Adp核糖基化因子6在防治肠道病毒71型感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠 道A类病毒，是导致手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。目 前，手足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市 暴发手足口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100 万例，死亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、 足、臀部以及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神 经系统（central nervous system, CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以 及神经源性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon Tl, Lewthwaite P, Perera DjCardosa MJjMcMinn PjOoi ΜΗ. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010Nov;10(ll) :778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型（EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特 异高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，这也是导致手足口 病患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K. K. , et al.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin, population dynamics,natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene.J Virol，2010. 84(7) :p. 3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够 检测到EV71基因及抗原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液循环感染CNS需要穿越 血脑屏障，然而病毒如何穿过血脑屏障侵入CNS的机制还不清楚。血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB)是位于循环系统和中枢神经系统之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在 两个部位之间的自由运输，对维持CNS的体内平衡以及保护CNS免受外界病原微生物的侵 袭中起着至关重要的作用[Dyrna F, Hanske S, Krueger M, Bechmann I. The blood-brain barrier. J Neuroimmune Pharmacol. 2013 ;8 (4) : 763-73.]。血脑屏障是由无窗孔的脑微 血管内皮细胞及其间的紧密连接、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个 细胞复合体。在这个细胞复合体中，最主要的物质结构基础是脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)及其紧密连接，其严整性的丢失被认为是病毒 感染致脑组织损伤的一个重要原因。因此，探明EV71感染BMECs的机制并以此寻找新的 抗病毒靶点，对于保护血脑屏障的功能，以及防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重 要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成 对宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此， 作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究 表明，EV71可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71借助 网格蛋白依赖的内吞途径（clathrin-mediated endocytosis)感染人横纹肌肉瘤细胞 (rhabdomyosarcoma, RD)[Yamayoshi, S. , et al. , Scavenger receptor B2is a cellular receptor for enterovirus71· Nat Med,2009. 15(7) :p.798_80L];而感染 Jurkat T 淋巴细胞系则主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-dependent endocytosis) [Lin HY, Yang YT,Yu SL,et al. Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71infection. J Virol. 2013, 87 (16):9064-76·]。目前，关 于EV71感染BMECs的途径及机制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这些宿主 细胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作 用。如金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；网格蛋白（clathrin)主要负 责受体介导的的内吞过程；小窝蛋白家族分子caveolin-1 (CAVl)、caveolin-2 (CAV2)、 caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体；Flotillin分子能够与脂後内蛋白分子相互作 用并内吞入细胞内；ADP核糖基化因子6分子参与调解细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配； GTP酶激活蛋白分子GRAFl在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细 胞介素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增殖（Jason Mercer，Mario Schelhaas，et al. Virus Entry by Endocytosis. Annu Rev Biochem. 2010;79:803-833·)。在这些分子 中，caveolin-1和clathrin被证实分别参与了 EV71感染Jurkat T淋巴细胞和RD细胞的 过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。
[0006] ADP 核糖基化因子 6 (ADP ribosylation factor 6，ARF6)是 Ras 超家族中的一个 小分子GTP结合蛋白，属于ARF亚家族成员，位于细胞质膜和内涵体膜上，主要参与调节质 膜运输和胞内肌动蛋白装配而涉及到多种生理功能（Gillingham AK1, Munro S. The small G proteins of the Arf family and their regulators. Annu Rev Cell Dev Biol.2007 ； 23:579-611.)。近年来研究也发现ARF6分子在病毒的感染过程中发挥着重要的作用， HeikkilE 〇等人发现ARF6分子调节了柯萨奇病毒A9型感染宿主细胞（HeikMM 〇1，Susi P,Tevalu〇t〇 T, Hanna H, Marjoinaki V, Hyypia T1Kiljunen S. Internalization of coxsackievirus A9is mediated by {beta}2-microglobulin, dynamin, and ArfObut not by caveolin-lor clathrin. J Virol. 2010 ;84(7) :3666-81.)。人横纹肌肉瘤 RD 细胞是 EV71的敏感细胞系，然而Khairunnisa等通过基因组文库筛选发现ARF6分子并未影响 EV71 对 RD 细胞的感染（Hussain KM1, Leong KL, Ng MM, Chu JJ. The essential role of clathrin-mediated endocytosis in the infectious entry of human enterovirus 71.J Biol Chem. 2011 ；286 (I):309-21.)〇
[0007] 目前还没有任何关于ARF6分子在EV71感染HBMEC中作用的报道，对于该分子进 行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以为预防与治疗EV71感染 提供新的思路与靶点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。
[0009] 本发明的另一目的在于提供ADP核糖基化因子6(ARF6)分子的新用途，特别是在 抗肠道病毒71型感染中的应用。
[0010] 本发明的第三目的在于提供干扰ARF6分子表达的siRNA。
[0011] 本发明的主要技术方案是：
[0012] 本发明，以人脑微血管内皮细胞（HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调 靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人脑微血管内皮细胞（HBMEC)的 宿主因子，从而保护血脑屏障的功能。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行 筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们 往往也是在病毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。这些分子包括：ADAM金属 蛋白酶（ADAMlO)、ADP 核糖基化因子 6(ARF6)、caveolin-1 (CAVl)、caveolin-2(CAV2)、 caveo I in-3 (CAV3)、网格蛋白轻链A (CLTA)、网格蛋白轻链B (CLTB)、网格蛋白重链（CLTC)、 Flotillin 蛋白 I (FLOTl)、Floti 11 in 蛋白 2 (FL0T2)、GTP 酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素 2受体（IL2RB)、突触结合蛋白I(SYTl)、突触结合蛋白2(SYT2)。通过检索NCBI GeneBank 得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析，选