 管生成药物的筛选。研究表明，以斑马鱼为材料，成功地构建了新血管生成的药理模型，并 用血管生成抑制药物（Su5416,TNP470)和vEGF进行验证，结果与对哺乳动物的作用效果 一致，用实验证明利用该模型可预测药物对人的作用效果，即以斑马鱼作为血管生成模型 筛选小分子药物是可行的。
[0009] 对于本发明涉及的7'-乙基-8' -氯-3-羟基苯并[C]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖 啶-8-酮在治疗糖尿病引起的视网膜神经损伤、类风湿性关节炎以及抗动脉粥样硬化中的 用途属于首次公开，由于其对于上述疾病的治疗强得意想不到，不存在由其他化合物给出 任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抑制血管生成显然具有显著的进步。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0011] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了7'-乙基-8'-氯-3-羟基 苯并[c]吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮在血管生成抑制药物中的应用，所述化合物的结构 如式⑴所示；
[0012]
[0013] 优选地，所述应用包括治疗糖尿病引起的视网膜神经损伤。
[0014] 优选地，所述应用包括治疗类风湿性关节炎。
[0015] 优选地，所述应用包括治疗动脉粥样硬化。
[0016] 本发明至少包括以下有益效果：通过实验证明，7'-乙基_8'_氯-3-羟基苯并[c] 吡啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮可以有效地降低糖尿病引起的视网膜病变神经损伤，治疗类 风湿性关节炎以及动脉粥样硬化。
[0017] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。
[0019] 需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所 述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0020] 实施例1
[0021] 1.1实验动物
[0022] 选择出生l-3d的标准普通级SD大鼠，由广西中医药大学提供，符合国家医用动物 使用标准，标准号为清洁级。
[0023] 1. 2SD大鼠视网膜神经细胞的原代培养及高糖模型的建立
[0024] 1·2· 1配制以下主要试剂
[0025] 含10%胎牛血清培养液、葡萄糖、5-溴-2'脱氧尿苷、4%多聚甲醛、PBS磷酸盐缓 冲液。
[0026] 1.2. 2多聚赖氨酸处理细胞培养瓶或培养板
[0027] 为促进所培养的视网膜神经细胞的贴壁，于接种前预先用多聚赖氨酸处理细胞培 养瓶或培养板。方法：于实验前一天，25mm2培养瓶加入100μg/ml多聚赖氨酸2. 0ml，均勾 覆盖瓶底，于37°C培养箱内过夜，吸除培养瓶内多聚赖氨酸，PBS洗三遍，放于37°C培养箱 内干燥备用。拟行免疫荧光鉴定的细胞接种于6孔板，培养板中预先放置27_X29mm的盖 玻片，并如上所述方法用多聚赖氨酸提前处理。
[0028] 1.2. 3原代视网膜神经细胞悬液的制备
[0029] 将出生l-3d的SD大鼠浸泡至75%酒精中进行消毒5min，超净工作台内无菌取眼 球，于冰浴PBS(含青霉素100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素）洗3遍，显微镜下自角巩 膜缘后约1_处作环形切口，去除眼前节组织及玻璃体，钝性分离出视网膜神经上皮层，冰 浴PBS漂洗2遍。显微眼科剪将取出的视网膜神经上皮层剪成约1mm2大小的组织块，收集 于离心管内。加入约10倍体积的0. 125%胰蛋白酶，37°C消化10_15min。含10%胎牛血清 的DMEM/F12培养液终止消化，吸管轻轻反复吹打成单细胞悬液后400目不锈钢滤网过滤， 1000以1^11离心51^11，收集细胞沉淀，含1()%胎牛血清的01^1/^12培养液重悬细胞。细胞 计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1X1〇6个/ml。
[0030] 1. 2. 4原代视网膜神经细胞的接种培养
[0031] 细胞悬液制备好后将其接种于事先置有包被了多聚赖氨酸盖玻片的6孔板或者 多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，置于37°C、5%的C02培养箱培养。当培养24h时加入终浓 度为20μg/ml的5-溴-2'脱氧尿苷以抑制非神经细胞的生长，48h时换液，此后每2-3d换 液一次。
[0032] 1.2. 5高糖模型的建立
[0033] 将细胞悬液接种于24孔板中，细胞培养3d时，选择30mmol/L葡萄糖继续培养 48h，观察细胞形态。
[0034] 1. 3实验分组及方法
[0035] ①正常细胞培养组；②高糖损伤组；③7'-乙基_8'_氯-3-羟基苯并[c]吡啶并 [4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮保护组（70μmol/L)。
[0036] 第①组取原代视网膜神经细胞正常培养，第②组取高糖模型的视网膜神经细胞进 行培养，第③组取高糖模型的视网膜神经细胞并加入7'-乙基_8'_氯-3-羟基苯并[c]吡 啶并[4, 3, 2-mn]吖啶-8-酮进行培养，培养时间在24h和48h时进行台盼蓝拒染实验计算 细胞存活率。具体步骤为：首先消化离心收集细胞，根据细胞量用适当的细胞重悬液重悬细 胞，吸取100μ1重悬的细胞至离心管中，加入100μ1台盼蓝染色液，轻轻混匀，染色3min。 吸取少量已染色的细胞，用细胞计数板计数，每个样品至少计数500个细胞。
[0037] 细胞存活率=(细胞总数一蓝色细胞数）/细胞总数X100%。
[0038] 1. 4统计学处理
[0039] 实验数据以Y±s表示，Y代表均值。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。统 计学方法采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，以P〈0. 05为差异具有统计 学意义，P〈0. 01为差异具有显著统计学意义。
[0040] 1. 5实验结果
[0041] 该实验结果（见表1)显示：高糖作用下视网膜神经细胞凋亡率显著升高 (Ρ〈0· 01)，7' -乙基-8' -氯-3-羟基苯并[C]吡啶并[4, 3, 2-mn